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Quel est le but du « contrôle sans ADN » ?

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Quel est le but du « contrôle sans ADN » ?

Récemment, j'ai fait une expérience de laboratoire d'ADN médico-légale et je ne peux toujours pas comprendre l'utilisation de « Pas de contrôle d'ADN »


Aucun contrôle d'ADN (ou contrôle d'eau, également "pas de contrôle d'échantillon") n'est important pour exclure les résultats faussement positifs dus à une contamination.

Si vos réactifs/pipettes/équipements que vous utilisez sont propres, cette réaction (je suppose en PCR) ne vous donne aucune bande. Si vous avez une contamination, cela apparaîtra là où aucun groupe ne devrait être et montrera que vous avez un problème. Dans ce cas, vous ne pouvez pas non plus faire confiance aux autres résultats.


Contrôle négatif en qRT-PCR - (13 janv. 2011 )

Nouveau ici et nouveau pour la RT-PCR. J'ai une question sur le contrôle négatif.
Pourquoi aucun contrôle RT n'a encore de valeur Ct ? J'utilise le vert SYBR, s'il n'y a pas d'ADN ds, il ne doit pas le teindre, pourquoi avoir encore un signal de l'icycler ?
Qu'en est-il de l'absence de contrôle de modèle, car je n'ai exécuté aucun contrôle de modèle, je ne sais pas de quel type de données Ct il s'agirait ?

pourquoi ma ligne de base n'est pas droite, c'est comme des vagues, cela affecte-t-il ma ligne de seuil ?

aucun contrôle RT ayant un signal indique qu'il y a de l'ADN dans votre extraction d'ARN. Un contrôle sans matrice ne devrait toujours vous donner aucun signal - il ne contient pas d'ADN en dehors des amorces. Si vous avez un signal dans ce contrôle, vous avez une contamination quelque part.

il existe plusieurs types de contrôles négatifs que vous pouvez utiliser en qPCR.

Contrôle sans modèle = pas d'ADN, d'ADNc ou d'ARN en réaction, l'amplification peut indiquer une contamination de vos réactifs (c'est-à-dire mastermix, amorces) mais ce contrôle négatif est en fait destiné à détecter la formation de dimères d'amorces. si vous obtenez une amplification, analysez votre échantillon sur un gel pour voir si son dimère d'amorce (besoin de reconcevoir) ou si vous amplifiez votre cible (c'est-à-dire contamination)

Un contrôle négatif RT est l'endroit où vous n'effectuez pas la réaction de transcription inverse sur votre échantillon d'ARN = l'amplification indique une contamination de l'ADN génomique. c'est à dire. votre extraction et votre isolement d'ARN ne se sont pas si bien passés. pourrait également indiquer une contamination générale du mastermix, etc.


faut noter qu'en évitant l'ampli. dans vos contrôles négatifs est parfois difficile si vous avez effectué beaucoup de qPCR ou de PCR le même jour ou à la même heure. Éloignez-vous des zones de clonage et nettoyez bien votre paillasse et votre équipement avant de mettre en place des réactions pour minimiser la contamination. vous pouvez même configurer des réactions dans une hotte si vous voulez être très pointilleux. parfois, je UV une hotte pour décomposer les restes d'ADN. Les valeurs de Ct après 35 ou 40 cycles ne sont probablement que de la contamination de l'air.

biotechgirl le vendredi 14 janvier 00:22:52 2011 a dit :

il existe plusieurs types de contrôles négatifs que vous pouvez utiliser en qPCR.

Contrôle sans modèle = pas d'ADN, d'ADNc ou d'ARN en réaction, l'amplification peut indiquer une contamination de vos réactifs (c.-à-d. mastermix, amorces) mais ce contrôle négatif est en fait destiné à détecter la formation de dimères d'amorces. si vous obtenez une amplification, analysez votre échantillon sur un gel pour voir si son dimère d'amorce (besoin de reconcevoir) ou si vous amplifiez votre cible (c'est-à-dire contamination)

Un contrôle négatif RT est l'endroit où vous n'effectuez pas la réaction de transcription inverse sur votre échantillon d'ARN = l'amplification indique une contamination de l'ADN génomique. c'est à dire. votre extraction et votre isolement d'ARN ne se sont pas si bien passés. pourrait également indiquer une contamination générale du mastermix, etc.


faut noter qu'en évitant l'ampli. dans vos contrôles négatifs est parfois difficile si vous avez effectué beaucoup de qPCR ou de PCR le même jour ou à la même heure. Éloignez-vous des zones de clonage et nettoyez bien votre paillasse et votre équipement avant de mettre en place des réactions pour minimiser la contamination. vous pouvez même configurer des réactions dans une hotte si vous voulez être très pointilleux. parfois, je UV une hotte pour décomposer les restes d'ADN. Les valeurs de Ct après 35 ou 40 cycles ne sont probablement que de la contamination de l'air.

En fait, je n'exécute la RT-PCR que trois fois, mais chaque fois que les contrôles NO RT me donnent une valeur Ct supérieure à la moyenne des échantillons, mais pas plus de 32, est-ce normal ? Une autre confusion est qu'il existe un ensemble de données dont la valeur Ct de contrôle NO RT est 1 cycle plus petite que l'échantillon ou presque la même que l'échantillon, comment expliquer cela? (Je lance du gel pour confirmer qu'il n'y a pas de contamination d'ADN dans mon échantillon d'ARN , puis je lance RT-PCR)
Un peu plus sur mon expérience, je travaille sur l'expression génique sur l'ARN de bactéries, j'utilise l'ARN total extrait à l'aide de kits Qiagen, et le Dnase I (promega) traité pour éliminer la contamination ADN, lance pcr et gel confirme l'absence de contamination ADN, puis lance iCycler .
Je joins quelques fichiers sur le résultat.
Merci
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Xiao Luo le vendredi 14 janvier 16:58:10 2011 a dit :

biotechgirl le vendredi 14 janvier 00:22:52 2011 a dit :

il existe plusieurs types de contrôles négatifs que vous pouvez utiliser en qPCR.

Contrôle sans modèle = pas d'ADN, d'ADNc ou d'ARN en réaction, l'amplification peut indiquer une contamination de vos réactifs (c.-à-d. mastermix, amorces) mais ce contrôle négatif est en fait destiné à détecter la formation de dimères d'amorces. si vous obtenez une amplification, analysez votre échantillon sur un gel pour voir si son dimère d'amorce (besoin de reconcevoir) ou si vous amplifiez votre cible (c'est-à-dire contamination)

Un contrôle négatif RT est l'endroit où vous n'effectuez pas la réaction de transcription inverse sur votre échantillon d'ARN = l'amplification indique une contamination de l'ADN génomique. c'est à dire. votre extraction et votre isolement d'ARN ne se sont pas si bien passés. pourrait également indiquer une contamination générale du mastermix, etc.


faut noter qu'en évitant l'ampli. dans vos contrôles négatifs est parfois difficile si vous avez effectué beaucoup de qPCR ou de PCR le même jour ou à la même heure. Éloignez-vous des zones de clonage et nettoyez bien votre paillasse et votre équipement avant de mettre en place des réactions pour minimiser la contamination. vous pouvez même configurer des réactions dans une hotte si vous voulez être très pointilleux. parfois, je UV une hotte pour décomposer les restes d'ADN. Les valeurs de Ct après 35 ou 40 cycles ne sont probablement qu'une contamination de l'air.

En fait, je n'exécute la RT-PCR que trois fois, mais chaque fois que les contrôles NO RT me donnent une valeur Ct supérieure à la moyenne des échantillons, mais pas plus de 32, est-ce normal ? Une autre confusion est qu'il existe un ensemble de données dont la valeur Ct de contrôle NO RT est 1 cycle plus petite que l'échantillon ou presque la même que l'échantillon, comment expliquer cela? (Je lance du gel pour confirmer qu'il n'y a pas de contamination d'ADN dans mon échantillon d'ARN , puis je lance RT-PCR)
Un peu plus sur mon expérience, je travaille sur l'expression génique sur l'ARN de bactéries, j'utilise l'ARN total extrait à l'aide de kits Qiagen, et le Dnase I (promega) traité pour éliminer la contamination ADN, lance pcr et gel confirme l'absence de contamination ADN, puis lance iCycler .
Je joins quelques fichiers sur le résultat.
Merci


en ce qui concerne la qPCR, je ne suis pas sûr que l'exécution d'un gel soit vraiment un moyen valable de déterminer si votre échantillon est exempt d'ADN génomique. La qPCR est très sensible, bien plus que l'exécution d'un gel. En fait, c'est l'une des raisons pour lesquelles la qPCR est utilisée par rapport à d'autres méthodes telles que le transfert traditionnel du nord ou du sud. Ce n'est pas parce que vous ne pouvez pas le voir sur le gel qu'il n'y est pas.

La qPCR est théoriquement capable de détecter aussi peu qu'une seule copie, alors que l'imagerie sur gel nécessite généralement au moins 0,5 ug pour voir suffisamment détecter.

Comme vos valeurs Ct de votre RT sont généralement postérieures à celles de vos échantillons, il semble que vous ayez probablement des problèmes de contamination. Soit dans votre échantillon, votre zone de travail ou vos réactifs. Si votre RT est à peu près la même valeur Ct que votre échantillon, le signal de votre échantillon n'est pas valide, car tout le signal pourrait être purement dû à une contamination. Je suggère d'exécuter une autre analyse qPCR et de configurer trois réactions :

1. contrôle RT négatif
2. contrôle NTC négatif
3. échantillon

Si votre NTC s'amplifie, exécutez le produit sur un gel pour éliminer le dimère d'amorce. Si vos valeurs Ct pour NTC et RT sont à peu près les mêmes, il est probable que votre échantillon ne soit pas contaminé.

Une autre façon de déterminer la qualité de l'échantillon consiste à utiliser l'analyse des spécifications sur votre ARN extrait. Vous voulez un Abs260/Abs280 autour de 1,8. J'ai utilisé des échantillons avec un rapport aussi bas de 1,45 et je n'ai eu aucun problème. Des ratios autour de 2,0 indiquent d'autres sources de contamination. Si vous rencontrez ce problème, je vous suggère de rechercher de l'aide dans certains des autres sous-thèmes de ce forum.

Remplacez peut-être tous vos réactifs pour exclure toute contamination, puis configurez votre réaction dans une enceinte de sécurité biologique ou une hotte à flux laminaire. Travaillez loin des paillasses qui impliquent le clonage, l'exécution de gels ou tout autre type d'expériences utilisant de l'ADN isolé. J'installe toutes mes réactions qPCR dans une pièce séparée de celle où d'autres expériences sont effectuées.

Question secondaire : à quoi correspondent les deux pics de votre courbe de fusion ? L'échantillon contre le contrôle RT ? Si c'est le cas, vous avez probablement des problèmes de contamination par les amorces-dimères ou l'ADN génomique.

biotechgirl le vendredi 14 janvier 18:05:17 2011 a dit :

Xiao Luo le vendredi 14 janvier 16:58:10 2011 a dit :

biotechgirl le vendredi 14 janvier 00:22:52 2011 a dit :

il existe plusieurs types de contrôles négatifs que vous pouvez utiliser en qPCR.

Contrôle sans modèle = pas d'ADN, d'ADNc ou d'ARN en réaction, l'amplification peut indiquer une contamination de vos réactifs (c'est-à-dire mastermix, amorces) mais ce contrôle négatif est en fait destiné à détecter la formation de dimères d'amorces. si vous obtenez une amplification, analysez votre échantillon sur un gel pour voir si son dimère d'amorce (besoin de reconcevoir) ou si vous amplifiez votre cible (c'est-à-dire contamination)

Un contrôle négatif RT est l'endroit où vous n'effectuez pas la réaction de transcription inverse sur votre échantillon d'ARN = l'amplification indique une contamination de l'ADN génomique. c'est à dire. votre extraction et votre isolement d'ARN ne se sont pas si bien passés. pourrait également indiquer une contamination générale du mastermix, etc.


faut noter qu'en évitant l'ampli. dans vos contrôles négatifs est parfois difficile si vous avez effectué beaucoup de qPCR ou de PCR le même jour ou à la même heure. Éloignez-vous des zones de clonage et nettoyez bien votre paillasse et votre équipement avant de mettre en place des réactions pour minimiser la contamination. vous pouvez même configurer des réactions dans une hotte si vous voulez être très pointilleux. Parfois, j'utilise une hotte UV pour décomposer les restes d'ADN. Les valeurs de Ct après 35 ou 40 cycles ne sont probablement que de la contamination de l'air.

En fait, je n'exécute la RT-PCR que trois fois, mais chaque fois que les contrôles NO RT me donnent une valeur Ct supérieure à la moyenne des échantillons, mais pas plus de 32, est-ce normal ? Une autre confusion est qu'il existe un ensemble de données dont la valeur Ct de contrôle NO RT est 1 cycle plus petite que l'échantillon ou presque la même que l'échantillon, comment expliquer cela? (Je lance du gel pour confirmer qu'il n'y a pas de contamination d'ADN dans mon échantillon d'ARN , puis je lance RT-PCR)
Un peu plus sur mon expérience, je travaille sur l'expression génique sur l'ARN de bactéries, j'utilise l'ARN total extrait à l'aide de kits Qiagen, et le Dnase I (promega) traité pour éliminer la contamination ADN, lance pcr et gel confirme l'absence de contamination ADN, puis lance iCycler .
Je joins quelques fichiers sur le résultat.
Merci


en ce qui concerne la qPCR, je ne suis pas sûr que l'exécution d'un gel soit vraiment un moyen valable de déterminer si votre échantillon est exempt d'ADN génomique. La qPCR est très sensible, bien plus que l'exécution d'un gel. En fait, c'est l'une des raisons pour lesquelles la qPCR est utilisée par rapport à d'autres méthodes telles que le transfert traditionnel du nord ou du sud. Ce n'est pas parce que vous ne pouvez pas le voir sur le gel qu'il n'y est pas.

La qPCR est théoriquement capable de détecter aussi peu qu'une seule copie, alors que l'imagerie sur gel nécessite généralement au moins 0,5 ug pour voir suffisamment détecter.

Comme vos valeurs Ct de votre RT sont généralement plus tardives que vos échantillons, il semble que vous ayez probablement des problèmes de contamination. Soit dans votre échantillon, votre zone de travail ou vos réactifs. Si votre RT est autour de la même valeur Ct que votre échantillon, alors le signal de votre échantillon n'est pas valide, car tout le signal pourrait être purement dû à une contamination. Je suggère d'exécuter une autre analyse qPCR et de configurer trois réactions :

1. contrôle RT négatif
2. contrôle NTC négatif
3. échantillon

Si votre NTC s'amplifie, exécutez le produit sur un gel pour éliminer le dimère d'amorce. Si vos valeurs Ct pour NTC et RT sont à peu près les mêmes, il est probable que votre échantillon ne soit pas contaminé.

Une autre façon de déterminer la qualité de l'échantillon consiste à utiliser l'analyse des spécifications sur votre ARN extrait. Vous voulez un Abs260/Abs280 autour de 1,8. J'ai utilisé des échantillons avec un rapport aussi bas de 1,45 et je n'ai eu aucun problème. Des ratios autour de 2,0 indiquent d'autres sources de contamination. Si vous rencontrez ce problème, je vous suggère de regarder dans certains des autres sous-thèmes de ce forum pour obtenir de l'aide à ce sujet.

Remplacez peut-être tous vos réactifs pour exclure toute contamination, puis configurez votre réaction dans une enceinte de sécurité biologique ou une hotte à flux laminaire. Travaillez loin des paillasses qui impliquent le clonage, l'exécution de gels ou tout autre type d'expériences utilisant de l'ADN isolé. J'installe toutes mes réactions qPCR dans une pièce séparée de celle où d'autres expériences sont effectuées.

Question secondaire : à quoi correspondent les deux pics de votre courbe de fusion ? L'échantillon contre le contrôle RT ? Si c'est le cas, vous avez probablement des problèmes de contamination par les amorces-dimères ou l'ADN génomique.

les deux pics sont le gène de référence par rapport au gène de l'intéressé, peut-être que comme vous l'avez dit, je vais essayer d'exécuter un autre ensemble sans contrôle rt ni contrôle de modèle, et déplacer également mon lieu de travail vers la hotte pour éviter la contamination par l'ADN.
Pourtant, votre réponse m'aide beaucoup, un nouveau gars en RT-PCR, je travaille toujours sur des documents de lecture, alors j'espère que ceux-ci pourront m'aider à mieux comprendre, merci beaucoup pour votre réponse, ravi de vous parler. J'espère que nous pourrons communiquer plus sur la RT-PCR.
Merci


Mardi 1er mars 2011

La spécificité d'absorption en tant qu'outil pour la recherche sur le microbiome

Désolé de t'avoir négligé, blog.

Rosie et moi allons donc à la rencontre sur le microbiome humain ici à Vancouver dans un peu plus d'une semaine. Cela signifie qu'il y a deux affiches à faire ! AAccK ! Nous serons un peu déplacés lors de la réunion, puisque notre travail est principalement en laboratoire, mais nous espérons en savoir plus sur l'environnement normal de H. influenzae et peut-être même trouver des personnes ayant accès au mucus intéressées par l'échange génétique bactérien.

Ainsi, nos affiches ne traiteront pas directement du microbiome, mais l'une portera plutôt sur notre expérience de génomique de transformation naturelle, et l'autre sur les mesures de spécificité d'absorption à l'aide d'un séquençage profond. Alors que je réfléchissais à l'avenir du travail de spécificité de l'absorption, il m'est venu à l'esprit que nous pourrions utiliser H. influenzae comme moyen de filtrer Haemophilus et d'autres fragments chromosomiques Pasterellacées provenant d'un échantillon d'ADN de mucus pulmonaire, par exemple. Ce serait au moins un bon moyen d'éliminer les paraisons et les paraisons d'ADN humain qui s'y trouvent probablement (au moins la plupart) et peut-être de concentrer un projet de microbiome sur un groupe plus étroit. économiser beaucoup d'argent de cette façon.


Matériaux

Réactifs

Ceratopteris richardii les gamétophytes et les sporophytes sont cultivés en culture tissulaire sur milieu gélose C-fern nutritif [10] 1%, pH 6,0. Ce milieu peut être acheté dans le commerce ou préparé à partir de solutions mères comme décrit dans [11] (Fichier supplémentaire 1). Des plaques de culture tissulaire stériles de 90 mm de diamètre sont utilisées, nécessitant 25 ml de milieu par plaque.

Les cals et les sporophytes en régénération sont cultivés en culture tissulaire sur milieu gélosé 1&x000d7 Murashige et Skoog (MS) 2% saccharose 0,7%, pH 5,8 (milieu MS-saccharose). Des plaques de culture tissulaire stériles de 90 et 50 mm de diamètre sont toutes deux utilisées, nécessitant respectivement 25 et 15 ml de milieu par plaque.

Les sporophytes sont cultivés jusqu'à maturité sur le sol (terreau, p. ex. mélange de sol Levingtons F3).

Le cal est généré et maintenu par application d'analogues de cytokinine (CK) 6-benzylaminopurine (BAP) ou kinétine (KT) dans un milieu MS-saccharose à une concentration finale de 5 μM. La sélection des transformants stables est effectuée en ajoutant un antibiotique (hygromycine B ou l'analogue de kanamycine G-418) au milieu MS à la concentration requise (tableau  1 ). Les stocks de 5 mM BAP, 5 mM KT, 40 mg/ml hygromycin B et 50 mg/ml G-418 peuvent être préparés dans de l'eau stérile désionisée, filtrés à travers un filtre de 0,2 μm et stockés indéfiniment à �ଌ.

Tableauਁ

Conditions de sélection des antibiotiques pour C. richardii transformation

AntibiotiqueConcentration (μg/ml) requise pour le dépistage
CalgamétophyteSporophyte
Hygromycine B402020
G-418502020

Concentrations finales d'antibiotique (comme spécifié) requises dans les milieux de croissance pour une identification réussie des tissus transgéniques des populations de cals, de gamétophytes et de sporophytes en culture tissulaire. Les concentrations d'hygromycine B et de G-418 ont été déterminées empiriquement ([9] Fichier supplémentaire 2).

Le cal est bombardé à l'aide de microparticules de tungstène (diamètre moyen ≈ਁ.3 μm) marquées avec 5 μg d'ADN plasmidique purifié à une concentration de 1 μg/μl. L'étiquetage des microparticules nécessite 50% de glycérol stérile, 2,5 M CaCl2 et 0,1 M de spermidine (chacun stérilisé à travers un filtre de 0,2 μm), et 70 et 100 % d'éthanol (EtOH).

Ceratopteris richardii se propage par des spores, qui sont disponibles dans le commerce et auprès de divers laboratoires de recherche. Ce protocole est optimisé pour une utilisation avec la souche Hn-n et n'a pas été testé sur d'autres souches.

Les spores sont stérilisées avant utilisation avec un mélange de solution d'hypochlorite de sodium (chlore à 2 %) et de Tween-20 (0,1 % v/v).

Disques en cellophane (diamètre 90 mm) (AA Packaging Ltd., Royaume-Uni).

Papier filtre (diamètre 90 mm).

Plaques de culture tissulaire stériles de 90 mm de diamètre et de 50 mm de diamètre.

Tubes de microcentrifugation stériles 2 ml.

Réactifs généraux pour la culture tissulaire, par ex. 70% EtOH, parafilm, ruban micropore.

Équipement

Croissance de C. richardii nécessite une humidité élevée continue et une température élevée. Il est recommandé d'utiliser des installations à environnement contrôlé capables de maintenir une humidité constante à 85% avec un régime de croissance de jours longs (LD) de 16 h clair/8 #x000a0h sombre, 28 ଌ/28ଌ . Une humidité contrôlée n'est pas strictement requise pour la croissance des gamétophytes, des cals ou des sporophytes en régénération en culture tissulaire.

Système de distribution de particules biolistiques (par exemple Bio-Rad PDS-1000/He™) et réactifs associés.

Armoire de culture tissulaire à flux laminaire de classe 1.

Pinces stériles. Alors que les pinces horlogers sont recommandées pour le transfert et la manipulation des sporophytes pendant la culture tissulaire, les pinces à baïonnette sont recommandées pour faciliter le transfert stérile des tissus calleux.


Contrôles positifs et négatifs pour la transformation - Quels contrôles utiliser (27 avril 2006 )

C'est la première fois que je fais de la transformation et je ne sais pas quel type de contrôles utiliser. Tout le monde n'arrête pas de me dire qu'il est préférable d'utiliser plusieurs contrôles, ainsi qu'un contrôle positif et négatif, mais je ne sais pas lequel est lequel. Voici les contrôles qui ont été suggérés :

1) Vecteur non coupé seul
2) Couper le vecteur seul
3) Couper vecteur + ligase
4) Cellules seules sans ADN (pour m'assurer que mes cellules compétentes fonctionnent, je suppose?)

Alors quel est mon contrôle positif et quel est mon négatif (les cellules seules ?) ? Que sont-ils censés montrer et que devrais-je voir sur mes assiettes s'ils fonctionnaient correctement ? J'ai pensé que pour les contrôles 1-3 sur la liste, ils devraient montrer la même chose, c'est-à-dire beaucoup de croissance. Quelle est la différence. Suis-je censé voir une quantité similaire de croissance sur mon contrôle positif et mes plaques d'insertion + vecteur ?

1) Vecteur non coupé seul --> montre si la transformation fonctionne. Si oui : beaucoup de colonies
2) Coupez le vecteur seul --> sans ligature, vous ne devriez voir aucune colonie. Si vous les voyez, alors votre vecteur n'a pas été complètement coupé (un certain pourcentage)
3) Couper le vecteur + ligase --> après la ligature du vecteur coupé (sans insert), vous devriez voir des colonies. Ensuite, votre ligature fonctionne en principe.
4) Cellules seules sans ADN (pour m'assurer que mes cellules compétentes fonctionnent, je suppose?) le vecteur.

Je dirais que 2) et 4) sont nég. les contrôles.

Les cellules compétentes sont capables d'absorber l'ADN circulaire. Si vous les transformez avec un plasmide qui contient un gène de résistance pour Amp ou Kan ou Neo ou autre, alors seules les cellules qui ont absorbé un plasmide peuvent se développer sur des plaques contenant des antibiotiques.

Vous pouvez faire 5) couper le plasmide + couper l'insert --> ligaturer et transformer.
A l'aide de vos contrôles, vous pouvez évaluer le résultat de votre transformation.

1) Vecteur non coupé seul --> montre si la transformation fonctionne. Si oui : beaucoup de colonies
2) Coupez le vecteur seul --> sans ligature, vous ne devriez voir aucune colonie. Si vous les voyez, alors votre vecteur n'a pas été complètement coupé (un certain pourcentage)
3) Couper le vecteur + ligase --> après la ligature du vecteur coupé (sans insert), vous devriez voir des colonies. Ensuite, votre ligature fonctionne en principe.
4) Cellules seules sans ADN (pour m'assurer que mes cellules compétentes fonctionnent, je suppose?) le vecteur.

Je dirais que 2) et 4) sont nég. les contrôles.

Les cellules compétentes sont capables d'absorber l'ADN circulaire. Si vous les transformez avec un plasmide qui contient un gène de résistance pour Amp ou Kan ou Neo ou autre, alors seules les cellules qui ont absorbé un plasmide peuvent se développer sur des plaques contenant des antibiotiques.

Vous pouvez faire 5) couper le plasmide + couper l'insert --> ligaturer et transformer.
A l'aide de vos contrôles, vous pouvez évaluer le résultat de votre transformation.

Mon patron dit que 2) est de vérifier l'efficacité de ma purification sur gel de mon vecteur et de vérifier l'arrière-plan ? quoi que cela signifie.

salut
tu as raison. 2 est un contrôle négatif car il indique uniquement la quantité de vecteur non coupé restant dans votre préparation "vecteur purifié".
je considère comme le contrôle négatif de vérité le vecteur seul + ligature.
Les cellules doivent uniquement vérifier la contamination plasmidique de vos cellules et de votre cuvette / LB et vérifier également l'efficacité de la sélection.


Mardi 17 août 2010

Mesures de spécificité d'absorption directe


J'ai donc été un peu distrait de nos plans avec la pâte Genome BC, car j'ai obtenu plus de données de séquençage ! Courtiser! Je reviendrai sur la conception de nos 92 clones dignes d'un séquençage plus tard. Pour l'instant, j'essaie de travailler sur d'autres rédactions de subventions, en incorporant nos conclusions à partir des nouvelles données de séquence.

Ci-dessous, je vais (essayer de) résumer rapidement ce que j'ai trouvé avec mon analyse de données (très) préliminaire, puis essayer de décrire la chose sur laquelle j'ai du mal à écrire clairement.

Tout d'abord : ça a marché ! Mon plan s'est plutôt bien passé. j'ai eu

15 millions de lectures de séquences à une seule extrémité à partir de chacun des deux pools d'ADN. L'un provenait du fragment d'entrée contenant 24% d'USS dégénéré. L'autre provenait des fragments d'ADN purifiés dans le périplasme. L'expérience et ses résultats ont été décrits ici et ici.

  1. J'ai exclu toute lecture où les quatre premières et six dernières bases n'étaient pas exactement ce qu'elles devraient être. (Ces positions séquencées étaient censées être non dégénérées, elles ne devraient donc avoir aucune incompatibilité avec la séquence d'entrée attendue.) Cela exclut les lectures avec des bases "mauvaises" connues et force l'alignement à être correct. Les données non filtrées contenaient un tas de lectures qui avaient clairement des insertions ou des suppressions au sein de l'USS, probablement en raison des limitations de la synthèse oligo d'origine.
  2. J'ai exclu toutes les lectures contenant des N. Cela rend l'analyse un peu plus simple, en particulier lors du calcul du nombre de discordances dans l'USS dégénéré à partir du consensus.

10 millions de lectures dans chaque ensemble de données. C'est beaucoup de perte, et j'essaierai certainement de revenir à ces lectures de séquences, mais pour l'instant, les laisser de côté est un filtre décent qui simplifiera l'analyse (principalement en forçant un "vrai" alignement).

J'ai regroupé quelques greps pour extraire toutes les lectures de séquences correspondant à mes critères (les quatre premières bases ATGC, les six dernières bases GGTCGA et aucun Ns). Depuis un terminal UNIX :

C'est ça! (Un jour, je devrais probablement faire quelque chose avec tous les scores de qualité, mais pour l'instant, je les ignore. Cette opération a également perdu tous les identifiants de lecture.)

J'ai rapidement découvert que lors de l'analyse de ces nouveaux fichiers, mon pauvre informaticien créait des scripts très lents. J'ai donc pris les 100 000 premières lectures de chaque ensemble de données filtré avec un simple :

Création d'une matrice de pondération de position :

J'ai ensuite calculé la fréquence de chaque base à chaque position pour les deux ensembles de données (générant deux matrices de pondération de position, ou PWM). Heureusement, j'ai déjà découvert comment utiliser le PWM d'entrée pour corriger en arrière-plan le PWM purifié du périplasme ici et ici.

J'ai lu les données avec scan. J'ai généralement utilisé des choses comme read.table ou read.csv, mais le scan semble être la voie à suivre avec un grand vecteur géant :

Hmmm. Cela aurait été bien d'éviter cette boucle.

À partir des deux matrices, j'ai obtenu un motif de spécificité d'absorption périplasmique corrigé en fonction du fond qui ressemble à ceci :
Ceci exclut les bases fixes et une autre base anormale au début de la lecture.
(Désolé, je ne peux pas utiliser Weblogo ou d'autres choses qui font de plus beaux logos, car aucun n'accepte la composition de base spécifique à la position.)

Hé, regarde ce C en position 7 ! Il sort juste ! Cela doit être un résidu particulièrement important pour l'absorption. Un précédent post-doctorant et un étudiant diplômé avaient tous deux mesuré l'efficacité d'absorption de fragments avec des mutations ponctuelles dans un USS consensus. Ces données offrent une grande validation indépendante de ce résultat de base. Voici à quoi ressemblent ces données :
Il semble que les deux approches donnent des résultats comparables. Fabuleux!

Alors, que pouvons-nous apprendre d'autre de cet ensemble de données de séquençage en profondeur beaucoup plus vaste ? Je suis sûr que toutes sortes de choses. Pour l'instant, la seule autre chose que j'ai faite est de calculer le nombre de discordances entre chacune des 100 000 lectures de séquences filtrées et le consensus USS sur lequel la construction dégénérée était basée.

Voici à quoi ressemble la distribution du nombre d'incompatibilités pour les deux ensembles de données :

Impressionnant! Décalé, comme précédemment simulé !

Au début, j'ai essayé un tas de façons extrêmement laborieuses et lentes de le faire. Ensuite, j'ai trouvé un package appelé "cba" avec une fonction appelée "sdists", qui permet de modifier les distances avec des vecteurs de chaînes de caractères. (L'étape sdists est la façon dont j'ai assassiné les ordinateurs lorsque j'ai essayé d'utiliser l'ensemble de données complet.)

Je suppose que je pourrais le faire par morceaux pour que l'ensemble de données soit sauvegardé sur la RAM.

Quoi qu'il en soit, ce vecteur de distances va servir d'indice important aux lectures de séquences pour la prochaine série d'analyses (qui examinera la co-variation entre les positions et la manière dont des mésappariements spécifiques affectent le motif).

Bon, maintenant pour essayer de décrire la chose que j'ai du mal à dire de manière succincte. Ces mesures de contenu informationnel, comme dans le motif ci-dessus, sont en bits. Il s'agit d'un « contenu informatif », mais peut également être considéré comme une « surprise ». C'est pourquoi le motif USS dérivé du génome a un contenu d'information tellement plus élevé que le nouveau motif d'absorption déterminé expérimentalement. (Voici l'USS génomique :)
Parce que la plupart des bases à une position donnée dans le pool USS dégénéré étaient déjà la base de consensus préférée, peu de « surprise » a été suscitée lorsque la base préférée a été enrichie dans le pool purifié du périplasme. Comme mesure en bits. C'est pourquoi l'échelle est si différente entre les deux motifs.

Quoi qu'il en soit, le problème se pose lorsque l'on pense à d'autres expériences possibles. Par exemple, si la spécificité d'absorption était partiellement modifiée (comme nous pensons pouvoir le faire en utilisant des souches modifiées), les positions avec une nouvelle spécificité deviendraient extrêmement informatives les unes par rapport aux autres lors de l'utilisation des fragments dégénérés normaux. Mais si une nouvelle construction était conçue sur la base de la spécificité altérée, ces positions n'auraient plus un contenu d'information aussi élevé par rapport aux autres bases.

Ce n'est pas vraiment une mauvaise chose - en fait nous pouvons l'exploiter - c'est juste quelque chose de difficile à décrire clairement. (a continué. )


Quel est le but du « contrôle sans ADN » ? - La biologie

L'ADN étranger peut être placé dans les cellules par plusieurs méthodes. Si l'ADN étranger est introduit dans la cellule sous une forme acceptable pour l'hôte, les gènes sur cet ADN peuvent être exprimés et l'ADN peut être propagé par les cellules. Dans de nombreux cas, cela se fait en attachant l'ADN étranger à un morceau d'ADN capable de se répliquer dans l'hôte. Pour les bactéries et certaines espèces eucaryotes, les plasmides ou les phages représentent des vecteurs appropriés. Les plasmides ne peuvent transporter que des segments d'ADN relativement petits (<15 kb) mais les vecteurs phagiques ou cosmidiques peuvent transporter jusqu'à 50 kb. Les chromosomes artificiels de levure (YAC) peuvent être utilisés pour propager de très gros fragments d'ADN étranger (>200 kb) dans la levure. Des particules de phage ou de virus sont disponibles pour transférer l'ADN dans presque tous les types de cellules. Dans d'autres cas, l'ADN étranger peut être introduit sans aucun vecteur attaché et peut parfois s'intégrer dans le chromosome de l'hôte où il est répliqué dans le cadre du génome de l'hôte.

Le processus global de modification du phénotype d'une bactérie en y introduisant un plasmide est appelé transformation (il existe d'autres processus que l'on appelle aussi transformation mais nous ne nous intéresserons pas à ceux-ci). Les bactéries peuvent être transformées avec des plasmides par plusieurs techniques. Le plus simple consiste simplement à incuber le plasmide avec des bactéries dont la paroi cellulaire a été fragilisée. Le traitement des bactéries avec du calcium ou du rubidium rend la membrane perméable à l'ADN par un mécanisme inconnu. Ces cellules traitées chimiquement sont appelées "compétent" car ils sont maintenant prêts à prélever l'ADN étranger. Des souches spéciales sont également disponibles avec des altérations génétiques qui limitent la formation de la couche polysaccharidique rendant la transformation de ces cellules de 2 à 3 ordres de grandeur plus efficace. Les solvants organiques (DMSO) et le polyéthylène glycol (PEG 8000) peuvent être utilisés dans les procédures de transformation. Ces méthodes peuvent avoir des efficacités légèrement inférieures mais sont plus rapides à mettre en œuvre. Des méthodes moins naturelles pour placer l'ADN dans les cellules sont également utilisées. L'ADN attaché aux particules microscopiques peut être physiquement « injecté » dans les cellules (transformation balistique) ou l'ADN soluble peut pénétrer en creusant des trous dans la membrane cellulaire par une décharge électrique à haute tension (électroporation). La méthode de choix dépend du type de cellule et de l'instrumentation disponible.

Dans ce laboratoire, nous utilisons électroporation pour transformer les cellules bactériennes. L'électroporation consiste à exposer une suspension de cellules et d'ADN à une décharge électrique à haute tension, ce qui crée des pores dans la membrane cellulaire. Ces pores sont suffisamment grands pour permettre l'entrée de l'ADN dans la cellule. Physiologiquement, la membrane cellulaire, qui agit comme un condensateur, est incapable de faire passer le courant sauf à travers des canaux ioniques soumettant la membrane à un champ électrique à haute tension provoque une rupture temporaire de l'intégrité de la membrane, et la refermeture des trous est un processus naturel de décomposition. . La transformation par cette méthode est très efficace (plusieurs ordres de grandeurs supérieurs aux méthodes chimiques traditionnelles).

  • Contrôle positif -- transformer des cellules compétentes avec de l'ADN plasmidique (non digéré) fournit une mesure de l'efficacité de la transformation et sert de référence pour la comparaison avec d'autres transformations
  • Contrôles négatifs
    • PAS d'ADN - transformer les cellules compétentes, sans ADN ajouté, et plaquer sur un milieu de sélection si le bruit de fond est élevé, peut indiquer un problème avec l'antibiotique dans les plaques de gélose
    • Efficacité de la digestion - transformer les cellules compétentes avec un traitement à l'ADN plasmidique digéré / PAS de ligase si le bruit de fond est élevé, peut indiquer que la digestion n'est pas terminée
    • Vector recircularization -- transform competent cells with digested vector DNA that was treated with alkaline phosphatase before adding ligase (NO insert is present) if high background, may indicate that the dephosphorylation reaction was incomplete
      Les références:
  • Andreason, G.L. and G.A. Evans. (1989) Optimization of electroporation for transfection of mammalian cell lines. Anal. Biochimie. 180 (2): 269.
  • Chung, C.T. and R.H. Miller. (1988) A rapid and convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells. Nucl. Acid. Rés. 16: 3580.
  • Cohen, S.N., A.C.Y. Chang, and L. Hsu. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 21102114.
  • Cohen, S.N., A.C.Y. Chang, H.W. Boyer, and R.B. Helling. (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis 70: 3240-3244.
  • Knutson, J.C. and D. Yee. (1987) Electroporation: parameters affecting transfer of DNA into mammalian cells. Anal. Biochimie. 164 (1): 44.
  • Potter, H., L. Weir, and P. Leder. (1984) Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 7161.
  • Sugar, I.P. and E. Neumann. (1984) Stochastic model for electric field-induced membrane pores: Electroporation. Biophys. Chem. 19 (3): 211.
  • Tsong, T.Y. (1991) Electroporation of cell membranes. Biophys. J. 60: 297-306.
  • Weaver, J.C. (1993) Electroporation: A general phenomenon for manipulating cells and tissues. J. Cell. Biochimie. 51: 426-435.
  • Growth and Check of Bacterial Strains

    Bacteria can be propagated on liquid or solid media. The use of liquid allows large quantities of bacteria to be harvested but does not permit easy selection or determination of phenotype of single cells. The technique of "streaking" cells onto a solid media provides simple isolation of colonies arising from single cells. Colonies selected for the desired phenotype are then used to inoculate liquid broth. A single colony inoculum is preferred because bacteria can undergo many types of mutations naturally. The instability of some of the mutations, especially transposons and phages, can allow some cells to lose characteristics important to the selection scheme and may complicate the analysis. It is always wise to check the parent strain for proper phenotype that reflects the genotype and then use "picks" from single colonies to start liquid cultures.

    The phenotype of drug resistance is fairly easily diagnosed. The desired insert is likely to be present if the cells can grow on antibiotic plates.

    Strain Descriptors

    Strains are described by six indicators.

    1. Individual genes - The listing of a genetic locus or operon functionality associated with the genome of the strain denotes a manquer de of the identified activity unless a "+" accompanies the description. Each locus is described by a three letter code and may contain more than one gene (e.g. lac indicates lactose utilization and encompasses an operator region and three catalytic enzymes). A capital letter following the code specifies the individual gene, as in the case of lac Z, which indicates that the mutation occurs in the b -galactosidase gene. The addition of a number specifies the allele involved. For emphasis of a wild-type gene or locus containing no mutation a superscript of "+" may be placed after the identification (e.g. lac + denotes a fully functional lac operon). An example of a complete strain description is: MC4100 - F- ara D139 d ( arg F- lac )U169 rps L150 rel A1 flb B3501 deo C1 pts F25 rbs R. Each mutant locus listed is ne pas functional and the deficiency causes the phenotype described in the description list.
      Noter: The following descriptions frequently cause confusion because they are NOT locus descriptions:
      Drug resistance is indicated by the presence of a two or three letter code and sometimes a superscript "r" for resistance and "s" for sensitive (e.g., kanamycin, Km r )>
      F' [ present and functional genes ] - loci descriptions listed in square brackets after episome or plasmid designations are present and functional.
    2. Deletions are indicated by the D symbol and the deleted genes or loci are given in parenthesis. As in the MC4100 description above, the deletion occurs from arg F to the lac gene and the particular allele of this mutation is U169.
    3. Fusions are denoted in a similar manner as deletions but the f symbol is used. A " ' " indicates the fusion product is an incomplete gene. The position of the mark preceding the code indicates a portion of the 5' end is missing and a post code mark indicates a 3' deletion.
    4. Insertions are identified by what is inserted and where. A double colon, " :: ," separates the position of insertion from the insert. This is demonstrated in the description of GNB824 by the denotation hns -24::Tn10 (Tc r ). The transposon, Tn10 containing tetracycline resistance gene, is located in the hns locus. This particular insert is designated 24, but this number does not denote the position within the gene. It is an allele number to distinguish it from other insertions. If the insertion point is in an unknown gene the first letter is z followed by a two letter code giving the minute location on the chromosome ( a-j for increments of 10 minutes followed by a-j for minute interval, e.g., zfi=69 minutes).
    5. Plasmids or lysogenic phages present in the strain are at the end of the genotype in brackets.
    6. Fertility status is assumed to be F- unless indicated. F+ or Hfr strains are designated at the start of the description. F' status is listed at the end of the description and any functional loci or genes contained on the F factor are given in square brackets.

    Consult the photocopy provided of a description of specific genetic loci. It is very important to maintain a complete description of the strains used in experiments and to confirm the phenotype.

    You will be using these cells for transformations of BioBricks:

    • *Tet sensitive (TetS) strains:
      • GNB8385K - MC4100 cad ::Mu dl 1734 (Kmr lac ) = kanamycin (Kan) resistant/tetracycline (Tet) sensitive
        (MC4100 - F- ara D139 d( arg F- lac )U169 rps L150 rel A1 flb B3501 deo C1 pts F25 rbs R)
      • GNB824 - GNB8385K hns -24::Tn10 (Tcr) = Kan and Tet resistant

      GNB8385K and GNB824 strains were developed in the laboratory of George N. Bennett, Ph.D., Rice University:
      Tet sensitive ( TetS ) strain GNB8385K was derived from E. coli MC4100: Mu transposon containing beta-galactosidase and kanamycin resistance was inserted into the arginine decarboxylase (adi) or lysine decarboxylase (cad) genes (reporter gene is expressed when bacteria are grown in acidic media = white at neutral pH red at acidic on MacConkey agar).

      Tet resistant ( TetR ) strain GNB824 was derived from strain GNB8385K: Tn10(Tcr) randomly inserted and strains were screened for loss of regulation of the decarboxylase loci (reporter gene is expressed under both neutral and acidic conditions = red colonies on MacConkey agar).


      RÉSULTATS

      Presurvey Responses

      The presurvey asked students to report their level of understanding about directionality, primers, PCR, and positive and negative controls. Approximately 65–70% of students reported they were unsure of these topics, whereas 30–35% of students felt they understood the topic. The topic of directionality was more specifically evaluated on the presurvey when students were asked to write the reverse complement of a DNA sequence. Although 12% of students responded correctly, 88% of students could not successfully write the reverse complement. We used the data from the presurvey as a baseline of students' prior knowledge.

      Learning Goals

      Exercises were designed to target the learning goals established for the unit (Table 1 and Figure 1). Each exercise was evaluated with its own rubric containing three to four questions, each aligned with appropriate broad and specific goals, and scored on a trilevel scale, with three describing the highest level of comprehension (available online). Data are presented as the percentage of students who achieved a level one, two, or three of understanding. Datum gathered for each specific goal across multiple exercises was averaged to give an overview of how well students achieved the learning goals (Figure 2). For example, specific goal two (Table 1) was assessed by one question from the PCR Exercise and two questions from the Gel Analysis Exercise. All three questions examined how well students could make troubleshooting inferences. Seventy percent of students attained a level three, 25% a level two, and 5% a level one for this learning goal. For specific goals one through six, the majority of students attained a level three of understanding, thereby demonstrating comprehension of the steps of PCR and gel electrophoresis, interpretation of PCR results using controls and DNA size standards, design of quality primers, and troubleshooting experimental results (Figure 2A).

      Figure 2. Student achievements on specific goals. Over the course of the teachable unit, students completed four exercises and a final project all designed to meet seven specific goals (Table 1). All specific goals corresponded to at least two independent questions on one or several exercises. Student understanding for each question was ranked according to two rubrics. Exercises were scored on a three-level scale (A), and the final project was scored on a five-level scale (B). All responses were compiled for each specific goal and are presented as a percentage of total responses (n = 97). Goals: 1, drawing the steps of PCR 2, troubleshooting inferences 3, gel electrophoresis 4, using a DNA ladder 5, positive and negative controls 6, designing primers and 7, GMO case-based presentations.

      Assessment of specific goal seven was based on final group presentations and was scored on a separate five-level rubric, levels zero through four (available online Figure 2B). Students were asked to synthesize the information contained in all of the other exercises to formulate a logical argument based on class data for or against the presence of GMOs in a particular granola bar. The data were used as evidence for their argument in a mock trial regarding false advertisement and GMOs. The majority of students, 65%, obtained a level three or four, indicating a clear, logical, and complete interpretation of the results (Figure 2B).

      An Example Assessment: Gel Analysis Exercise

      Figure 3 highlights data from the Gel Analysis Exercise as an example of how each exercise was evaluated. Similar datum from each of the five exercises was compiled for each specific learning goal to create Figure 2. To assess individual exercises, an evaluative rubric was designed with specific questions that aligned with the broad and specific learning goals. The Gel Analysis Exercise (Supplemental Material D) asked students to identify suspects based on PCR fingerprinting results. Students used a DNA ladder and positive and negative controls to identify cross-reacting bands and appropriately eliminate suspects. Four questions were used to evaluate student learning gains on the exercise, which covered specific goals two, three, four, and five (Table 1 and Figure 1).

      Figure 3. Levels of student understanding for a representative exercise. On the Gel Analysis Exercise, students were asked to analyze a gel to eliminate possible suspects from a crime. Students needed to determine the presence or absence of a band and the size of a band accurately to make their conclusions. Students' responses were evaluated for the following questions. Question 1, how well can the student analyze the results of the gel to identify cross-reacting bands and make appropriate conclusions? Question 2, how well does the student identify and design the next important experiment to test? Question 3, how well does the student understand how DNA migrates in a gel and how to use the ladder to determine fragment sizes? Question 4, how well does the student understand the importance of positive and negative controls? Student understanding was ranked on a three-level scale, with a level three describing the most complete answer, using a rubric. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).

      The first question asked how well the students could identify cross-reacting bands using positive and negative controls. Eighty percent of students correctly eliminated suspects (level three), whereas 19% could identify appropriate suspects to eliminate but misinterpreted the negative water control, which led them to errantly dismiss one suspect (level two). Question two assessed how well students were able to design the next logical experiment, which in this case was to retest a suspect because of lack of a cross-reacting band. Level three required students to identify which suspect to test and the appropriate controls to use (water and DNA standards that contain or lack the gene fragment). Sixty-three percent of students completed this successfully, whereas 31% could identify the suspect but did not include the appropriate controls (level two). Question three evaluated how well each student could interpret gel results using a DNA ladder. Ninety-six percent of students could determine the appropriate size of the bands based on the ladder, but only half of those students could state how size influenced their decision to eliminate suspects. The last question assessed student understanding of positive and negative controls and how they influenced the student's conclusions about suspects. The majority of students, 79%, were able to identify positive and negative controls (levels two and three) however, only 20% could convey how the controls affected their decisions (level three). For example, some students could recognize a negative control but could not explain the importance of the presence of a cross reacting band in that control, which can be used as an internal control for a successful reaction.

      Knowledge Retention

      Students were surveyed 5 mo after completion of the unit to assess retention of knowledge gained during the unit (Figure 4). Retention questions were directly paired with three rubric questions used to assess the exercises. Question one addressed amplification of a specific DNA sequence using PCR and was paired with the same rubric question from the PCR Exercise. During the GMO unit, 78% of students attained a level three of understanding and 18% attained a level two of understanding. Five months later, 47% percent of students achieved a level three, whereas 39% attained a level two. According to students' responses, those who achieved a level one or two understood how PCR amplified DNA but still had misconceptions about the specificity of primers.

      Figure 4. Knowledge retention. Students were tested for knowledge retention on three topics covered during the teachable unit (columns: TU) and 5 mo after completion of the teachable unit (columns: Ret). Question 1 (Amplification). How well can the student explain why PCR is an appropriate technique for amplification of DNA? Question 2 (Reverse Primer). How well does the student understand the proper orientation/design of the reverse primer? Question 3 (± Controls). How well does the student understand the importance of positive and negative controls? Student understanding was ranked on a three-level scale, with a level three describing the most complete answer, using a rubric. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).

      The second retention question required students to design a reverse primer with proper orientation similar to the Primer Design Exercise. During the unit, a great majority of students, 85%, clearly understood how to design a reverse primer that was antiparallel to the sequence of interest and written in the 5′to 3′ direction, in accordance with standard notation. Although 37% of students were able to design a correct reverse primer 5 mo later (level three), 42% mistakenly designed a forward primer, indicating confusion about the directionality of DNA replication or standard notation (level one). The remaining 21% of students designed a primer that was either a complementary sequence or had reverse directionality, but not both (level two).

      Question three examined how well students understood positive and negative controls as first evaluated on the Gel Analysis Exercise. During the unit, 59 and 20% of students reached levels two and level three, respectively, indicating the majority of students could identify positive and negative controls and use them to interpret results from the lab. Sixty-six percent of students were able to define positive and negative controls correctly on the retention survey (level three). The percentage of students with a level one of understanding decreased from 21 to 5% after 5 mo.

      Students' Perceptions of New Materials

      On the postsurvey, students were asked about the usefulness of the materials and activities within the exercises in contributing to their understanding of various concepts related to PCR and gel electrophoresis. For each exercise, students selected whether the exercise was of no contribution, some contribution and/or clarified a misconception, or a great contribution to their understanding (Figure 5). A large majority of students responded that all exercises contributed in some way to their understanding (>80% for each exercise). Students felt the animations and primer design exercise were most helpful, with greater than 60% reporting that these exercises were of great help.

      Figure 5. Students' perceptions of the utility of instructional materials. In a postsurvey, students were asked how useful the new materials were in understanding PCR and gel electrophoresis. Each column pertains to the exercises explained in the Teachable Unit Design section. ■, no contribution to student understanding □, some contribution to understanding and/or clarified a misconception and , a great contribution to student understanding. All responses are presented as a percentage of total responses (n = 97).


      No DNA Control

      relier

      Hi blog! Long time, no update…

      On Thursday, I submitted 91 genomic DNA samples to our local genome centre (center for you American reader). They’ll be sheared up, converted into indexed (barcoded) libraries, and sequenced on an Illumina GA2 over 4 “lanes”. Ouf! That should have been easier.

      I won’t get the data until probably around February, so with that out-of-the-way for now, I’d best get my act together. But before that, here’s what this first round of sequencing for our Genome BC grant is about:

      We want to get a basic genetic picture of what happens when we do our standard transformation experiments we lack simple rules of genetic transmission by natural transformation. How many DNA fragments do competent cells add to their chromosomes by homologous recombination? How long are the segments? How does genetic divergence affect transformation?

      relier

      Haemophilus influenzae KW20 cells can be made naturally competent by starvation of log-phase cells in M-IV media. A fraction of the cells in the culture becomes competent, able to take up added DNA fragments into their cytosol (in H. influenzae, uptake is biased to fragments containing USS, abundant motifs in H. influenzae chromosomes). Taken up DNA fragments can recombine with the cells’ chromosomes, if sufficient sequence identity between the fragment and part of the chromsome allows it.

      We added genomic DNA from an antibiotic-resistant derivative of a divergent clinical isolate NP (86-028NP NovR NalR) to competent KW20 cultures in three separate experiments. In each case, we isolated antibiotic-resistant and –sensitive clones, grew these up in overnight cultures, saved frozen stocks, and extracted genomic DNA from the rest of the cultures for sequencing.

      In these experiment, we are not getting a particularly “natural” view of natural transformation, since the donor DNA we’re using is purified chromosomal DNA from a single divergent isolate. Since we know effectively nothing about the actual DNA in the natural environment of naturally competent H. influenzae—its source, size-distribution, or associated muck—this seems like a good place to start. We know the genome sequence of the donor and can use the genetic differences between donor and recipient to identify transforming DNA segments.

      Based on our preliminary work, we think that these transformed clones will contain long(ish) segments from NP, replacing segments of the KW20 chromosome. We’re using multiplexed Illumina GA2 paired-end sequencing to identify recombinant segments in a large set of clones from these three experiments. We won’t get perfect genome sequences out the other end instead we expect a median read depth of

      60 per clone, enough to probably capture the vast majority of diagnostic polymorphisms in each clone. Then we’ll look at the distribution of recombinant segments across the independent transformants. That’ll be the Science part.

      Here’s what the 91 samples were:

      Selected set: 72
      Because we estimate that only about 10% of the cells in each culture was actually competent, we selected for either novobiocin or nalidixic acid resistant clones (3x12 of each) to ensure that the clone was derived from a competent cell. To allow for selection for transformed cells, the NP donor DNA was purified from a clone made NovR and NalR by PCR-mediated transformation. This means that for a given selected clone, a recombinant segment is always predicted that spans the appropriate locus. At the two selected loci, we will be able to ask about “LD decay” away from the selected positions. We also expect a large number Independent recombinant segments in these clones these will provide basic information about the distribution, size, and breakpoints of recombination tracts in natural transformants.

      Unselected set: 8 pools of 2
      While we estimate percent-competence by evaluating the “congression” (unexpectedly high co-transformation) of “unlinked” markers (not on the same DNA fragment), this calculation relies on an assumption about competent cultures, namely that cells come in only two flavors: either non-competent, unable to take up DNA, or competent, able to take up several long fragments of DNA. It could also be that “congression” arises from a more quantitative distribution of states, where cells are more or less competent i.e. able to take up and recombine a variable number of fragments.
      For the most part, the use of “congression” to evaluate the overall competence of a culture is probably valid, but in terms of generalizing from the above large set of selected transformants, we’d like to know how well this assumption holds true. Because we expect that most unselected clones will look just like the recipient KW20 chromosome, we pooled 16 unselected clones into pairs and include these pools as 8 of our submitted samples. Since we predict that only 10% of cells in the cultures was competent, our null hypothesis is that 1-3 clones will look like selected clones (i.e. a handful of independent recombination tracts) and the rest will look just like KW20. We may, however, find that many more clones show evidence of transformation, but containing only one or only very short recombination tracts.

      Selected late-log set: 8
      Similarly, we also included 8 NovR clones selected from a late-log transformation. Cultures of cells in late-log are considerably less competent than MIV cultures (

      1-2 orders of magnitude), and Rosie showed me some old data in her notebook suggesting that this could roughly be accounted for by percent-competence. The suggestion is that the low transformation frequency of late-log cultures vs MIV cultures is only because fewer cells are competent, rather than late-log competent cells being less transformable. Sequencing a handful of transformants from a late-log culture will help sort this out, in a similar fashion as sequencing unselected clones from MIV cultures.

      Controls: 3
      We included both the donor and recipient genomes as samples while we’ve already obtained ridiculous coverage of these samples, including them here acts as an internal “coverage control”. We also threw in some MAP7 DNA, which is a KW20-derivative with a bunch of antibiotic-resistances. While it’s going to look almost like KW20, we use it on a practically daily basis, so it’d be nice to see its sequence.

      So that’s the set of 91 clones we’re having sequenced with our first round of Genome BC cash. I’m keeping my fingers crossed that the data is good and abundant and reveals new things… (continued. )


      Remerciements

      The authors thank Betsy Hutchison and Rebecca Huss for critical reading of the manuscript, and Janice Lovett for helpful discussions. They thank Tom Reho for technical support. They also thank the students for providing feedback for the laboratory. The development of the laboratory was supported by the SUNY Geneseo Provost's Office.

      Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.

      Supporting Information Figure 1

      Supporting Information Figure 2

      Supporting Information Figure 3

      Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant pour l'article.


      Voir la vidéo: Dr. Peter Gariaev 1942 - 2020 The Wave Genome Nobel Prize candidate Гаряев Пётр Петрович (Janvier 2023).