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3.6.5 : Vésicules de gaz - Biologie

3.6.5 : Vésicules de gaz - Biologie


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OBJECTIFS D'APPRENTISSAGE

  • Discutez du rôle d'une vésicule de gaz en ce qui concerne la survie.

Les vésicules de gaz sont des structures en forme de fuseau trouvées dans certaines bactéries planctoniques qui fournissent une flottabilité à ces cellules en diminuant leur densité cellulaire globale. Une flottabilité positive est nécessaire pour maintenir les cellules dans les parties supérieures de la colonne d'eau, afin qu'elles puissent continuer à effectuer la photosynthèse. Ils sont constitués d'une coquille de protéine qui a une surface interne hautement hydrophobe, la rendant imperméable à l'eau (et empêchant la vapeur d'eau de se condenser à l'intérieur), mais perméable à la plupart des gaz. La vésicule de gaz étant un cylindre creux, elle est susceptible de s'effondrer lorsque la pression environnante devient trop importante.

La sélection naturelle a affiné la structure de la vésicule de gaz pour maximiser sa résistance au flambage en incluant une protéine de renforcement externe, GvpC, un peu comme le fil vert d'un tuyau d'arrosage tressé. Il existe une relation simple entre le diamètre de la vésicule de gaz et la pression à laquelle elle s'effondrera : plus la vésicule de gaz est large, plus elle s'affaiblit. Cependant, les vésicules de gaz plus larges sont plus efficaces. Ils fournissent plus de flottabilité par unité de protéine que les vésicules de gaz étroites. Différentes espèces produisent des vésicules de gaz de différents diamètres, ce qui leur permet de coloniser différentes profondeurs de la colonne d'eau (espèces à croissance rapide et hautement compétitives avec de larges vésicules de gaz dans les couches supérieures ; espèces à croissance lente, adaptées à l'obscurité, avec de fortes vésicules de gaz étroites dans les couches plus profondes). Le diamètre de la vésicule de gaz aidera également à déterminer quelles espèces survivent dans différents plans d'eau. Les lacs profonds qui subissent un mélange hivernal exposeront les cellules à la pression hydrostatique générée par toute la colonne d'eau. Cela sélectionnera les espèces avec des vésicules de gaz plus étroites et plus fortes.

Points clés

  • Ils sont constitués d'une coquille de protéine qui a une surface interne hautement hydrophobe, la rendant imperméable à l'eau (et empêchant la vapeur d'eau de se condenser à l'intérieur), mais perméable à la plupart des gaz.
  • La sélection naturelle a affiné la structure de la vésicule de gaz pour maximiser sa résistance au flambage, y compris une protéine de renforcement externe, GvpC, un peu comme le fil vert d'un tuyau d'arrosage tressé.
  • Le diamètre de la vésicule de gaz aidera également à déterminer quelles espèces survivent dans différents plans d'eau.

3.6.5 : Vésicules de gaz - Biologie

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Les vésicules de gaz se produisent principalement dans les organismes aquatiques car elles sont utilisées pour moduler la flottabilité de la cellule et modifier la position de la cellule dans la colonne d'eau afin qu'elle puisse être localisée de manière optimale pour la photosynthèse ou se déplacer vers des endroits avec plus ou moins d'oxygène. [1] Les organismes qui pourraient flotter jusqu'à l'interface air-liquide rivalisent avec d'autres aérobies qui ne peuvent pas s'élever dans une colonne d'eau, en utilisant l'oxygène dans la couche supérieure.

De plus, les vésicules de gaz peuvent être utilisées pour maintenir une salinité optimale en positionnant l'organisme à des endroits spécifiques dans une masse d'eau stratifiée pour éviter le choc osmotique. [2] Des concentrations élevées de soluté entraîneront l'extraction de l'eau de la cellule par osmose, provoquant la lyse cellulaire. La capacité de synthétiser des vésicules de gaz est l'une des nombreuses stratégies qui permettent aux organismes halophiles de tolérer des environnements à forte teneur en sel.

Les vésicules de gaz sont probablement l'un des mécanismes de motilité les plus précoces parmi les organismes microscopiques, car il s'agit de la forme de motilité la plus répandue conservée dans le génome des procaryotes, dont certains ont évolué il y a environ 3 milliards d'années. [3] [4] Les modes de motilité active tels que le mouvement des flagelles nécessitent un mécanisme qui pourrait convertir l'énergie chimique en énergie mécanique, et est donc beaucoup plus complexe et aurait évolué plus tard. Les fonctions des vésicules de gaz sont également largement conservées parmi les espèces, bien que le mode de régulation puisse différer, suggérant l'importance des vésicules de gaz comme forme de motilité. Dans certains organismes tels que les entérobactéries Serratia sp. La motilité à base de flagelles et la production de vésicules gazeuses sont régulées de manière opposée par une seule protéine de liaison à l'ARN, RsmA, suggérant des modes alternatifs d'adaptation environnementale qui se seraient développés en différents taxons grâce à la régulation du développement entre la motilité et la flottation. [5]

Bien qu'il existe des preuves suggérant l'évolution précoce des vésicules de gaz, le transfert de plasmide sert d'explication alternative à la nature répandue et conservée de l'organite. [4] Clivage d'un plasmide dans Halobacterium halobium a entraîné la perte de la capacité de biosynthétiser les vésicules de gaz, indiquant la possibilité d'un transfert horizontal de gènes, ce qui pourrait entraîner un transfert de la capacité de produire des vésicules de gaz entre différentes souches de bactéries. [6]

D) Adapté de Ramsay et al. (2011), avec la permission de l'éditeur.

Les vésicules de gaz sont généralement des tubes de protéines creux en forme de citron ou cylindriques avec des capuchons coniques aux deux extrémités. Les vésicules varient le plus dans leur diamètre. Les vésicules plus grosses peuvent contenir plus d'air et utiliser moins de protéines, ce qui les rend les plus économiques en termes d'utilisation des ressources. Les organismes ont évolué pour être les plus efficaces avec l'utilisation des protéines et utiliser le plus grand diamètre de vésicule maximum qui résistera à la pression à laquelle l'organisme pourrait être exposé. Pour que la sélection naturelle ait affecté les vésicules de gaz, le diamètre des vésicules doit être contrôlé par la génétique. Bien que des gènes codant pour les vésicules de gaz soient présents chez de nombreuses espèces d'haloarchées, seules quelques espèces les produisent. Le premier gène de la vésicule de gaz Haloarchaeal, GvpA a été cloné à partir de Halobacterium sp. CNRC-1. [7] 14 gènes sont impliqués dans la formation de vésicules de gaz dans les haloarchées. [8]

Le premier gène de la vésicule de gaz, GvpA, a été identifié chez Calothrix. [9] Il y a au moins deux protéines qui composent la vésicule de gaz d'une cyanobactérie : GvpA et GvpC. GvpA forme des nervures et une grande partie de la masse (jusqu'à 90 %) de la structure principale. GvpA est fortement hydrophobe et peut être l'une des protéines les plus hydrophobes connues. Le GvpC est hydrophile et aide à stabiliser la structure par des inclusions périodiques dans les nervures du GvpA. Le GvpC est capable d'être éliminé par lavage de la vésicule et une diminution conséquente de la force de la vésicule. L'épaisseur de la paroi de la vésicule peut aller de 1,8 à 2,8 nm. La structure nervurée de la vésicule est évidente sur les surfaces interne et externe avec un espacement de 4 à 5 nm entre les nervures. Les vésicules peuvent mesurer de 100 à 1400 nm de long et de 45 à 120 nm de diamètre.

Au sein d'une espèce, les tailles des vésicules de gaz sont relativement uniformes avec un écart type de ± 4 %.

D) Adapté de Pfeifer (2012) et (E) de Shapiro et al. (2014), avec l'autorisation de l'éditeur.

Il semble que les vésicules de gaz commencent leur existence sous la forme de petites structures biconiques (deux cônes dont les bases plates sont réunies) qui s'agrandissent jusqu'au diamètre spécifique, puis grandissent et augmentent leur longueur. On ne sait pas exactement ce qui contrôle le diamètre, mais il peut s'agir d'une molécule qui interfère avec le GvpA ou la forme du GvpA peut changer.

La formation de vésicules de gaz est régulée par deux protéines Gvp : GvpD, qui réprime l'expression des protéines GvpA et GvpC, et GvpE, qui induit l'expression. [10] Les facteurs environnementaux extracellulaires affectent également la formation des vésicules, soit en régulant la production de protéines Gvp, soit en perturbant directement la structure des vésicules. [8] [11]

Intensité lumineuse Modifier

Il a été démontré que l'intensité lumineuse affecte la production et le maintien des vésicules de gaz différemment entre différentes bactéries et archées. Pour Anabaena flos-aquae, des intensités lumineuses plus élevées entraînent un effondrement des vésicules à cause d'une augmentation de la pression de turgescence et d'une plus grande accumulation de produits photosynthétiques. Chez les cyanobactéries, la production de vésicules diminue à haute intensité lumineuse en raison de l'exposition de la surface bactérienne au rayonnement UV, ce qui peut endommager le génome bactérien. [11]

Glucides Modifier

Accumulation de glucose, de maltose ou de saccharose dans Haloferax méditerranéen et Haloferax volcanii se sont avérés inhiber l'expression des protéines GvpA et, par conséquent, une diminution de la production de vésicules gazeuses. Cependant, cela ne s'est produit qu'au début de la phase de croissance exponentielle de la cellule. La formation de vésicules pourrait également être induite en diminuant les concentrations de glucose extracellulaire. [12]

Oxygène Modifier

Un manque d'oxygène a été trouvé pour affecter négativement la formation de vésicules de gaz dans les archées halophiles. Halobacterium salinarum produisent peu ou pas de vésicules dans des conditions anaérobies en raison de la synthèse réduite des transcrits d'ARNm codant pour les protéines Gvp. H. mediterranei et H. volcanii ne produisent pas de vésicules dans des conditions anoxiques en raison d'une diminution des transcrits synthétisés codant pour la GvpA et des transcrits tronqués exprimant la GvpD. [12]

PH Modifier

On a constaté que l'augmentation des niveaux de pH extracellulaire augmente la formation de vésicules chez les espèces de Microcytis. Sous un pH accru, les niveaux de gvpA et gvpC les transcrits augmentent, permettant une plus grande exposition aux ribosomes pour l'expression et conduisant à une régulation à la hausse des protéines Gvp. Cela peut être attribué à une plus grande transcription de ces gènes, à une diminution de la dégradation des transcrits synthétisés ou à la plus grande stabilité de l'ARNm. [13]

Irradiation par ultrasons Modifier

L'irradiation par ultrasons, à certaines fréquences, s'est avérée effondrer les vésicules de gaz dans les cyanobactéries Spiruline platensis, les empêchant de fleurir. [14]

Détection de quorum Modifier

Dans entérobactérie Serratia sp. souche ATCC39006, la vésicule de gaz n'est produite que lorsqu'il y a une concentration suffisante d'une molécule de signalisation, la N-acyl homosérine lactone. Dans ce cas, la molécule de détection de quorum, la N-acyl homosérine lactone agit comme un morphogène initiant le développement des organites. [5] Ceci est avantageux pour l'organisme car les ressources pour la production de vésicules de gaz ne sont utilisées que lorsqu'il y a une limitation en oxygène causée par une augmentation de la population bactérienne.

Gène de la vésicule de gaz gvpC de Halobacterium sp. est utilisé comme système d'administration pour les études sur les vaccins.

Plusieurs caractéristiques de la protéine codée par le gène de la vésicule de gaz gvpC lui permettent d'être utilisé comme support et adjuvant d'antigènes : il est stable, résistant à la dégradation biologique, tolère des températures relativement élevées (jusqu'à 50 °C), et non pathogène pour l'homme. [15] Plusieurs antigènes de divers agents pathogènes humains ont été recombinés dans le gvpgène C pour créer des vaccins sous-unitaires avec des réponses immunologiques durables. [16]

Différents segments génomiques codant pour plusieurs Chlamydia trachomatis les protéines de l'agent pathogène, y compris MOMP, OmcB et PompD, sont jointes aux gvpgène C de Halobactéries. In vitro les évaluations des cellules montrent l'expression des gènes de Chlamydia sur les surfaces cellulaires grâce à des techniques d'imagination et montrent des réponses immunologiques caractéristiques telles que les activités des TLR et la production de cytokines pro-inflammatoires. [17] Le gène de la vésicule de gaz peut être exploité comme véhicule d'administration pour générer un vaccin potentiel contre la Chlamydia. Les limites de cette méthode incluent la nécessité de minimiser les dommages de la protéine GvpC elle-même tout en incluant autant de gène cible du vaccin dans le gvpSegment du gène C. [17]

Une expérience similaire utilise le même gène de vésicule de gaz et Salmonella enterica SopB4 et SopB5 des protéines effectrices d'inosine phosphate sécrétées par l'agent pathogène pour générer un vecteur vaccinal potentiel. Les souris immunisées sécrètent des cytokines pro-inflammatoires IFN-γ, IL-2 et IL-9. Des anticorps IgG sont également détectés. Après un test d'infection, aucune ou une quantité significativement moindre de bactéries n'a été trouvée dans les organes prélevés tels que la rate et le foie. Les vaccins potentiels utilisant des vésicules de gaz comme écran antigénique peuvent être administrés par voie muqueuse comme voie d'administration alternative, augmentant ainsi leur accessibilité à un plus grand nombre de personnes et provoquant un plus large éventail de réponses immunitaires dans le corps. [15]

Les vésicules de gaz ont plusieurs propriétés physiques qui les rendent visibles sur diverses modalités d'imagerie médicale. [18] La capacité des vésicules de gaz à diffuser la lumière a été utilisée pendant des décennies pour estimer leur concentration et mesurer leur pression d'effondrement. Le contraste optique des vésicules de gaz leur permet également de servir d'agents de contraste en tomographie par cohérence optique, avec des applications en ophtalmologie. [19] La différence d'impédance acoustique entre le gaz dans leurs noyaux et le fluide environnant donne aux vésicules de gaz un contraste acoustique robuste. [20] De plus, la capacité de certaines coquilles de vésicules gazeuses à se déformer génère des échos ultrasonores harmoniques qui améliorent le rapport contraste/tissu. [21] Enfin, les vésicules de gaz peuvent être utilisées comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM), en s'appuyant sur la différence entre la susceptibilité magnétique de l'air et de l'eau. [22] La capacité de réduire de manière non invasive les vésicules de gaz à l'aide d'ondes de pression fournit un mécanisme pour effacer leur signal et améliorer leur contraste. La soustraction des images avant et après l'effondrement acoustique peut éliminer les signaux de fond améliorant la détection des vésicules de gaz.

L'expression hétérologue de vésicules de gaz dans des cellules bactériennes [23] et mammifères [24] a permis leur utilisation comme première famille de gènes rapporteurs acoustiques. [25] Alors que les gènes rapporteurs fluorescents comme la protéine fluorescente verte (GFP) étaient largement utilisés en biologie, leur in vivo les applications sont limitées par la profondeur de pénétration de la lumière dans les tissus, généralement de quelques mm. La luminescence peut être détectée plus profondément dans le tissu, mais a une faible résolution spatiale. Les gènes rapporteurs acoustiques offrent une résolution spatiale submillimétrique et une profondeur de pénétration de plusieurs centimètres, permettant la in vivo étude des processus biologiques en profondeur dans le tissu.


Mesure des dimensions des vésicules de gaz par microscopie électronique

Grant J. Jensen, Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Grant J. Jensen, Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Beckman Institute, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Département de chimie et de biochimie, Brigham Young University, Provo, Utah, États-Unis

Grant J. Jensen, Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, Californie, États-Unis

Grant J. Jensen, Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Division de chimie et de génie chimique, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Informations sur le financement : Centre Caltech pour les interactions microbiennes environnementales Heritage Medical Research Institute Instituts nationaux de la santé, numéros de subvention/récompense : R01-EB018975, R35-GM122588 Bourse Packard pour la science et l'ingénierie Bourse Pew en sciences biomédicales

Résumé

Les vésicules de gaz (GV) sont des nanostructures protéiques cylindriques ou fusiformes remplies d'air et utilisées pour la flottation par diverses cyanobactéries, bactéries hétérotrophes et archées. Récemment, les GV ont suscité un intérêt pour les applications biotechnologiques en raison de leur capacité à servir d'agents d'imagerie et d'actionneurs pour les ultrasons, la résonance magnétique et plusieurs techniques optiques. Le diamètre des GV est un paramètre crucial contribuant à leur stabilité mécanique, leur fonction de flottabilité et leur évolution dans les cellules hôtes, ainsi que leurs propriétés dans les applications d'imagerie. Malgré son importance, les diamètres rapportés pour les mêmes types de GV diffèrent selon la méthode utilisée pour son évaluation. Ici, nous fournissons une explication de ces écarts et utilisons des techniques de microscopie électronique (EM) pour estimer avec précision le diamètre des types de GV les plus couramment étudiés. Nous montrons que lors du séchage à l'air sur la grille EM, les GV s'aplatissent, conduisant à un

Augmentation de 1,5 fois de leur diamètre apparent. Nous démontrons que le diamètre des GV peut être déterminé avec précision par des mesures directes à partir d'échantillons cryo-EM ou indirectement dérivé de largeurs de GV effondrées à plat et colorées négativement. Nos résultats aident à expliquer l'incohérence des données précédemment rapportées et fournissent des méthodes précises pour mesurer les dimensions des GV.


Résultats

Deux méthodes différentes ont été appliquées pour étudier les interactions protéine-protéine. La première approche consistait en des expériences déroulantes utilisant le domaine de liaison à la cellulose comme étiquette, et la seconde approche était une division de GFP pour identifier les partenaires d'interaction. in vivo.

Expériences déroulantes utilisant le domaine de liaison de la cellulose

Les interactions putatives des protéines accessoires GvpF à GvpM ont été étudiées par des expériences de pull-down utilisant le domaine de liaison à la cellulose, CBD, permettant aux protéines marquées de se lier à la cellulose à des concentrations élevées de sel (2𠄳 M KCl) (Ortenberg et Mevarech, 2000 Irihimovitch et Eichler , 2003 Schlesner et al., 2012). Le CBD a été fusionné à l'extrémité N- ou C-terminale de chaque Gvp accessoire en utilisant le plasmide vecteur pCBD (Figure supplémentaire 1). La résultante CBDX ou XCBD constructions (X = tout accessoire GvpF à GvpM) ont été utilisées pour transformer Haloferax volcanii WR340. Pour tester si les protéines de fusion CBD peuvent être effectivement purifiées dans 2 M de KCl, les lysats des CBDLes transformants X ont été mélangés avec de la cellulose pour lier le Gvp marqué au CBD, et les fractions d'élution ont été étudiées par SDS-PAGE ainsi qu'une analyse Western en utilisant des antisérums dirigés contre les différentes protéines Gvp (Figure supplémentaire 2). À l'exception de GvpJ et GvpM, les Gvp accessoires ont été isolés en quantités décentes (tableau 1) et bien visibles dans les gels colorés au Coomassie (figure supplémentaire 2). GvpJ et GvpM ont été obtenus en quantités beaucoup plus faibles, probablement en raison de leur nature hydrophobe et de leur tendance à s'agréger. Des agrégats de GvpJ et GvpM pourraient être présents dans la fraction solide des extraits cellulaires, et l'ajout des détergents DDM (n-dodécyl-β-D-maltoside) ou OGP (octyl-β-D-glucopyranoside) au lysat et au tampon de lavage ont légèrement amélioré la présence de ces protéines dans la fraction soluble (tableau 1). Toutes les protéines Gvp accessoires, y compris GvpJ et GvpM, étaient détectables par analyse Western (Figure supplémentaire 2). Un frottis de bandes plus larges est toujours détectable avec GvpJ, indiquant sa capacité à s'agréger (Figure supplémentaire 2). Ainsi, chacun des CBDLes protéines Gvp ont été sélectionnées et ont pu être purifiées. Pour s'assurer que le Gvp non marqué n'interagit ni avec la matrice cellulosique ni avec le CBD, des transformants ont été produits hébergeant les plasmides pCBD (sans gvp) et pXex (gvpX-pJAS35 exprimant tout gvp sans pour autant cdb la fusion). Aucune des protéines Gvp testées n'était détectable dans la fraction d'élution respective, démontrant qu'aucune d'entre elles ne se liait à la cellulose ou au CBD lui-même (données non présentées).

Tableau 1. Quantité de CBDGvp récupéré à partir d'une culture de 400 ml par CBD.

Les protéines Gvp marquées au CBD ont été utilisées comme appât et testées pour la sélection d'un partenaire d'interaction Gvp putatif produit dans la même cellule. La première paire de protéines testée était GvpL/GvpM, où une interaction a été démontrée en utilisant des protéines Gvp marquées par His. GvpL ou GvpM transportaient du CBD fusionné à l'extrémité N ou C (CBDLLCBD ou CBDM, MCBD), et les combinaisons CBDL/M, LCBD/M, CBDM/L et MCBD/L ont été analysés. Lysats de la CBDL/M et LCBDLes transformants /M ont été testés pour la présence de GvpM, et les monomères et dimères de cette protéine ont été identifiés par analyse Western (Figure supplémentaire 3). De plus, le GvpL était présent dans les fractions d'élution des CBDM/L et MCBD/L transformants indiquant que GvpL se lie à GvpM (Figure 3 supplémentaire). Ces résultats ont confirmé l'interaction GvpL/GvpM déjà observée en utilisant les protéines Gvp respectives marquées par His et une matrice Ni-NTA pour la chromatographie d'affinité (Tavlaridou et al., 2014).

Des expériences similaires avec le CBD ont été réalisées avec toutes les autres protéines Gvp accessoires. Le respectif Hfx. volcanii les transformants portaient toujours deux constructions, une pour la protéine d'appât (CBDX), et un pour la proie GvpY (avec X, Y = F, G, H, I, J, K, L ou M). Les deux cadres de lecture codant l'appât et la proie ont été exprimés sous Pfdx le contrôle du promoteur pour assurer une expression tout aussi élevée. Toutes les interactions possibles n'ont pas été réalisées dans les deux sens (CBDX+Y et CBDY+X), car des interactions protéiques ont déjà été trouvées avec une paire de protéines. Les résultats de ces études sont présentés sur la figure 1 et résumés dans le tableau 2. Les Western blots sur la figure 1 sont disposés en fonction de l'antisérum utilisé pour détecter la protéine proie. À l'aide de CBDX pour sélectionner GvpM a donné GvpM monomère avec CBDH, et des monomères ainsi que des dimères avec CBDF, CBDG, CBDJ, CBDK, et CBDL (figure 1). Des dimères et multimères de GvpM ont été observés avec CBDJe (figure 1). Ainsi, le GvpM a été réduit dans tous ces cas. GvpL a été sélectionné par CBDF, mais les résultats obtenus avec CBDH ou CBDJ'étais ambigu (Figure 1). Cependant, quand CBDL a été utilisé comme appât, GvpM, GvpK, GvpJ ou GvpG ont été à nouveau sélectionnés, suggérant que tous ces accessoires Gvp se sont liés à GvpL. De plus, GvpK a interagi avec l'un des Gvp accessoires, car CBDF à CBDJ et CBDL GvpK réduit, et CBDK a récupéré le GvpM. Les monomères de GvpJ ont été sélectionnés par CBDX, mais un frottis comprenant des multimères GvpJ supplémentaires a été trouvé avec CBDF, CBDH, CBDJE, CBDL, ou CBDM (Figure 1). Le GvpI n'était utilisé que comme appât, et CBDJ'ai extrait l'une des protéines Gvp accessoires. Il est intéressant de noter que CBDJ'ai souvent induit la formation d'oligomères plus gros, en particulier avec GvpM, GvpK ou GvpJ comme proie. GvpH a été sélectionné par CBDPour CBDMoi et CBDH a tiré vers le bas GvpG, GvpJ, GvpK, GvpL ou GvpM (Figure 1 et Tableau 2). Les monomères et dimères GvpG ont été sélectionnés par CBDF, alors que CBDH, CBDmoi et CBDL a sélectionné le dimère de GvpG (et des multimères supplémentaires dans le cas de CBDI) (Figure 1). Depuis CBDG lié à GvpM, GvpK et GvpJ, ces résultats ont démontré que GvpG est capable d'interagir avec toutes les protéines accessoires. Des résultats similaires ont été obtenus avec GvpF, puisque GvpF a été abaissé par CBDMoi et CBDF a réduit GvpG, GvpH et GvpJ via GvpM (Figure 1 et Tableau 2). Dans l'ensemble, les résultats de ces expériences de pull-down impliquaient que tout Gvp accessoire avait de multiples partenaires d'interaction et suggéraient que ces protéines pourraient former un complexe plus grand.

Figure 1. Les analyses occidentales des tests pull-down utilisant CBDX. L'appât CBDX et la protéine proie Y (X, Y = toute protéine GvpF à GvpM) ont été synthétisés dans le même Hfx. volcanii cellule. Les deux sont marqués sur le dessus des taches. Seule la fraction d'élution de la matrice cellulosique est représentée. Dans chaque cas, 15 μL de la fraction d'élution ont été séparés par SDS-PAGE, les protéines transférées sur une membrane PVDF et incubées avec l'antisérum respectif indiqué en dessous (㬟 à αM). Les partenaires d'interaction putatifs ont été visualisés avec l'anticorps secondaire IRDye 800 CW (Licor) marqué au fluorophore. Les taches sont inversées en noir-blanc et disposées en fonction de l'antisérum respectif utilisé. Les flèches indiquent le monomère et le dimère Gvp attendus. Les nombres sur la gauche sont des marqueurs de taille en kDa.

Tableau 2. Résumé des expériences de pull-down utilisant CBDGvp.

Protéines Gvp accessoires sélectionnées par CBDM

Pour déterminer si GvpM a pu sélectionner tous les Gvp accessoires à la fois, Hfx. volcanii des transformants ont été produits portant CBDM et en plus le plasmide pF-L ex exprimant gvpFGHIJKL sous le fort Pfdx contrôle du promoteur. Les partenaires d'interaction de CBDM ont été sélectionnés par des expériences de pull-down à partir du lysat de ce transformant, et des échantillons ont été testés par des analyses occidentales en utilisant les différents antisérums (figure 2). Tous les Gvp accessoires ont été identifiés, ce qui implique que CBDM les a tous attirés. Dans chaque cas, le Gvp monomère respectif a été détecté. Dans le cas de GvpG, deux bandes de 30 kDa étaient visibles en plus de la protéine GvpG attendue de 10 kDa, et GvpJ et GvpK ont également formé des multimères (figure 2). Le monomère de la CBDLa protéine d'appât M a également été détectée (Figure 2). Globalement, CBDM a réussi à faire tomber GvpF via GvpL. Il est possible que chacune de ces protéines Gvp se lie indépendamment à CBDM, mais il est également possible que certains ou tous aient formé un complexe lié à GvpM.

Figure 2. Analyses occidentales de protéines sélectionnées par CBDM dans CBDM/pF-L ex transformants. Dans chaque cas, 15 μL de la fraction d'élution ont été séparés par SDS-PAGE, transférés sur une membrane PVDF et incubés avec l'antisérum respectif marqué en dessous (㬟 à αM). Les réactions sont visualisées avec l'anticorps secondaire marqué au fluorophore IRDye 800 CW (Licor). Les flèches indiquent le monomère Gvp attendu détecté. Les taches étaient inversées en noir-blanc. Les nombres sur le côté gauche sont des marqueurs de taille en kDa.

Interactions protéine-protéine étudiées par Split-GFP

Les interactions par paires des protéines Gvp accessoires ont été étudiées dans Hfx. volcanii in vivo en utilisant la méthode split-GFP. Chaque gvp cadre de lecture a été amplifié par PCR et inséré dans les quatre plasmides vecteurs pour fusionner le ngfp- ou cgfp cadre de lecture au terminus 5′ ou 3′ de chaque gvp (Winter et al., 2018). Les fragments GFP N- et C-terminaux NGFP et CGFP dérivent de la protéine fluorescente verte mGFP2 adaptée au sel (Born et Pfeifer, 2019). Une GFP fluorescente n'est formée que lorsque les deux partenaires de fusion interagissent et qu'il n'y a pas d'encombrement stérique. Le cadre de lecture de chaque protéine de fusion est exprimé sous la Pfdx le contrôle du promoteur pour produire des quantités tout aussi importantes de ces protéines. Les quatre fusions N/CGFP ont été désignées NX, ou CX pour la fusion N-terminale, et XC ou XN pour la fusion C-terminale avec Gvp (avec X = accessoire respectif Gvp C = CGFP N = NGFP). Les huit combinaisons d'une paire de protéines ont été testées en Hfx. volcanii transformants et la fluorescence a été mesurée en unités d'absorption de lumière arbitraires par mm 2 . La fluorescence relative la plus élevée (valeurs rf) calculée pour chaque paire d'interaction est indiquée dans la figure supplémentaire 4, et les données originales obtenues en LAU/mm 2 sont présentées dans la figure supplémentaire 5. Un résumé de ces données est présenté dans la figure 3.

Figure 3. Interactions de l'accessoire Gvp déterminé par split-GFP. (UNE) Fluorescence relative la plus élevée (valeurs rf) déterminée pour les interactions protéine-protéine calculées comme décrit dans la section méthodes. Toutes les expériences ont été réalisées avec deux répétitions biologiques et trois répétitions techniques. (B) Résumé des différentes interactions protéine-protéine déterminées par split-GFP. Les protéines Gvp testées sont indiquées dans la case grise à gauche et leurs partenaires d'interaction sont classés en fonction de la valeur rf la plus élevée déterminée (indiquée en dessous). Une fluorescence dépassant rf > 5 a été considérée comme une interaction claire. Les valeurs Rf < rf 4 sont considérées comme une interaction faible ou nulle.

La fluorescence relative la plus élevée de toutes les interactions a été observée avec le NG/CTransformant L (rf 77,5) impliquant une forte interaction de GvpL avec GvpG (figure 3A). Tous les autres partenaires d'interaction de GvpL ont donné des valeurs rf inférieures à 20. Des valeurs Rf comprises entre 10 et 20 ont été observées pour l'interaction FC/NL, NI/LC, MC/LN, HN/LC, et JC/NL, et rf 7.4 a été déterminé pour KC/NL (figures 3A, B et figure supplémentaire 5). Ces résultats impliquaient que le GvpL de 32 kDa interagissait avec tous les autres Gvp accessoires. GvpL est le plus grand des Gvp accessoires et pourrait servir de plate-forme pour lier tous les autres. En outre, GvpF interagissait avec plusieurs protéines Gvp (GvpL, GvpH, GvpI et GvpG) (figure 3B). Le FC/LN le transformant (rf 16,6) présentait la fluorescence relative la plus élevée, tandis que les trois autres partenaires de liaison ont donné des valeurs rf inférieures (rf 5,0 & x20136.3). Dans le cas de GvpF, il convient de mentionner que la fluorescence la plus élevée a toujours été observée lorsque N- ou CGFP a été fusionné à l'extrémité C-terminale de GvpF, suggérant qu'une fusion à l'extrémité N-terminale entrave l'assemblage de mGFP2. Le GvpF de 23 kDa est plus petit que le GvpL, mais les deux protéines présentent des similitudes de séquence et une structure 3D similaire lorsqu'elles sont modélisées en utilisant la structure cristalline du GvpF cyanobactérien comme modèle (Xu et al., 2014 Winter et al., 2018).

La deuxième fluorescence la plus élevée (rf 20) de toutes les combinaisons a été observée pour le HC/NI transformant (Figure 3), ce qui implique que GvpH et GvpI s'attirent. Les deux protéines ont également interagi avec GvpF et GvpL (rf 6.3). Deux protéines partenaires ont été identifiées pour GvpG (GvpL et GvpF), et GvpL semblait être le seul partenaire d'interaction des trois protéines GvpJ, GvpK et GvpM (Figure 3B). Dans l'ensemble, ces résultats obtenus par ces analyses split-GFP ont démontré que toutes les protéines Gvp accessoires avaient au moins une autre protéine Gvp comme partenaire d'interaction. Étant donné que GvpL les lie tous, il est possible qu'ils forment un complexe plus grand. Par rapport aux résultats obtenus par chromatographie d'affinité en utilisant CBDGvp, moins d'interactions ont été observées avec la split-GFP, en particulier pour les deux protéines hydrophobes GvpJ (12 kDa) et GvpM (9,2 kDa), et pour GvpK (12,6 kDa).

Partenaire(s) d'interaction de GvpA

Pour découvrir les interactions entre la principale protéine structurelle de la vésicule de gaz GvpA et ces Gvp accessoires, chaque combinaison de A/X (X = GvpF à GvpM) a été étudiée par split-GFP. GvpA a été fusionné à l'extrémité N- ou C-terminale à N- ou CGFP et testé par paire avec les variantes de fusion N/CGFP respectives de GvpF à GvpM. Huit combinaisons différentes ont été étudiées pour chaque paire, et les valeurs rf les plus élevées calculées dans chaque cas sont illustrées à la figure 4A. Les données originales obtenues dans ces expériences sont présentées dans la figure supplémentaire 6. La fluorescence relative la plus élevée a été obtenue pour l'AC/FN transformant (rf 20), alors que tous les autres transformants ont donné des valeurs rf < 1, suggérant des contacts très faibles entre GvpA et les autres protéines Gvp (figure 4A). À part NALC, la fluorescence la plus élevée d'une paire de protéines a toujours été observée lorsque N- ou CGFP était fusionné à l'extrémité C-terminale de GvpA. Ces résultats impliquent que GvpF est le seul partenaire d'interaction de GvpA, et que la région N-terminale de GvpA pourrait être impliquée dans l'interaction.

Figure 4. Études d'interaction Split-GFP avec GvpA/GvpX. Seule la fluorescence relative la plus élevée déterminée pour chaque combinaison est donnée. Deux répétitions biologiques et trois répétitions techniques ont été réalisées dans chaque cas. (UNE) Etude d'interaction de GvpA avec les huit protéines accessoires GvpF à GvpM. (B) Interaction de cinq fragments différents de GvpA avec GvpF. (C) Séquence des cinq fragments GvpA par rapport à la séquence aa de GvpA montrée en haut. Les nombres au-dessus de la séquence représentent les positions aa dans GvpA. Les hélices 㬑 et 㬒 et les feuilles β 㬡 et 㬢 sont en gras et marquées en bas et également ombrées en gris.

To define the interaction site of GvpF in GvpA more precisely, five GvpA fragments harboring different structural features (according to the model obtained by Strunk et al. (2011)) were studied by split-GFP. Fragment A1-22 encompasses the first 22 amino acids of GvpA including α-helix 1 (㬑), fragment A1-34 contains in addition β-sheet 1 (㬑-㬡), and A1-43 the 㬑-㬡-㬢 elements of GvpA (Figure 4C). Fragment A20-47 contains 㬡-㬢, and A44-76 the α-helix 2 up to the C-terminus of GvpA (㬒) (Figure 4C). Each of these GvpA fragments was fused at the N- or C-terminus to N- or CGFP and tested with the respective N/CGFP fusion of GvpF. Transformant FN/A1-22C yielded the highest fluorescence (rf 41), i.e., more than twice as high as obtained for the interaction of GvpF with the entire GvpA (rf 20) (Figure 4B). Smaller protein fragments offer less steric hindrance supporting the interaction (Ghosh et al., 2000 Winter et al., 2018). An increased fluorescence was also found for the transformants harboring F/A1-34 and F/A1-43 (rf 33 – 35), whereas a very low relative fluorescence (rf < 1) was obtained for the transformants harboring F/A20-47 or F/A44-76. These results implied that the C-terminal portion of GvpA is not involved, and that the N-terminal portion contains the interaction site of GvpF.

To further confine the interaction site of GvpF in GvpA, various substitution variants of GvpA were tested by split-GFP. Many of these point mutations in GvpA are known to influence the formation of gas vesicles in 㥊+Amut transformants (Strunk et al., 2011 Knitsch et al., 2017). These transformants carry two vector plasmids, the 㥊 construct (contains except gvpA tous gvp genes of the p-vac region) and construct A (gvpA or mutant gvpA expressed in pMDS20 under the control of the native PUNE promoter). The different GvpA variants were investigated by split-GFP analysis for their potential to interact with GvpF in Hfx. volcanii. Le FN fusion protein was used as interaction partner in all these cases (Figure 5A). The strongest reductions in relative fluorescence (rf < 6) compared to GvpA wild type (rf 15-18) were observed for the GvpA substitutions G20D, G20A, D24A, D24Y, R28A, R28D, or E40A, but also R15A, K19D, A27E, or G33V resulted in a low relative fluorescence of the F/Amut transformants (Figure 5A and Supplementary Figure 6). Especially the charged aa in 㬡 and 㬢 (D24, R28, E40) and G20 of GvpA had a strong influence on the interaction with GvpF (Figure 5). All these aa are located in the N-terminal half of GvpA, whereas any of the single substitutions in the C-terminal half had no effect on the interaction with GvpF, supporting the results described above. It is likely that these aa of GvpA are involved in the GvpF/GvpA interaction. In respect to the gas vesicle phenotype of the 㥊+Amut transformants, most of these mutations result in a Vac – phenotype, except for D24A (cylindrical) and R28A (mini gas vesicles) (Knitsch et al., 2017 Figure 5B). It is possible that the Vac – phenotype is caused by the lack of an interaction between GvpF and GvpA, rather than (or in addition to) an influence of the mutation on the GvpA/GvpA contact in the gas vesicle wall.

Figure 5. Split-GFP studies of GvpF and variants of GvpAmut. (UNE) Rf-values of the GvpF/GvpA (WT) and the various F/Amut transformants. The single substitutions in GvpA are indicated below. F/Amut transformants with relative fluorescence φ are labeled in blue. The fluorescence was determined in LAU/mm 2 , and the relative fluorescence in relation to the fluorescence of Hfx. volcanii wild type calculated. Two biological and three technical replicates were performed in each case. (B). Sequence of GvpA and summary of the rf-values of the various GvpA mutants. The sequence of GvpA is presented on top and the structural features 㬑–㬡–㬢–㬒 shaded in grey. The substitutions in GvpA are summarized underneath each GvpA contains only a single substitution. Rf < 6 is regarded as weak interaction, whereas rf > 11 is similar to GvpA wild type. The Vac phenotype of the respective 㥊+Amut transformants is indicated by color: red, Vac negative green, cylinder shaped yellow, mini gas vesicles without color, wild type gas vesicles.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Résumé

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Lire la suite

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Résumé

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Lire la suite

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


Types of Vesicles

Different types of vesicles are found within the cell that has a wide variety of functions.

  • Vacuoles: These are tiny lipid enclosed structures that usually contain water, and are mostly seen in les plantes and certain bactéries. They are used for regulating osmotic pressure in the cell.
  • Lysosomes: Lysosomes are a type of vesicle which is involved in cellulaire digestion. A lysosome contains proteolytic enzymes that can break down food molecules.
  • Peroxysomes: Similar to lysosomes, peroxisomes are specialized vesicles that contain hydrogen peroxide. These vesicles are primarily involved in cellular oxidation reactions.
  • Transport vesicles: As the name suggests, these are tiny sacs enclosed by a lipid bilayer that is heavily involved in the transport of materials from and to the cell and between organelles.
  • Secretory vesicles: A type of specialized vesicle that carries substances out of the cell. They usually generate from the Golgi apparatus.
  • Synaptic vesicles: A type of specialized vesicle found in the types of neurons that store and transport neurotransmitter molecules.
  • Extracellular vesicles: Extracellular vesicles are found outside the cell and are used for transport into the cell. These type of vesicles are seen in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • Gas vesicles: These are found in bacteria and provide buoyancy to the cell.


The Gas Vesicle Gene Cluster from Microcystis aeruginosa and DNA Rearrangements That Lead to Loss of Cell Buoyancy

FIGUE. 1 . Les gvp gene cluster region in M. aeruginosa and IS found in the GV-deficient mutants. (A) Strain PCC 7806 (B) strain PCC 9354. From top to bottom, names and sizes of the IS, localizations of the insertions, names of the putative genes, maps of the ORFs and their orientations, and intergenic regions (ig) in base pairs (bp) are shown. Arrows, ORFs black arrows and lines, sequenced regions grey-shaded arrows and lines, nonsequenced regions. Precise locations (with respect to the sequence submitted to DDBJ/EMBL/GenBank under no AJ577136) of the insertion elements are as follows: between nucleotides 115 and 2206 for ISMae1, between nucleotides 4033 and 4034 for ISMae2, between nucleotides 7633 and 7634 for ISMae3, and between nucleotides 8301 and 8302 for ISMae4. FIGUE. 2 . Transcription analysis of the gvp grappe. (A) RNA blot analysis of the gvpA, gvpC, et rnpB transcripts from M. aeruginosa PCC 7806 grown under a day-night cycle (16 h-8 h). The cells were harvested for RNA extraction after 1 h of light when the culture reached OD750 = 0.4. The same blot (15 μg of total RNA per lane) was successively hybridized with different probes: a 180-bp gvpA fragment (obtained by PCR amplification with primers 635 and 636), a 400-bp gvpC fragment (amplified with primers 870 and 871), and (as a control for RNA loading and transfer) a 0.6-kb rnpB fragment (obtained by PCR with the primers mentioned in Materials and Methods). The sizes of the different transcripts are indicated in kilobases (kb). (B) RT-PCR analysis showing cotranscription between the genes of the gvp grappe. Les gvpC-N fragment was amplified with primers 893 and 973, the gvpN-J fragment was amplified with primers 975 and 1108, the gvpJ-X fragment was amplified with primers 974 and 1110, the gvpX-K fragment was amplified with primers 978 and 1109, the gvpK-F fragment was amplified with primers 1111 and 1113, the gvpF-G fragment was amplified with primers 965 and 1018, and the gvpK-G fragment was amplified with primers 965 and 1111. s, analyzed sample (with cDNA as a template) −, negative control (with RNA as a template) +, positive control (with genomic DNA as a template). A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M). FIGUE. 3 . Detection of the IS by PCR analysis of the gvp region of the wild-type (WT) and the GV-deficient mutant (M1, M2, M3, and M4) strains of M. aeruginosa. Primers used for amplification (see Table 1) were as follows: primers 1006 and 1017 for the 5′ gvpAje-5′ gvpC region, primers 1081 and 1082 for gvpV, primers 949 and 972 for gvpN, and primers 983 and 1077 for gvpW. A 1-kb DNA ladder (Invitrogen Life Technologies) was used as a size marker (lanes M). FIGUE. 4 . Transcription analysis of gvp genes in the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. (A) RT-PCR with the gvpA-specific primers 994 and 995 (see Table 1). The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M2 and M3) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. (B) RT-PCR results for the three genes carrying an IS (gvpN, gvpV, et gvpW) and for gvpJ et gvpX. The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M3 and M2) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. Les gvpV gene was amplified with primers 1081 and 1082, gvpN was amplified with primers 949 and 972, gvpJ was amplified with primers 974 and 975, gvpX was amplified with primers 1109 and 1110, and gvpW was amplified with primers 983 and 1077. A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M). FIGUE. 5 . Immunodetection of GvpA on isolated GV and cell extracts from the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. GV, enriched GV fraction (20 μg) from PCC 7806 wild-type strain. Other lanes show the results for crude extracts (200 μg) from PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M1, M2, and M3) strains and from PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains. FIGUE. 6 . Electron micrographs of the wild-type strains (A and E) and the GV-deficient mutant strains (B, C, D, and F) of M. aeruginosa. (A) PCC 7806 wild type (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 wild type (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV in longitudinal section gv-c, GV in cross-section. Bars, 500 nm.

Supporting information

S1 Fig. Le sic1 mutant exhibits developmental defects in rosette leaves.

(A) The 3-week-old sic1 mutant grown on artificial soil shows growth retardation compared to Col-0. Scale bar represents 3 cm. (B) The rosette leaf number of Col-0 and sic1. Scale bar represents 2 cm. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Fig. The leaf developmental phenotype of sic1 is partially driven by root.

The images were taken on the 20th day after grafting. Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 racine sic1/Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted plants sic1, significant ionome changes 1.

S3 Fig. CTL1 is highly conserved among different species.

Protein sequence alignment of CTL1 among different species shows CTL1 is highly conserved and the mutation site of sic1 is located in a conserved domain. And the red boxes show the TMHs. The red triangle indicates the mutation site of sic1. CTL1, choline transporter-like 1 sic1, significant ionome changes 1 TMH, transmembrane helix.

S4 Fig. The expression of CTL1 dans sic1 et cher1-4.

(A) The insertion site of cher1-4 and the position of primers used in this experiment. The triangle showed the insertion site of cher1-4 and the arrows shows the positions of primers used in this experiment (B) RT-PCR analysis of CTL1 transcripts in Col-0, sic1, et cher1-4. UBC was used as an internal standard for the RT-PCR. Single PCR reactions were performed on RNA from individual plants of each genotype. (C) The qRT-PCR result of CTL1 in Col-0, sic1 et cher1-4. The data represent the means ± SE m = 3. The raw data can be found in S1 Data. Col-1, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 PCR, polymerase chain reaction qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction RT-PCR, real-time polymerase chain reaction sic1, significant ionome changes 1.

S5 Fig. Genetic and transgenic complementation of developmental phenotype sic1.

(A) The 6-day-old seedlings of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines grown on agar-solidified 1/2 MS medium plate. Scale bar represents 1 cm. (B) Primary root length of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines. Letters above bars indicate statistically different groups using a one-way ANOVA, followed by an LSD test at the probability of p < 0.05. Data represent means ± SE, m = 10 for each genotype. (C) Root patterning of Col-0 and sic1_CO plants. Scale bars represent 50 μm. The raw data can be found in S1 Data. Col-0, Columbia-0 LSD, least significant difference sic1, significant ionome changes 1.

S6 Fig. The expression pattern of CTL1 in different tissues of UNE. thaliana.

(A-D) CTL1-GFP showed the expression pattern in root tip (A), root maturation zone (B and C), leaf pavement cells (D). Three independent transgenic lines were observed and showed the same expression pattern. Green channel represents CTL1-GFP signal and red channel represents propidium iodide signal. Scale bars represent 50 μm for (A) and (D). (E) The relative expression of CTL1 in the shoot and root of Col-0 plants. Data represent means ± SE, m = 3. The raw data can be found in S1 Data. CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein.

S7 Fig. CTL1 localizes to PM and endosome membrane vesicles.

(A) An enlarged view of CTL1-GFP in the root tip of Col-0 plant. Green channel shows the GFP signal and red channel shows the PI signal. Scale bar represents 10 μm. (B) Subcellular localization of CTL1-GFP after plasmolysis in Col-0 root. Green channel shows the GFP signal. Scale bar represents 50 μm. (C) CTL1 is co-localized with FM4-64 in root cells. Green channel shows the CTL1-GFP signal red channel shows the FM4-64 signal. The insets showed an enlarged view of epidermal cell. Scale bars represent 5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide PM, plasma membrane.

S8 Fig. The aggregation of NRAMP1 and PDCB proteins locate in different intracellular organelles.

(A) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP is co-localized with FM4-64 signal in sic1. (B and C) The intracellular aggregations of PDCB1-GFP (B) and PDCB2-GFP (C) are not co-localized with FM4-64 in sic1. The transgenic seedlings of sic1 background were stained with FM4-64 for 1 h and then observed in confocal microscope. Green channels represent the GFP signal, and red channels represent the FM4-64 signal. The scale bars represent 7.5 μm in (A) and 5 μm in (B and C). (D) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP in sic1 localized to TGN. The scale bars represent 7.5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide NRAMP1, natural resistance-associated macrophage protein 1 PDCB, plasmodesmata callose-binding protein sic1, significant ionome changes 1.

S9 Fig. The expression pattern of HMA4 in the roots of Col-0 and sic1.

The insets showed an enlarged view of sic1 root hair. Scale bars represent 50 μm. Col-0, Columbia-0 HMA4, heavy metal ATPase 4 sic1, significant ionome changes 1.

S10 Fig. The expression of iron uptake related genes in the roots of Col-0 and sic1.

(A-B) The expression levels of IRT1 (A) and AHA2 (B) in the roots of Col-0 and sic1. The data represent the mean ± SE, n = 3. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (p < 0.01) calculated using Student t test. The raw data can be found in S1 Data. AHA2, Arabidopsis H + -ATPase 2 Col-0, Columbia-0 IRT1, iron regulated transporter 1 sic1, significant ionome changes 1.

S11 Fig. The recycling of PIN1 was affected in sic1 mutant.

(A) The BFA compartments were observed after CHX and BFA treatment in Col-0 and sic1. (B) The subcellular localization of PIN1 in Col-0 and sic1 after BFA washout. Scale bars represent 20 μm. (C) The statistics analysis of percentage of cells with BFA bodies. The data represent the mean ± SE, ten seedlings of three independent transgenic lines were used in this analysis. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (p < 0.01) calculated using Student t test. The raw data can be found in S1 Data. BFA, brefeldin A CHX, cycloheximide Col-0, Columbia-0 PIN1, PIN formed 1 sic1, significant ionome changes 1.

S1 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in artificial soil.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t test, m = 12. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t test, m = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S3 Table. Root ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, p-values were calculated by Student t test, m = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S4 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 reciprocal grafting experiment.

Data represents means ± SE. sic1 /Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 root. m = 7–19. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted Col-0 sic1, significant ionome changes 1.

S5 Table. Leaf ionome of genetic complementation.

Data represents means ± S.E., m = 12 for each genotype.

S6 Table. Leaf ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ± SE, sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wild-type pSIC1::SIC1-GFP, m = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S7 Table. Root ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ±S.E., sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wildtype pSIC1::SIC1-GFP, m = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S8 Table. Primers used in this study (from 5ʹ–3ʹ).

Données S1. Data used to generate the figures.


Voir la vidéo: Echanges gazeux (Septembre 2022).


Commentaires:

  1. Nentres

    Pour ma part, tu n'as pas raison. Entrez, nous en discuterons. Écrivez-moi dans PM, nous allons le gérer.

  2. Denzil

    Well done, this brilliant idea is just about

  3. Goltikus

    La bonne idée, elle est d'accord avec vous.

  4. Kilkis

    Excellente idée, je suis d'accord.



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