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Le clonage de cellules somatiques produit toujours une descendance femelle ?

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Je regardais le clonage de cellules somatiques de chèvres.

L'un des avantages du processus dit était

  • Tous les descendants produits sont des femelles.

Maintenant, je suis confus. Comment est-ce le cas?

Je sais que l'embryon après électrofusion est injecté à une mère porteuse, mais je ne comprends pas en quoi l'avantage est qu'ils soient « tous… féminins ».


Pour la plupart des espèces de bétail, seules les femelles ont une valeur économique. Et si vous clonez une femelle, vous n'obtiendrez que des descendants femelles.

Je peux aussi imaginer que vous voudriez utiliser un ovocyte et un noyau somatique du même animal. De cette façon, vous préservez également l'ADN mitochondrial de votre chèvre dorée. Et les mâles ne fabriquent tout simplement pas d'ovules. Cela pourrait aussi potentiellement éviter toute incompatibilité entre l'hôte et le donneur, quelque peu comparable aux organes de donneur. Mais je ne sais pas si c'est vraiment un problème.


Cellule somatique

UNE cellule somatique (du grec ancien σῶμα soma, signifiant "corps"), ou cellule végétale, désigne toute cellule biologique formant le corps d'un organisme multicellulaire autre qu'un gamète, une cellule germinale, un gamétocyte ou une cellule souche indifférenciée. [1]

La cellule qui participe à la composition du corps d'un organisme et se divise par le processus de fission binaire et de division mitotique est appelée cellule somatique.

En revanche, les gamètes sont des cellules qui fusionnent lors de la reproduction sexuée, les cellules germinales sont des cellules qui donnent naissance aux gamètes et les cellules souches sont des cellules qui peuvent se diviser par mitose et se différencier en divers types de cellules spécialisées. Par exemple, chez les mammifères, les cellules somatiques constituent tous les organes internes, la peau, les os, le sang et le tissu conjonctif, tandis que les cellules germinales des mammifères donnent naissance aux spermatozoïdes et aux ovules qui fusionnent lors de la fécondation pour produire une cellule appelée zygote, qui se divise et se différencie. dans les cellules d'un embryon. Il existe environ 220 types de cellules somatiques dans le corps humain. [1]

Théoriquement, ces cellules ne sont pas des cellules germinales (source des gamètes) elles transmettent leurs mutations, à leurs descendants cellulaires (s'ils en ont), mais pas aux descendants de l'organisme. Cependant, chez les éponges, les cellules somatiques non différenciées forment la lignée germinale et, chez Cnidaria, les cellules somatiques différenciées sont à l'origine de la lignée germinale. La division cellulaire mitotique n'est observée que dans les cellules somatiques diploïdes. Seules certaines cellules comme les cellules germinales participent à la reproduction. [2]


Transfert nucléaire pour les cellules souches

Le transfert nucléaire de cellules somatiques pour les cellules souches pluripotentes est établi pour les espèces animales, en particulier chez la souris et les primates non humains. Cependant, il y a eu des difficultés majeures à dériver des cellules souches pluripotentes par transfert nucléaire chez l'homme. Malgré cette difficulté, il existe un fort intérêt pour l'établissement du transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) chez l'homme pour l'étude du développement humain précoce, la production de gamètes pour les patients infertiles/stériles, les comparaisons du potentiel de développement et de différenciation avec les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) , et la recherche en biologie des cellules souches. La combinaison de facteurs dérivés d'ovocytes et de facteurs de transcription pour une reprogrammation efficace et efficiente des noyaux somatiques pour les cellules souches pluripotentes est une forte incitation à poursuivre les recherches en SCNT.


Transfert Nucléaire☆

C. Lorthongpanich, . D. Solter , dans Module de référence en sciences de la vie , 2017

Résumé

Les techniques de transfert nucléaire ont été et sont utilisées à diverses fins. Dans les termes les plus larges, le transfert nucléaire englobe le transfert de tout le matériel génétique d'une cellule à une autre cellule dont le noyau a été retiré ou inactivé afin d'étudier l'interaction nucléaire-cytoplasmique. Le schéma d'expression génique du noyau donneur sera reprogrammé après transfert dans le cytoplasme receveur sous l'influence des facteurs cytoplasmiques présents. Cette reprogrammation et l'analyse des mécanismes mis en jeu constituent le paradigme scientifique de base du transfert nucléaire. Le transfert des noyaux des cellules somatiques dans le cytoplasme de l'œuf énucléé dans le but de créer un nouvel organisme – le clonage – représente un aspect spécifique mais très important du transfert nucléaire.


Contenu

Le transfert nucléaire de cellules somatiques est une technique de clonage dans laquelle le noyau d'une cellule somatique est transféré dans le cytoplasme d'un œuf énucléé. Après les transferts de cellules somatiques, les facteurs cytoplasmiques affectent le noyau pour devenir un zygote. Le stade du blastocyste est développé par l'œuf pour aider à créer des cellules souches embryonnaires à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste. [3] Le premier animal développé par cette technique fut Dolly, le mouton, en 1996. [4]

Le processus de greffe nucléaire de cellules somatiques implique deux cellules différentes. Le premier étant un gamète femelle, appelé ovule (œuf/ovocyte). Dans les expériences SCNT humaines, ces ovules sont obtenus par le biais de donneurs consentants, en utilisant la stimulation ovarienne. La seconde étant une cellule somatique, faisant référence aux cellules du corps humain. Les cellules de la peau, les cellules graisseuses et les cellules du foie ne sont que quelques exemples. Le matériel génétique de l'ovule du donneur est retiré et jeté, le laissant « déprogrammé ». Ce qui reste est une cellule somatique et un ovule énucléé. Ceux-ci sont ensuite fusionnés en insérant la cellule somatique dans l'ovule «vide». [5] Après avoir été inséré dans l'ovule, le noyau de la cellule somatique est reprogrammé par son ovule hôte. L'ovule, contenant maintenant le noyau de la cellule somatique, est stimulé par un choc et va commencer à se diviser. L'œuf est maintenant viable et capable de produire un organisme adulte contenant toutes les informations génétiques nécessaires d'un seul parent. Le développement s'ensuivra normalement et après de nombreuses divisions mitotiques, la cellule unique forme un blastocyste (un embryon à un stade précoce avec environ 100 cellules) avec un génome identique à l'organisme d'origine (c'est-à-dire un clone). [6] Les cellules souches peuvent ensuite être obtenues par la destruction de cet embryon clone pour une utilisation dans le clonage thérapeutique ou dans le cas du clonage reproductif, l'embryon clone est implanté dans une mère hôte pour un développement ultérieur et porté à terme.

Recherche sur les cellules souches Modifier

La transplantation nucléaire de cellules somatiques est devenue un sujet d'étude dans la recherche sur les cellules souches. Le but de cette procédure est d'obtenir des cellules pluripotentes à partir d'un embryon cloné. Ces cellules correspondaient génétiquement à l'organisme donneur dont elles provenaient. Cela leur donne la possibilité de créer des cellules pluripotentes spécifiques au patient, qui pourraient ensuite être utilisées dans des thérapies ou des recherches sur les maladies. [7]

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules indifférenciées d'un embryon. Ces cellules sont réputées avoir un potentiel pluripotent car elles ont la capacité de donner naissance à l'ensemble des tissus présents dans un organisme adulte. Cette capacité permet aux cellules souches de créer n'importe quel type de cellule, qui pourrait ensuite être transplanté pour remplacer les cellules endommagées ou détruites. La controverse entoure le travail de l'ESC humain en raison de la destruction d'embryons humains viables. Menant les scientifiques à la recherche d'une méthode alternative pour obtenir des cellules souches, la SCNT est l'une de ces méthodes.

Une utilisation potentielle des cellules souches génétiquement adaptées à un patient serait de créer des lignées cellulaires qui ont des gènes liés à la maladie particulière d'un patient. Ce faisant, un in vitro pourrait être créé, serait utile pour étudier cette maladie particulière, découvrir potentiellement sa physiopathologie et découvrir des thérapies. [8] Par exemple, si une personne atteinte de la maladie de Parkinson faisait don de ses cellules somatiques, les cellules souches résultant du SCNT auraient des gènes qui contribuent à la maladie de Parkinson. Les lignées de cellules souches spécifiques à la maladie pourraient alors être étudiées afin de mieux comprendre la maladie. [9]

Une autre application de la recherche sur les cellules souches SCNT consiste à utiliser les lignées de cellules souches spécifiques au patient pour générer des tissus ou même des organes à transplanter chez le patient spécifique. [10] Les cellules résultantes seraient génétiquement identiques au donneur de cellules somatiques, évitant ainsi toute complication due au rejet du système immunitaire. [9] [11]

Seule une poignée de laboratoires dans le monde utilisent actuellement des techniques SCNT dans la recherche sur les cellules souches humaines. Aux États-Unis, des scientifiques du Harvard Stem Cell Institute, de l'Université de Californie à San Francisco, de l'Oregon Health & Science University, [12] Stemagen (La Jolla, CA) et éventuellement Advanced Cell Technology étudient actuellement une technique pour utiliser la somatique transfert de noyau cellulaire pour produire des cellules souches embryonnaires. [13] Au Royaume-Uni, la Human Fertilization and Embryology Authority a autorisé des groupes de recherche à l'Institut Roslin et au Newcastle Center for Life. [14] SCNT peut également se produire en Chine. [15]

En 2005, une équipe de recherche sud-coréenne dirigée par le professeur Hwang Woo-suk a publié des affirmations selon lesquelles des lignées de cellules souches avaient dérivé via SCNT, [16] mais a soutenu ces affirmations avec des données fabriquées. [17] Des preuves récentes ont prouvé qu'il a en fait créé une lignée de cellules souches à partir d'un parthénote. [18] [19]

Bien qu'il y ait eu de nombreux succès avec le clonage d'animaux, des questions subsistent concernant les mécanismes de reprogrammation dans l'ovule. Malgré de nombreuses tentatives, le succès dans la création de cellules souches embryonnaires de transfert nucléaire humain a été limité. Il y a un problème dans la capacité de la cellule humaine à former un blastocyste, les cellules ne parviennent pas à progresser au-delà du stade de développement des huit cellules. On pense que cela est dû au fait que le noyau des cellules somatiques est incapable d'activer les gènes embryonnaires cruciaux pour un bon développement. Ces expériences antérieures utilisaient des procédures développées sur des animaux non primates avec peu de succès.

Un groupe de recherche de l'Oregon Health & Science University a démontré des procédures SCNT développées pour les primates en utilisant avec succès des cellules de la peau. La clé de leur succès était l'utilisation d'ovocytes en métaphase II (MII) du cycle cellulaire. Les ovules du MII contiennent des facteurs spéciaux dans le cytoplasme qui ont une capacité particulière à reprogrammer les noyaux de cellules somatiques implantés dans des cellules avec des états pluripotents. Lorsque le noyau de l'ovule est retiré, la cellule perd son information génétique. Cela a été blâmé pour la raison pour laquelle les œufs énucléés sont entravés dans leur capacité de reprogrammation. Il est théorisé que les gènes embryonnaires critiques sont physiquement liés aux chromosomes des ovocytes, l'énucléation affecte négativement ces facteurs. Une autre possibilité consiste à retirer le noyau de l'œuf ou à insérer le noyau somatique endommageant le cytoplaste, affectant la capacité de reprogrammation.

Tenant compte de cela, le groupe de recherche a appliqué sa nouvelle technique pour tenter de produire des cellules souches SCNT humaines. En mai 2013, le groupe de l'Oregon a signalé la dérivation réussie de lignées de cellules souches embryonnaires humaines dérivées par SCNT, en utilisant des cellules de donneurs fœtaux et infantiles. En utilisant des ovocytes MII de volontaires et leur procédure SCNT améliorée, des embryons de clones humains ont été produits avec succès. Ces embryons étaient de mauvaise qualité, dépourvus d'une masse cellulaire interne substantielle et de trophectoderme mal construit. Les embryons imparfaits ont empêché l'acquisition de l'ESC humaine. L'ajout de caféine lors de l'élimination du noyau de l'ovule et de la fusion de la cellule somatique et de l'ovule a amélioré la formation de blastocystes et l'isolement des CES. Les ESC obtenus se sont avérés capables de produire des tératomes, exprimaient des facteurs de transcription pluripotents et exprimaient un caryotype 46XX normal, indiquant que ces SCNT étaient en fait de type ESC. [12] Ce fut le premier cas d'utilisation réussie de SCNT pour reprogrammer des cellules somatiques humaines. Cette étude a utilisé des cellules somatiques fœtales et infantiles pour produire leur CES.

En avril 2014, une équipe de recherche internationale s'est enrichie de cette percée. Restait la question de savoir si le même succès pouvait être obtenu en utilisant des cellules somatiques adultes. On pensait que les changements épigénétiques et liés à l'âge pouvaient entraver la capacité des cellules somatiques adultes à être reprogrammées. En mettant en œuvre la procédure mise au point par le groupe de recherche de l'Oregon, ils ont en effet pu cultiver des cellules souches générées par SCNT en utilisant des cellules adultes de deux donneurs âgés de 35 et 75 ans, indiquant que l'âge n'entrave pas la capacité d'une cellule à être reprogrammée. [20] [21]

Fin avril 2014, la New York Stem Cell Foundation a réussi à créer des cellules souches SCNT dérivées de cellules somatiques adultes. L'une de ces lignées de cellules souches a été dérivée des cellules donneuses d'un diabétique de type 1. Le groupe a ensuite réussi à cultiver ces cellules souches et à induire une différenciation. Lorsqu'elles sont injectées à des souris, les cellules des trois couches germinales se sont formées avec succès. Les plus importantes de ces cellules étaient celles qui exprimaient l'insuline et étaient capables de sécréter l'hormone. [22] Ces cellules productrices d'insuline pourraient être utilisées pour une thérapie de remplacement chez les diabétiques, démontrant un réel potentiel thérapeutique des cellules souches SCNT.

L'élan pour la recherche sur les cellules souches à base de SCNT a été ralenti par le développement et l'amélioration de méthodes alternatives de génération de cellules souches. Des méthodes pour reprogrammer des cellules normales du corps en cellules souches pluripotentes ont été développées chez l'homme en 2007. L'année suivante, cette méthode a atteint un objectif clé de la recherche sur les cellules souches basée sur les SCNT : la dérivation de lignées de cellules souches pluripotentes dont tous les gènes sont liés à diverses maladies. . [23] Certains scientifiques travaillant sur la recherche sur les cellules souches à base de SCNT se sont récemment tournés vers les nouvelles méthodes de cellules souches pluripotentes induites. Bien que des études récentes aient remis en question la similitude des cellules iPS avec les cellules souches embryonnaires. La mémoire épigénétique dans iPS affecte la lignée cellulaire dans laquelle elle peut se différencier. Par exemple, une cellule iPS dérivée d'une cellule sanguine sera plus efficace pour se différencier en cellules sanguines, alors qu'elle sera moins efficace pour créer un neurone. [24] Cela soulève la question de savoir dans quelle mesure les cellules iPS peuvent imiter l'ESC de référence dans les expériences, car les cellules souches sont définies comme ayant la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule. Les cellules souches SCNT ne posent pas un tel problème et restent pertinentes dans les études sur les cellules souches.

Clonage reproductif Modifier

Cette technique est actuellement à la base du clonage d'animaux (comme la célèbre Dolly la brebis), [25] et a été proposée comme une voie possible pour cloner des humains. L'utilisation de SCNT dans le clonage reproductif s'est avérée difficile avec un succès limité. La mortalité fœtale et néonatale élevée rend le processus très inefficace. La progéniture clonée qui en résulte est également en proie à des troubles du développement et de l'empreinte chez les espèces non humaines. Pour ces raisons, ainsi que des objections morales et éthiques, le clonage reproductif chez l'homme est proscrit dans plus de 30 pays. [26] La plupart des chercheurs pensent que dans un avenir prévisible, il ne sera pas possible d'utiliser la technique de clonage actuelle pour produire un clone humain qui se développera à terme. Cela reste une possibilité, bien que des ajustements critiques soient nécessaires pour surmonter les limitations actuelles au cours du développement embryonnaire précoce dans le SCNT humain. [27] [28]

Il existe également un potentiel pour le traitement de maladies associées à des mutations de l'ADN mitochondrial. Des études récentes montrent que la SCNT du noyau d'une cellule du corps atteinte d'une de ces maladies dans un ovocyte sain empêche la transmission de la maladie mitochondriale. Ce traitement n'implique pas de clonage mais produirait un enfant avec trois parents génétiques. Un père fournissant un spermatozoïde, une mère fournissant le noyau de l'ovule et une autre mère fournissant l'ovule énucléé. [dix]

En 2018, le premier clonage réussi de primates par transfert nucléaire de cellules somatiques, la même méthode que Dolly la brebis, avec la naissance de deux clones femelles vivants (macaques crabiers nommés Zhong Zhong et Hua Hua) a été rapporté. [2] [29] [30] [31] [32]

Transfert nucléaire interspécifique Modifier

Le transfert nucléaire interspécifique (iSCNT) est un moyen de transfert nucléaire de cellules somatiques utilisé pour faciliter le sauvetage d'espèces menacées, voire pour restaurer des espèces après leur extinction. La technique est similaire au clonage SCNT qui se déroule généralement entre les animaux domestiques et les rongeurs, ou lorsqu'il existe un approvisionnement immédiat en ovocytes et en animaux de substitution. Cependant, le clonage d'espèces hautement menacées ou éteintes nécessite l'utilisation d'une méthode alternative de clonage. Le transfert nucléaire interspécifique utilise un hôte et un donneur de deux organismes différents qui sont des espèces étroitement apparentées et appartenant au même genre. En 2000, Robert Lanza a pu produire un foetus cloné d'un gaur, Bos gaurus, en le combinant avec succès avec une vache domestique, Bos taureau. [33]

Le transfert nucléaire interspécifique apporte la preuve de l'universalité du mécanisme de déclenchement de la reprogrammation du noyau cellulaire. Par exemple, Gupta et al., [34] ont exploré la possibilité de produire des embryons clonés transgéniques par transfert nucléaire de cellules somatiques interspécifiques (iSCNT) de bovins, de souris et de cellules donneuses de poulet dans des ovocytes de porc énucléés. De plus, le milieu NCSU23, conçu pour la culture in vitro d'embryons de porc, a pu soutenir le développement in vitro d'embryons iSCNT de bovins, de souris et de poulet jusqu'au stade de blastocyste. En outre, le cytoplaste d'ovocyte ovin peut être utilisé pour le remodelage et la reprogrammation des cellules somatiques humaines jusqu'au stade embryonnaire. [35]

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) peut être inefficace en raison des contraintes exercées à la fois sur l'ovule et le noyau introduit dans les premières recherches étaient énormes. Cela peut entraîner un faible pourcentage de cellules reprogrammées avec succès. Par exemple, en 1996, Dolly, la brebis, est née après que 277 œufs aient été utilisés pour la SCNT, ce qui a créé 29 embryons viables, ce qui lui donne une maigre efficacité de 0,3 %. [36] Seuls trois de ces embryons ont survécu jusqu'à la naissance et un seul a survécu jusqu'à l'âge adulte. [25] Millie, la progéniture qui a survécu, a pris 95 tentatives pour produire, [36] parce que la procédure n'était pas automatisée, mais devait être effectuée manuellement sous un microscope, SCNT était très gourmand en ressources. Une autre raison pour laquelle il y a un taux de mortalité si élevé avec la progéniture clonée est due au fait que le fœtus est plus gros que même les autres grandes progénitures, entraînant la mort peu de temps après la naissance. [36] La biochimie impliquée dans la reprogrammation du noyau cellulaire somatique différencié et l'activation de l'ovule receveur était également loin d'être comprise. Une autre limitation est d'essayer d'utiliser des embryons à une cellule pendant le SCNT. Lors de l'utilisation d'embryons clonés à une seule cellule, l'expérience a 65% de chances d'échouer dans le processus de fabrication de la morula ou du blastocyste. La biochimie doit également être extrêmement précise, car la plupart des décès de fœtus clonés à terme sont causés par une placentation inadéquate. [36] Cependant, en 2014, les chercheurs signalaient des taux de réussite de 70 à 80 % avec le clonage de porcs [37] et en 2016, une société coréenne, Sooam Biotech, produisait 500 embryons clonés par jour. [38]

Dans SCNT, toutes les informations génétiques de la cellule donneuse ne sont pas transférées, car les mitochondries de la cellule donneuse qui contiennent leur propre ADN mitochondrial sont laissées pour compte. Les cellules hybrides résultantes conservent les structures mitochondriales qui appartenaient à l'origine à l'œuf.En conséquence, les clones tels que Dolly qui sont nés de SCNT ne sont pas des copies parfaites du donneur de noyau. Ce fait peut également entraver les avantages potentiels des tissus et organes dérivés des SCNT pour la thérapie, car il peut y avoir une réponse immunitaire à l'ADNmt non-soi après la transplantation.

Les propositions d'utiliser des techniques de transfert de noyau dans la recherche sur les cellules souches humaines soulèvent un ensemble de préoccupations au-delà du statut moral de tout embryon créé. Celles-ci ont conduit certaines personnes et organisations qui sont ne pas opposés à la recherche sur les cellules souches embryonnaires humaines pour se préoccuper ou s'opposer à la recherche SCNT. [39] [40] [41]

L'une des préoccupations est que la création de blastula dans la recherche sur les cellules souches humaines basée sur les SCNT conduira au clonage reproductif des humains. Les deux processus utilisent la même première étape : la création d'un embryon transféré nucléaire, très probablement via SCNT. Ceux qui ont cette préoccupation préconisent souvent une réglementation stricte des SCNT pour empêcher l'implantation de tout produit dérivé à des fins de reproduction humaine, [42] ou son interdiction. [39]

Une deuxième préoccupation importante est la source appropriée des œufs nécessaires. SCNT nécessite des ovules humains, qui ne peuvent être obtenus que chez les femmes. La source la plus courante de ces ovules aujourd'hui sont les ovules produits et dépassant les besoins cliniques pendant le traitement de FIV. Il s'agit d'une procédure peu invasive, mais elle comporte certains risques pour la santé, tels que le syndrome d'hyperstimulation ovarienne.

Une vision pour des thérapies à base de cellules souches réussies est de créer des lignées de cellules souches personnalisées pour les patients. Chaque lignée de cellules souches personnalisée consisterait en une collection de cellules souches identiques portant chacune le propre ADN du patient, réduisant ou éliminant ainsi tout problème de rejet lorsque les cellules souches étaient transplantées pour traitement. Par exemple, pour traiter un homme atteint de la maladie de Parkinson, un noyau cellulaire d'une de ses cellules serait transplanté par SCNT dans un ovule d'un donneur d'ovules, créant une lignée unique de cellules souches presque identiques aux propres cellules du patient. (Il y aurait des différences. Par exemple, l'ADN mitochondrial serait le même que celui du donneur d'ovules. En comparaison, ses propres cellules porteraient l'ADN mitochondrial de sa mère.)

Potentiellement, des millions de patients pourraient bénéficier de la thérapie par cellules souches, et chaque patient aurait besoin d'un grand nombre d'ovules donnés afin de créer avec succès une seule lignée de cellules souches thérapeutiques personnalisées. Un si grand nombre d'ovules donnés dépasserait le nombre d'ovules actuellement disponibles et disponibles pour les couples essayant d'avoir des enfants grâce à la technologie de procréation assistée. Par conséquent, les jeunes femmes en bonne santé devraient être incitées à vendre des œufs à utiliser dans la création de lignées de cellules souches personnalisées qui pourraient ensuite être achetées par l'industrie médicale et vendues aux patients. On ne sait pas encore d'où viendraient tous ces œufs.

Les experts en cellules souches considèrent qu'il est peu probable qu'un si grand nombre de dons d'ovules humains se produise dans un pays développé en raison des effets inconnus à long terme sur la santé publique du traitement d'un grand nombre de jeunes femmes en bonne santé avec de fortes doses d'hormones afin d'induire une hyper-ovulation (ovuler plusieurs œufs à la fois). Bien que de tels traitements soient pratiqués depuis plusieurs décennies maintenant, les effets à long terme n'ont pas été étudiés ou déclarés sûrs pour une utilisation à grande échelle sur des femmes par ailleurs en bonne santé. Les traitements à plus long terme avec des doses d'hormones beaucoup plus faibles sont connus pour augmenter le taux de cancer des décennies plus tard. On ne sait pas si les traitements hormonaux pour induire une hyper-ovulation pourraient avoir des effets similaires. Il y a aussi des questions éthiques concernant le paiement des œufs. En général, la commercialisation de parties du corps est considérée comme contraire à l'éthique et est interdite dans la plupart des pays. Les œufs humains ont été une exception notable à cette règle pendant un certain temps.

Pour résoudre le problème de la création d'un marché d'œufs humains, certains chercheurs sur les cellules souches étudient la possibilité de créer des œufs artificiels. En cas de succès, les dons d'ovules humains ne seraient pas nécessaires pour créer des lignées de cellules souches personnalisées. Cependant, cette technologie peut être loin.

Le SCNT impliquant des cellules humaines est actuellement légal à des fins de recherche au Royaume-Uni, ayant été incorporé dans la loi de 1990 sur la fertilisation humaine et l'embryologie. SCNT.

Aux États-Unis, la pratique reste légale, car elle n'a pas été traitée par la loi fédérale. [44] Cependant, en 2002, un moratoire sur le financement fédéral des États-Unis pour le SCNT interdit le financement de la pratique à des fins de recherche. Ainsi, bien que légal, le SCNT ne peut pas être financé par le gouvernement fédéral. [45] Des universitaires américains ont récemment soutenu que parce que le produit du SCNT est un embryon cloné, plutôt qu'un embryon humain, ces politiques sont moralement mauvaises et devraient être révisées. [46]

En 2003, les Nations Unies ont adopté une proposition soumise par le Costa Rica, appelant les États membres à « interdire toutes les formes de clonage humain dans la mesure où elles sont incompatibles avec la dignité humaine et la protection de la vie humaine ». [47] Cette expression peut inclure SCNT, selon l'interprétation.

Le Conseil de l'Europe Convention sur les droits de l'homme et la biomédecine et son Protocole additionnel à la Convention de sauvegarde des droits de l'homme et de la dignité de l'être humain à l'égard des applications de la biologie et de la médecine, sur l'interdiction du clonage d'êtres humains semblent interdire le SCNT des êtres humains. Sur les 45 États membres du Conseil, le Convention a été signé par 31 et ratifié par 18. Le Protocole additionnel a été signé par 29 pays membres et ratifié par 14. [48]


Compétence de clonage de divers types de cellules somatiques

De nombreux types de cellules somatiques, y compris les cellules épithéliales mammaires, les cellules du cumulus ovarien, les cellules fibroblastiques de la peau et des organes internes, diverses cellules d'organes internes, les cellules de Sertoli [38, 56], les macrophages [56] et les leucocytes sanguins [34, 35] ont été testés avec succès. utilisé pour le transfert nucléaire. Un consensus clair, cependant, n'a pas encore été atteint quant au type de cellule somatique supérieur pour le transfert nucléaire. Cela est dû en partie au fait que différents laboratoires utilisent des procédures diverses et que la culture cellulaire, le transfert nucléaire et la micromanipulation nécessitent tous des compétences techniques essentielles. Pour que ces comparaisons soient valables, les procédures et techniques utilisées, ainsi que les compétences du personnel de laboratoire, doivent être identiques pour chaque animal donneur et type de cellule. Pour comparer la compétence de différents types de cellules pour la reprogrammation par clonage, nous avons évité la variation animale en examinant la compétence de clonage de trois types de cellules : cellules de cumulus ovarien, épithéliales mammaires et fibroblastes cutanés, toutes provenant du même animal donneur, un patient de 13 ans. vieille vache journalière d'élite.

La capacité des cellules donneuses à être reprogrammées a été évaluée par le développement d'embryons clonés in vitro et par la naissance de veaux clonés après transfert d'embryons. Comme le montrent les tableaux 2 et 3, bien qu'aucune différence n'ait été détectée dans les taux de clivage des embryons de trois types cellulaires différents, les cellules cumulus ont produit le taux le plus élevé de développement de blastocystes dans cette étude et ont donné 6 veaux clonés à terme. De plus, quatre des six veaux issus de cellules de cumulus ont survécu et étaient encore en bonne santé à près de 4 ans (tableau 3). En revanche, le développement in vitro le plus faible et aucune survie à terme ont été obtenus avec des cellules épithéliales mammaires. Les cellules fibroblastiques de la peau ont entraîné un taux intermédiaire de développement in vitro et ont donné naissance à 4 veaux clonés à terme.

Nos résultats ont montré que le type de cellule du donneur peut affecter de manière significative le développement de l'embryon in vitro ainsi qu'in vivo. Les cellules Cumulus se sont avérées être le type cellulaire le plus efficace pour le clonage somatique selon à la fois le test de développement in vitro et la survie à terme. Ces résultats suggèrent que l'ADN des cellules cumulus est plus efficacement reprogrammé après le transfert nucléaire. Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus chez la souris [57] où ils ont comparé l'efficacité de transfert nucléaire des cellules neuronales, de Sertoli et de cumulus, et ont obtenu le meilleur taux de naissances vivantes à partir d'embryons clonés dérivés de cellules de cumulus. De plus, il a été rapporté que les souris clonées dérivées de cellules cumulus ne présentent pas de dérèglement généralisé de l'empreinte [23]. Kato et al. [15, 36] ont comparé les cellules du foie, des testicules, de la peau, de l'oreille, ainsi que les cellules du cumulus et de l'oviducte et ont conclu que les cellules épithéliales du cumulus et de l'oviducte sont les plus appropriées pour les donneurs nucléaires. Les preuves soutenant la supériorité des cellules cumulus pour le transfert nucléaire proviennent également de l'étude de Forsberg et al. [58] qui ont effectué un grand nombre de transferts d'embryons chez les bovins. Il a été démontré que les cellules cumulus ont donné un taux de vêlage global de 15,2 %, tandis que les cellules de la crête génitale fœtale et les cellules de fibroblastes ont produit un taux de vêlage de 9 %. Les cellules fibroblastiques adultes, dans cette étude, ont donné le taux de vêlage le plus faible de seulement 5 %.

En résumé, parmi les types de cellules somatiques testés, le consensus de nombreux laboratoires est que les cellules cumulus donnent la plus grande efficacité de clonage et entraînent le moins d'anomalies chez les animaux clonés.


Avancées récentes dans le clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques

Le clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) est la seule technologie d'ingénierie de la reproduction qui confère au génome des cellules somatiques une totipotence. Depuis le premier rapport sur la naissance d'un mouton cloné à partir de cellules somatiques adultes en 1997, de nombreuses améliorations techniques de la SCNT ont été apportées en utilisant différentes approches épigénétiques, notamment l'amélioration des niveaux d'acétylation des histones dans la chromatine des embryons reconstruits. Bien qu'il faudra un temps considérable avant de comprendre pleinement la nature de la programmation génomique et de la totipotence, nous pouvons nous attendre à ce que la technologie de clonage de cellules somatiques devienne bientôt largement applicable à des fins pratiques, y compris la médecine, la fabrication de produits pharmaceutiques et l'agriculture. Ici, nous passons en revue les progrès récents dans le clonage de cellules somatiques, avec un accent particulier sur les études épigénétiques utilisant la souris de laboratoire comme modèle.

1. Introduction

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) chez les mammifères est une technique de reproduction assistée utilisée pour produire un animal à partir d'un noyau cellulaire unique en utilisant un ovocyte énucléé comme receveur. Comme les cellules somatiques peuvent proliférer et être génétiquement modifiées in vitro, on s'attend à ce que cette technique contribue largement à l'industrie de la production d'animaux de ferme, à la production de médicaments, à la médecine régénérative et à la conservation de ressources génétiques inestimables [1,2]. Outre ses larges applications pratiques, SCNT peut fournir des systèmes expérimentaux uniques et intéressants pour la recherche génomique, en particulier en épigénétique, pour apprendre comment le génome des cellules somatiques est reprogrammé dans un état équivalent à celui de l'ovocyte fécondé : l'état dit totipotent [3 ]. Bien que le génome des cellules somatiques puisse être reprogrammé (ou dédifférencié) par d'autres méthodes, notamment l'introduction de facteurs de transcription [4], l'incubation de cellules perméabilisées avec des extraits cellulaires [5] et la fusion cellule-cellule [6], l'état reprogrammé résultant de ce génome est finalement un état pluripotent équivalent à celui des cellules souches embryonnaires (ES) (figure 1). Par conséquent, le SCNT est la seule technique à ce jour qui peut doter le génome des cellules somatiques de totipotence.

Figure 1. Deux types de reprogrammation du génome des cellules somatiques. Le génome des cellules somatiques différenciées peut être reprogrammé à l'état pluripotent par introduction des facteurs dits de Yamanaka [4], incubation de cellules perméabilisées avec des extraits cellulaires [5] ou fusion cellulaire [6]. Cependant, l'état génomique résultant, même avec la meilleure reprogrammation, est celui des cellules souches embryonnaires (ES), qui sont épigénétiquement distinctes des cellules de la masse cellulaire interne (ICM) des blastocystes (voir le texte). On peut supposer qu'il existe une barrière épigénétique entre les cellules somatiques et les embryons entre les embryons préimplantatoires et les tissus embryonnaires postimplantatoires. Seul le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) à l'aide d'ovocytes énucléés peut surmonter cette barrière pour doter le génome somatique de totipotence, l'état épigénétique équivalent aux ovocytes fécondés (zygotes). Expérimentalement, le SCNT contourne le chemin normal du développement des cellules germinales, au cours duquel les marques épigénétiques somatiques sont effacées et les marques épigénétiques des cellules germinales sont imposées. En théorie, cela pourrait provoquer des erreurs de reprogrammation dans le génome des cellules somatiques et les phénotypes anormaux associés après SCNT. En revanche, le transfert nucléaire (NT) utilisant des blastomères embryonnaires est plus efficace. La barrière épigénétique proposée ici pourrait être plus stricte chez la souris et l'homme que chez les ongulés car ces dernières espèces ont une phase de préimplantation non attachée avant l'établissement du placenta dans l'utérus, après différenciation embryonnaire. iPS, cellule souche pluripotente induite.

Les cellules ES, en particulier celles des souris et des rats à leur état le plus fondamental, ont une pluripotence complète et peuvent se différencier en toutes les lignées cellulaires comprenant le corps [7,8] et même en cellules placentaires dans des conditions de culture spécifiques [9]. Leur structure chromatinienne hyperdynamique ouverte [10] et leur hyperactivité transcriptionnelle globale [11] les distinguent des cellules somatiques différenciées [12]. Cependant, au sens large, les cellules ES semblent être une sorte de cellule somatique car elles partagent certaines caractéristiques importantes communes à d'autres cellules somatiques ou à des embryons post-implantatoires, telles que leurs schémas de méthylation de l'ADN dans les régions promotrices et centriques/péricentriques et la perte complète de la mémoire d'inactivation du chromosome X spécifique à la lignée germinale [9,13-16]. Il a également été démontré que le processus de dérivation des cellules ES provoque des changements importants dans la méthylation de l'histone H3 au niveau des lysines 4 (H3K4me3) et 27 (H3K27me3) [17]. De même, de nombreuses différences dans les programmes transcriptionnels entre les cellules ES et les excroissances cellulaires de la masse cellulaire interne (ICM) ont été détectées par profilage ARN-seq [18,19]. Pris ensemble, lors de la dérivation des cellules ES, ils accumulent des caractères épigénétiques de type cellulaire somatique, reflétant fidèlement les phénomènes se produisant lors de l'implantation in vivo. Conformément à cela, il est connu que les souris clonées dérivées de cellules ES présentent des placentas hyperplasiques spécifiques aux SCNT, qui sont environ deux fois plus grands que ceux clonés à partir de cellules ICM [20,21]. En revanche, le transfert nucléaire (NT) à partir des blastomères d'embryons de souris préimplantatoires est plus efficace en termes de taux de natalité par nombre d'embryons transférés et provoque très peu d'anomalies dans les clones résultants [21,22]. Dans la mesure où cela a été testé chez les mammifères, il pourrait y avoir un écart entre le clonage du blastomère NT et le SCNT en termes de taux de natalité et de normalité de la progéniture clonée [20-23]. Par conséquent, il est raisonnable de supposer qu'il existe une « barrière épigénétique » entre les embryons préimplantatoires et les cellules somatiques postimplantatoires. Cette barrière pourrait être plus stricte chez la souris et l'homme que chez les ongulés car ces dernières espèces ont une phase de préimplantation non attachée avant que le placenta ne s'établisse dans l'utérus, après différenciation embryonnaire. Certaines marques épigénétiques sont probablement imposées sur le génome des cellules somatiques au moment de l'implantation et restent dans le génome tout au long du cycle de vie ultérieur. Ces marques de cellules somatiques ne sont effacées que par le développement des cellules germinales gonadiques d'une manière étape par étape, bien que le mécanisme ne soit pas encore clair [24]. Le SCNT force le génome des cellules somatiques à être reprogrammé directement à un état totipotent en contournant ces étapes d'effacement, ce qui pourrait rendre la technique sujette à des erreurs épigénétiques et provoquer de fréquentes morts et pertes d'embryons. En outre, SCNT devrait également effacer la mémoire spécifique au type de cellule qui avait été imposée lors de la différenciation. Cette mémoire associée à la différenciation pourrait être plus facile à reprogrammer que les anciennes marques de cellules somatiques putatives car lors de la génération de cellules souches pluripotentes induites (iPS), la plupart sinon tous les caractères épigénétiques des cellules donneuses d'origine sont effacés avec succès [25].

En somme, la technique SCNT devrait en quelque sorte surmonter ces deux obstacles épigénétiques : le marquage des cellules somatiques et la mémoire de différenciation spécifique au type cellulaire. Chaque obstacle peut provoquer des erreurs de reprogrammation spécifiques et des anomalies associées au clonage. Nous prévoyons qu'alors que nous cherchons à améliorer l'efficacité des SCNT, de telles relations entre les obstacles épigénétiques et leurs erreurs de reprogrammation spécifiques deviendront plus claires, conduisant à une compréhension plus précise des mécanismes de contrôle épigénétique fonctionnant pendant l'implantation et la différenciation cellulaire. La souris fournit probablement le meilleur modèle expérimental à cet effet.

2. Qu'est-ce qui détermine la reprogrammabilité génomique ? Leçons de souris

Depuis la naissance de Dolly la brebis en 1996, de nombreuses tentatives ont été faites pour cloner des animaux de différentes espèces en utilisant différents types de cellules somatiques [26]. Sur la base des informations accumulées sur les différents niveaux d'efficacité de ces expériences de clonage, il est largement admis que l'efficacité du clonage en termes de taux de natalité de la progéniture peut être affectée par un certain nombre de facteurs biologiques et techniques. Cependant, dans le clonage d'animaux de ferme, il existe inévitablement des différences individuelles considérables dans la qualité des ovocytes receveurs, des cellules donneuses et des femelles receveuses, il est donc généralement très difficile de déterminer les facteurs décisifs statistiquement [2]. Par conséquent, les tentatives visant à déterminer les meilleures conditions expérimentales pour le clonage des animaux de ferme peuvent être compromises et parfois devenir des sujets de controverse. En revanche, les souris de laboratoire offrent des systèmes expérimentaux plus reproductibles en raison de la disponibilité de fonds génétiques définis [27] et de protocoles bien établis pour la superovulation, la culture d'embryons et le transfert d'embryons. Depuis le premier rapport de clonage réussi de souris en 1998 [28], les cellules cumulus avec un fond génétique B6D2F1 ont été la source de donneur nucléaire standard et ont été utilisées comme témoins pour l'évaluation d'autres cellules de donneur pour leur « clonabilité » [29]. Une expérience de clonage de souris à grande échelle utilisant deux types cellulaires différents et six génotypes différents de cellules donneuses a révélé que les taux de natalité des clones étaient déterminés par la combinaison de ces deux facteurs [30]. Dans cette analyse, le taux de natalité utilisant les cellules cumulus B6D2F1 était de 2,2 pour cent tandis que celui de (B6 × 129) F1 clones de cellules de Sertoli néonatales était de 10,8 %. Dans l'ensemble, les SCNT avec des cellules de Sertoli néonatales ont donné une meilleure efficacité qu'avec des cellules de cumulus. Cela a été vrai dans des études plus récentes [31,32] et est en accord avec les résultats de l'analyse globale de l'expression génique de blastocystes clonés à partir de cellules de cumulus ou de Sertoli [33]. Les cellules ES ont également été utilisées dans des études de clonage chez la souris, en particulier dans la deuxième étape d'un protocole de clonage en série où des cellules ES dérivées de NT ont été générées comme étape intermédiaire entre les premier et deuxième cycles de SCNT [34] (figure 2). L'efficacité du clonage de souris utilisant des cellules ES est généralement très élevée, à condition que leur cycle cellulaire soit synchronisé avec succès avec celui de l'ooplasme et que les erreurs génétiques/épigénétiques soient évitées pendant in vitro culture.Les taux de natalité par nombre d'embryons transférés variaient de 12 % dans le rapport original de Wakayama et al. [20] à 33 pour cent dans une expérience utilisant F1 cellules ES hybrides [37]. La reprogrammabilité élevée (la capacité du génome à être reprogrammé) du génome des cellules ES pourrait être attribuée à l'expression consécutive de 3/4 oct., un facteur clé en amont nécessaire au développement embryonnaire précoce normal [38]. Une meilleure synchronisation du cycle cellulaire entre le noyau de la cellule ES et l'ooplasme receveur peut être obtenue par une culture confluente [39] ou par un arrêt du cycle cellulaire à la phase M avec un traitement au nocodazole [40].

Figure 2. SCNT en deux étapes chez la souris. Les cellules souches embryonnaires dérivées de NT (ntES) sont générées par le premier cycle de SCNT. Ceux-ci sont ensuite utilisés pour générer des souris clonées par une seconde procédure SCNT ou via une étape intermédiaire utilisant la production d'embryons chimériques. Ce protocole a été utilisé avec succès pour des études de clonage de souris où le SCNT conventionnel en une étape échoue ou lorsqu'il est très difficile de générer des souris par exemple, lors du clonage de lymphocytes [35] et lors de l'utilisation de cellules somatiques récupérées sur des cadavres congelés [36].

Étant donné que les meilleurs types de cellules donneuses en termes d'efficacité de clonage sont les cellules ES, suivies des cellules de Sertoli néonatales et des cellules de cumulus adultes [28,30,34,41], cela nous a conduit à émettre l'hypothèse que le degré de différenciation pourrait être inversement corrélé avec efficacité du clonage. L'une des stratégies pour tester cette hypothèse était de cloner des cellules différenciées au sein de la même lignée cellulaire. Dans la mesure où cela a été examiné à ce jour, les cellules de la lignée neuronale semblent confirmer cette hypothèse. Lorsque des cellules neurales ont été collectées sur des fœtus entre 15,5 et 17,5 jours après le coït (dpc), une progéniture clonée normale est née à un taux relativement élevé (5,5 %) [42]. En revanche, aucune progéniture vivante n'est née des cellules neurales de souris néonatales (jours 0 à 4 après la naissance) en raison de la mort embryonnaire à environ 10,5 dpc [43]. Les cellules neuronales adultes ont également contribué à la reconstruction des embryons clonés, mais n'ont soutenu leur développement que jusqu'à 6-7 dpc [28]. Les cellules souches neurales dérivées de cerveaux fœtaux ou néonatals pourraient être clonées pour produire une progéniture normale par SCNT [31,44]. Ces résultats suggèrent que les cellules de la lignée neuronale perdent leur reprogrammabilité à mesure qu'elles se différencient. Cependant, une autre source de données utilisant des cellules de lignées hématopoïétiques a suggéré que ce scénario n'est pas toujours le cas. Le clonage des cellules T ou B était extrêmement difficile tandis que le clonage des cellules T tueuses naturelles (NKT) était relativement facile, même si ce sont tous des lymphocytes à différenciation terminale portant un ADN réarrangé [35,45]. Dans la mesure où cela a été testé à ce jour, la génération de souris à partir de lymphocytes T ou B par SCNT direct a échoué et, par conséquent, un cycle de NT en deux étapes - une technique impliquant la génération de cellules ES et la complémentation tétraploïde - est nécessaire. [35] (figure 2). En cela, le stade des cellules ES permet un temps de reprogrammation supplémentaire, et les lignées cellulaires tétraploïdes pourraient contribuer à la plupart des tissus extra-embryonnaires, qui sont généralement les composants les plus affectés chez les animaux clonés [46]. En revanche, nous avons constaté que les cellules NKT avec des marqueurs différenciés spécifiques étaient des donneurs appropriés pour la génération de descendants clonés et de lignées cellulaires souches embryonnaires dérivées de NT (ntES) par SCNT direct [45]. Nous avons ensuite examiné si les cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec une plasticité différentielle innée pouvaient être clonées par SCNT. De manière inattendue, seulement 6 % des embryons reconstruits ont atteint le stade morula ou blastocyste in vitro (contre 46 % pour les clones issus de cellules cumulus) et au mieux seulement 0,7 % par embryon transféré atteint son terme [47]. Aucune descendance n'a été obtenue lorsqu'un fond génétique B6D2F1 standard a été utilisé [47]. Chanté et al. [48] ​​ont également confirmé l'inadéquation des CSH aux SCNT en comparant le taux de natalité des clones à celui des clones de granulocytes. Le faible développement des embryons clonés dérivés de CSH était cohérent avec leur schéma d'expression génique au stade 2 cellules lorsque l'activation majeure du gène zygotique (ZGA) se produit chez la souris [49]. Les clones HSC n'ont pas réussi à activer cinq des six gènes ZGA importants examinés, y compris Hdac1 codant pour l'histone désacétylase 1, un régulateur clé de ZGA [50,51]. En conséquence, seulement 34 pour cent des clones HSC ont atteint le stade de 4 cellules (p < 0,05 contre 65-78% des autres embryons clonés). Cette découverte semble être en contradiction avec la découverte selon laquelle les inhibiteurs d'HDAC améliorent réellement le développement des embryons clonés (voir ci-dessous), mais le traitement avec ces médicaments est généralement limité au stade très précoce du développement (moins de 10 h après l'activation des ovocytes) pour éviter leurs effets inhibiteurs sur ZGA à un stade ultérieur [50]. Nous avons également confirmé que l'expression de Hdac1 L'ARNm dans les CSH était plus faible que dans les autres cellules somatiques, reflétant probablement une structure de chromatine ouverte qui permet un accès facile aux facteurs de transcription [52,53]. Pris ensemble, nous postulons que la reprogrammabilité génomique est biologiquement distincte du degré de plasticité génomique basé sur son statut de différenciation (ou sa « tige », à l'inverse). Au contraire, il pourrait avoir une corrélation étroite avec le modèle d'expression génique ou la structure de la chromatine spécifique à chaque type de cellule donneuse. Oback [54] a examiné en détail les relations entre la reprogrammabilité génomique des donneurs et leur statut de différenciation chez la souris et d'autres espèces en 2009, et a postulé que le statut de différenciation du génome du donneur et sa reprogrammabilité à la totipotence pourraient être sans rapport.

D'après Eminli et al. [55], les CSH et les cellules hématopoïétiques progénitrices ont fourni une meilleure efficacité de génération de cellules iPS que les cellules B ou T. Ce n'est pas surprenant car la reprogrammation génomique à l'état pluripotent n'a pas besoin de ZGA ou d'activation de gènes pour le développement embryonnaire précoce. Par exemple, la suppression de HDAC1 dans les CSH pourrait faciliter la génération d'iPS, mais pourrait également entraver la ZGA et le développement embryonnaire ultérieur. Ainsi, les conditions préalables à l'acquisition de la pluripotence et de la totipotence sont épigénétiquement différentes, bien qu'il puisse exister une machinerie commune pour reprogrammer la structure de la chromatine et l'architecture nucléaire.

Après une série d'expériences SCNT utilisant différents types de cellules donneuses avec un mâle commun (B6 × 129) F1 génotype, nous avons trouvé une forte corrélation (r = 0.92, p = 9,1 × 10 –5 ) entre les taux d'embryons développés au-delà du stade 2 cellules et les taux de naissance après transfert d'embryons (figure 3). Cette découverte suggère que le degré de ZGA a un effet important sur le développement embryonnaire à terme. Les données indiquent également clairement qu'il n'y avait aucune relation entre la reprogrammabilité génomique et le statut indifférencié du génome (figure 3).

Figure 3. Corrélation entre les taux de développement au-delà du stade 2 cellules et le développement à terme dans les embryons clonés. Il existe une relation étroite entre ces paramètres alors que le degré de « tige » ou le statut indifférencié des cellules donneuses n'a aucune association avec ces efficacités de clonage. Toutes les expériences ont été entreprises en utilisant des cellules de donneurs mâles avec un (B6 × 129) F1 génétique, à l'exception des cellules germinales primordiales femelles (CPG). Ceci est basé sur des données à la fois publiées [30,44,45,47,56] et non publiées (A. Ogura, K. Inoue, données non publiées). Les taux de natalité ont été calculés, y compris les concepts de placenta uniquement. Les résultats utilisant des cellules donneuses avec une empreinte génomique incomplète telles que les PGC précoces [57] ou avec des constitutions chromosomiques anormales telles que des cellules souches mésenchymateuses cultivées depuis longtemps [44] ou des cellules cancéreuses [58] ont été omis ici. TSA, trichostatine A.

Comme mentionné ci-dessus, le génotype des cellules donneuses peut également affecter l'efficacité du clonage. Dans une étude, des veaux noirs japonais sont nés après SCNT à un taux aussi élevé que 80 pour cent (8/10 par embryon transféré) en utilisant des cumulus et des cellules épithéliales oviductales [59]. Cette efficacité était bien supérieure à celle du clonage bovin réalisé au cours de la même période (environ 10 %) [60]. Depuis lors, des taux de gestation élevés ont été rapportés pour les TNCS bovines utilisant la race noire japonaise [61,62]. Les moutons ont également montré une variabilité spécifique à la race en termes de succès du développement d'embryons clonés [63]. Cependant, il n'existe pas de données directement comparables pour les clones bovins et ovins permettant une évaluation précise des effets des fonds génétiques. En revanche, les expériences de clonage de souris nous ont permis d'évaluer l'effet du génotype sur le développement des clones de manière plus précise grâce à la disponibilité de souches de souris génétiquement définies [27]. D'après Van Thuan et al. [64], des souris clonées ont pu être obtenues à partir de toutes les souches consanguines testées jusqu'à présent [64]. Le meilleur taux de natalité a été obtenu avec la souche 129, suivie de la souche DBA/2 (figure 4). Sur la base de ces études, la présence du génome de la souche 129 devrait augmenter l'efficacité de la reprogrammation du génome du donneur après SCNT [30]. Historiquement, la plasticité de ce génome de souris a été démontrée par l'établissement relativement facile de cellules ES de cette souche [65] et par la forte incidence de carcinome testiculaire [66]. Fait intéressant, les placentas des clones dérivés de la souche 129 ont montré une morphologie presque normale, contrairement à ceux d'autres souches, qui ont montré une placentomégalie [67]. Par conséquent, il pourrait y avoir certains facteurs dans le génome de la souche 129 qui assurent sa plasticité génomique élevée. À l'heure actuelle, nous n'avons aucune idée de l'identité de ces facteurs, mais si nous pouvions les identifier, ils contribueraient grandement au développement sûr et efficace de nouvelles technologies en médecine régénérative et en pharmacie. Les expériences SCNT utilisant un ensemble de souches consanguines recombinantes basées sur des croisements entre la souche 129 et d'autres souches devraient aider à l'exécution de cette stratégie par ce qu'on appelle la «génétique avancée».

Figure 4. Effets de la trichostatine A (TSA) et du traitement par scriptaid sur le clonage de souris consanguines. Sans un tel traitement par inhibiteur d'histone désacétylase (HDACi) (barres noires), des souris clonées pourraient être obtenues à partir de souches hybrides et 129/Sv, mais avec un faible taux de réussite. Une seule souris clonée a été obtenue à partir de la souche DBA/2, mais cet animal ne s'est jamais reproduit. Lorsque la TSA (barres gris clair) a été utilisée, les taux de réussite des souches hybrides et non consanguines ont augmenté, mais nous n'avons jamais réussi à produire des souris clonées à terme à partir de souches consanguines. Cependant, lorsque scriptaid (barres gris foncé) a été utilisé, le taux de réussite global a été augmenté même à partir de souches consanguines.

3. Améliorations techniques basées sur les modifications des histones

Comme mentionné ci-dessus, la prévention des erreurs épigénétiques lors de la reprogrammation nucléaire devrait améliorer le taux de réussite du clonage animal. Endroit et al. [68] ont tenté de modifier le statut épigénétique des noyaux donneurs avant NT en utilisant deux produits chimiques : la 5-azacytidine (un inhibiteur de la méthylation de l'ADN) et la trichostatine A (TSA un inhibiteur d'histone désacétylase (HDACi)). Les in vitro le potentiel de développement des embryons clonés de bovins a été légèrement amélioré. Cependant, ces médicaments qui affectent l'épigénétique sont très toxiques [69,70] et chaque médicament doit être testé pharmacologiquement pour son exposition, son moment, sa concentration et sa durée appropriés. Ainsi, Kishigami et al. [71] ont découvert par essais et erreurs la concentration optimale, le moment et la période de traitement à la TSA pour le clonage d'embryons de souris. Finalement, cette méthode a conduit à une augmentation de plus de cinq fois du taux de réussite du clonage de souris, à l'exception du clonage de cellules ES (figure 5). Contrairement à la situation du clonage de souris, les effets de la TSA sur l'efficacité du clonage sont controversés pour les modèles bovin [72,73], porcin [74,75], lapin [76,77] et rat [78]. De plus, certains groupes ont signalé que le traitement à la TSA avait des effets néfastes sur la in vitro et in vivo développement d'embryons SCNT [73,76]. À notre connaissance, les effets du traitement par TSA sur le développement à terme n'ont été déterminés chez aucune espèce autre que la souris.

Figure 5. Effets du traitement HDACi sur le clonage de souris en utilisant des cellules de cumulus B6D2F1 comme donneurs NT. Sans traitement HDACi, des souris clonées ont pu être obtenues mais avec un faible taux de réussite (Suite). Lorsque TSA, scriptaid, SAHA ou oxamflatin ont été utilisés, les taux de réussite ont augmenté de manière significative, mais lorsque APHA a été utilisé, aucun clone n'a été obtenu. Tous les agents HDACi répertoriés ici appartiennent aux classes des composés chimiques de l'acide hydroxamique ou de l'hydroxamate.

Il faut souligner que la plupart des souris clonées n'ont été générées qu'à partir de souches hybrides et n'ont jamais été clonées à partir de souches non consanguines ou consanguines [30,67]. Cependant, lorsque le médicament scriptaid, qui agit comme un HDACi mais est moins toxique que la TSA [79], a été utilisé pour le clonage, il a pu augmenter les taux de réussite du clonage de souris non seulement chez les hybrides, mais aussi chez les souches consanguines supposées « unclonables » de souris [ 64,80]. De même, lorsque scriptaid a été utilisé à la place de TSA, Zhao et al. [81] ont amélioré le taux de réussite du clonage de porcs à terme. Ces résultats suggèrent que bien que l'utilisation de médicaments HDACi puisse améliorer la reprogrammation dans les embryons clonés, en raison de leur toxicité, les effets dépendent de la sensibilité individuelle de la souche ou de l'espèce donneuse. Pour cette raison, nous avons essayé de découvrir d'autres médicaments HDACi utiles pour le clonage de souris, et nous avons constaté que deux autres agents, l'acide subéroylanilide hydroxamique (SAHA) et l'oxamflatine, pourraient également améliorer le développement à long terme des souris clonées de manière significative sans conduire à des effets évidents. anomalies [82]. Un autre groupe a trouvé que mL'acide -carboxycinnamique bishydroxamide a également amélioré le taux de réussite du clonage de souris à terme [83]. Cependant, bien qu'il ait été rapporté que l'acide valproïque augmentait l'efficacité de reprogrammation des fibroblastes de souris de plus de 100 fois pour établir des cellules iPS [84], il avait peu [85] ou aucun effet [82] sur le taux de réussite du clonage de souris. Un autre HDACi, l'aroyl pyrrolyl hydroxamide (APHA), n'a pas non plus pu améliorer l'efficacité du clonage [64]. La figure 4 résume l'effet des agents HDACi sur le clonage de souris en utilisant des cellules de cumulus BDF1 [64,71,82].

(a) Comment le traitement HDACi améliore-t-il la reprogrammation ?

Bien que la façon dont le traitement HDACi améliore l'efficacité du clonage reste inconnue, on pense qu'il peut induire une hyperacétylation des histones centrales, entraînant des changements structurels de la chromatine qui permettent la transcription et une déméthylation améliorée de l'ADN du génome dérivé des cellules somatiques après SCNT [71]. C'est une partie nécessaire de la reprogrammation génétique [86]. En fait, plusieurs rapports ont clairement montré que le traitement HDACi pendant le clonage des SCNT améliorait l'acétylation des histones [87], la production d'ARNm naissant [64] et l'expression des gènes [88] d'une manière similaire à celle des embryons normalement fécondés. Le traitement à la TSA a également amélioré la cohérence à long terme de la régulation de l'expression génique à l'échelle du génome : le nombre total de gènes présentant couramment une régulation positive ou négative chez les chiots clones traités à la TSA a diminué à la moitié des chiots SCNT conventionnels et le profil d'expression génique total les clones TSA en sont venus à ressembler à ceux des chiots à injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) [89].

La façon dont la méthylation des histones est modifiée dans les embryons clonés traités à la TSA n'est pas complètement comprise. Bui et al. [90] ont trouvé que le traitement par TSA provoquait une augmentation de la décondensation chromosomique et du volume nucléaire dans les embryons générés par SCNT, similaire aux embryons produits par ICSI [90]. Ceci a été associé à une formation plus efficace de complexes de réplication d'ADN dans les embryons traités. Ces embryons pourraient surmonter un échec dans l'apparition rapide de la transcription des gènes embryonnaires par l'activation des gènes de l'ARNr et la promotion de l'allocation des protéines nucléolaires au cours de la phase précoce de la ZGA [91]. Ces résultats suggèrent que HDACi peut améliorer la reprogrammation des noyaux somatiques en termes de remodelage de la chromatine, de modification des histones, de réplication de l'ADN et d'activité transcriptionnelle.

(b) Pourquoi les embryons clonés nécessitent-ils un traitement HDACi pour une meilleure reprogrammation génomique ?

Dans la nature, l'ooplasme contient des mécanismes de reprogrammation, tels que l'acétylation des histones ou la déméthylation de l'ADN, qui convertissent les noyaux des spermatozoïdes et des ovocytes à un état totipotent [87, 92, 93]. Étant donné que les SCNT peuvent entraîner la naissance d'animaux viables, la machinerie de reprogrammation de l'ovocyte est suffisante pour reprogrammer un noyau de cellule somatique, au moins dans certains cas. Cependant, la machinerie de reprogrammation potentielle du cytoplasme de l'ovocyte est préparée pour la réception d'un noyau de spermatozoïde haploïde, et non d'un noyau de cellule somatique. En général, on considère que la reprogrammation incomplète des noyaux des cellules somatiques après SCNT résulte d'une mauvaise reprogrammation génomique dans l'ovocyte. Cependant, nous pensons maintenant que le cytoplasme de l'ovocyte pourrait reprogrammer trop fortement le noyau des cellules somatiques, ou que le noyau des cellules somatiques est plus sensible aux facteurs de reprogrammation des ovocytes que les noyaux des spermatozoïdes. Par conséquent, en inhibant un HDAC particulier ou l'un des facteurs de reprogrammation dans l'ooplasme lors de la reprogrammation, les noyaux donneurs de nos études ont peut-être été reprogrammés plus correctement, ce qui a entraîné un taux de réussite plus élevé pour le clonage [64,71].

4. Améliorations techniques basées sur le statut d'inactivation du chromosome X

Il est très probable que l'effet du traitement HDACi sur le remodelage de la chromatine des embryons clonés soit à l'échelle du génome plutôt que spécifique à la région du génome et conduit à une reprogrammation presque normale de l'ensemble du génome. Cependant, la présence de nombreux phénotypes spécifiques aux SCNT, tels que les anomalies placentaires [21,94,95], l'obésité [96] et l'immunodéficience [97], suggère que les SCNT induisent inévitablement des erreurs épigénétiques spécifiques dans le génome du donneur. Il pourrait s'agir de caractéristiques non aléatoires et définissables, peut-être causées par la nature épigénétique fondamentale imposée aux noyaux des cellules somatiques au moment de l'implantation décrite ci-dessus. Pour examiner cette possibilité, des blastocystes clonés ont été analysés pour leurs profils d'expression génique globaux en les comparant à des témoins de génotype et de sexe appariés produits par in vitro fécondation dans le même environnement. Nous avons noté que lorsque les niveaux d'expression relatifs de tous les 41 233 gènes dans les embryons clonés ont été tracés sur les 20 chromosomes, de nombreux gènes sur le chromosome X ont été spécifiquement régulés à la baisse [32]. Cette suppression du gène lié à l'X était étendue aux chromosomes et était associée à une expression élevée de la Xist gène, qui est responsable de l'inactivation de l'un des chromosomes X dans les cellules femelles. ARN fluorescent in situ analyse d'hybridation (FISH) pour Xist L'ARNm dans les noyaux des blastomères a révélé un signal excessif dans les embryons clonés mâles et femelles, indiquant que Xist a été exprimé par voie ectopique à partir du chromosome X actif chez les deux sexes. Nous avons ensuite examiné dans quelle mesure son expression ectopique était responsable des faibles taux de natalité des clones, en utilisant des stratégies de knock-out et de knockdown. Comme le chromosome X n'est que l'un des 20 chromosomes chez la souris (à l'exception du Y), nous avons d'abord anticipé que la normalisation de Xist l'expression entraînerait simplement de légères améliorations de l'efficacité du clonage. Cependant, les résultats ont été beaucoup plus remarquables que ce à quoi nous nous attendions. Lorsque les cellules du donneur contenant un Xist-chromosome X déficient ont été utilisés pour la NT, les taux de natalité ont été multipliés par 8 et 14 après le clonage de cumulus et de cellules de Sertoli, respectivement [32]. De même, le renversement de Xist par l'injection d'ARN (si) interférent court spécifique dans des ovocytes reconstruits a entraîné une augmentation d'environ 10 fois du taux de natalité [98]. Fait intéressant, la normalisation de la Xist niveau d'expression a entraîné une diminution du nombre de gènes autosomiques régulés à la baisse à 6 pour cent et 25 pour cent dans les clones femelles et mâles, respectivement. Ces résultats indiquent que l'ectopie Xist l'expression dans les clones pourrait avoir affecté négativement l'expression des gènes dans les embryons clonés d'une manière à l'échelle du génome. Bien que cette stratégie de précipitation ne soit actuellement applicable qu'aux clones mâles en raison de notre incapacité à obtenir un contrôle quantitatif précis de Xist La répression des ARNm, cette technologie est plus réaliste pour les futures applications pratiques des SCNT car elle est techniquement aisée et n'altère pas la constitution génomique du génome du donneur ou de la descendance clonée. Les XIST Le gène est régulé à la hausse dans les embryons de SCNT bovin et a été impliqué dans la mort prénatale de porcs et de veaux clonés [99-101]. Chez les espèces animales domestiques telles que les bovins et les porcs, l'implantation embryonnaire a lieu longtemps après le transfert d'embryons. Par conséquent, nous devons examiner attentivement si l'effet de XIST knockdown peut persister jusqu'à la période de développement critique pour la survie des embryons clonés.

Deux groupes distincts de gènes sont restés supprimés dans Xist-blastocystes de clones de souris supprimés. Ils étaient les Magéa et XLR amas de gènes, localisés dans les régions chromosomiques XqF3 et XqA7.2–7.3, respectivement [32]. Ces régions se trouvent dans les blocs enrichis par la diméthylation de l'histone H3 au niveau de la lysine 9 (H3K9me2), qui est responsable du silençage génique fournissant un statut d'hétérochromatine constitutif. Elles sont appelées « grandes modifications organisées de la chromatine K9 » [102] et leur schéma de distribution correspondait exactement entre les cellules ES [102] et les cellules du cumulus donneur [32]. Nous avons postulé que l'état répressif de la Magéa et XLR Les régions médiées par la modification somatique de type H3K9me2 dans les cellules du donneur étaient résistantes à la reprogrammation par le ou les facteurs ooplasmiques putatifs et par conséquent transmises aux embryons clonés. Les Magéa et XLR les gènes ont été activement transcrits dans les blastocystes normaux dérivés de la fécondation, mais se sont arrêtés dans les cellules ES [32], suggérant que les blocs H3K9me2 pourraient servir de « signature somatique » imposée lors de l'implantation. Celles-ci pourraient être les prochaines cibles d'améliorations techniques du SCNT.

5. Autres facteurs pouvant affecter le développement des clones

(a) Anomalies placentaires

La plupart des embryons clones dérivés de SCNT arrêtent leur développement à un certain moment au cours de la période post-implantation précoce, selon les espèces : avant 6,5 jours chez la souris [103] et avant 60 jours chez les embryons bovins [104]. Ces périodes sont critiques pour une placentation précoce. En effet, des phénotypes placentaires anormaux associés aux SCNT ont souvent été décrits chez plusieurs des espèces clonées à ce jour [105]. Les souris clonées sont associées à des placentas hypoplasiques au début de la gestation [106,107] et à une hyperplasie placentaire de la mi-gestation à terme [94,95,108]. Les placentas des veaux clonés ont des placentomes moins nombreux mais beaucoup plus gros, probablement pour compenser le nombre réduit de sites placentaires pour les échanges mère-fœtus [109]. Ainsi, il est possible que les défauts de la lignée cellulaire extra-embryonnaire soient l'une des causes majeures du faible taux de réussite du clonage reproductif [105]. Au début, cette hypothèse était considérée comme cohérente avec la dérivation facile des cellules ntES à partir des cellules de masse internes des blastocystes clonés [110]. Cependant, ce scénario s'est avéré invalide car les cellules souches du trophoblaste (ntTS) ont également été établies efficacement à partir d'embryons SCNT [111,112]. Pour déterminer comment les tissus extra-embryonnaires sont impliqués dans le mauvais développement des clones et les phénotypes de placenta agrandis chez la souris, plusieurs laboratoires ont analysé des chimères générées par fusion d'embryons clonés et d'embryons fécondés. De plus, les cellules ntTS ont également été caractérisées in vivo et in vitro dans ce but. En conséquence, certaines études ont suggéré que des interactions désorganisées entre les tissus embryonnaires et extra-embryonnaires sont responsables d'un clonage inefficace ou d'anomalies placentaires [111,113,114], tandis que d'autres ont indiqué l'implication prédominante des tissus extra-embryonnaires eux-mêmes [107,112]. Récemment, Lin et ses collaborateurs [115] ont réévalué les conséquences sur le développement des embryons de chimères en utilisant des cellules ICM isolées, et non des blastocystes entiers. En agrégeant des cellules ICM dérivées de clones avec des embryons fécondés tétraploïdes, ils ont réussi à sauver des phénotypes placentaires anormaux et ont augmenté le taux de natalité des clones jusqu'à 15,7%, indiquant que des défauts dans la lignée extra-embryonnaire sous-tendent le faible taux de réussite du clonage SCNT. Le sauvetage d'embryons dérivés de SCNT par Xist knockout ou knockdown décrits ci-dessus n'a eu aucun effet bénéfique sur le phénotype placentaire hyperplasique. Il sera intéressant de voir si les deux stratégies de sauvetage des embryons SCNT pourraient avoir un effet synergique.

(b) Hérédité maternelle de l'ADN mitochondrial

Depuis les premières études SCNT dans les années 1990, la question de savoir si l'ADN mitochondrial (ADNmt) transmis par les cellules du donneur peut entraîner un développement médiocre des embryons clonés est un problème. Il s'agit d'un ensemble de génomes cytoplasmiques qui code pour un sous-ensemble de gènes codant pour la phosphorylation oxydative et est transmis à la progéniture par héritage maternel strict [116,117]. Généralement, un seul ovocyte contient plus de 10 5 copies d'ADNmt, alors que les cellules somatiques n'en contiennent que 10 2 –10 3 copies [117,118]. Théoriquement, les animaux clonés possèdent deux types d'ADNmt dérivés d'ovocytes et de cellules donneuses, cette condition est appelée hétéroplasmie. Evans et al. [119] ont démontré que le premier mammifère cloné, Dolly, ne possédait pas d'ADNmt dérivé de cellules de donneurs nucléaires dans ses tissus, alors que Steinborn et al. [120] ont détecté une hétéroplasmie dans des embryons bovins produits à partir de trois types de cellules donneuses. De nombreuses tentatives ont été faites pour discriminer quantitativement l'ADNmt dérivé d'ovocytes et de cellules de donneur. Ceux-ci ont soutenu la présence d'hétéroplasmie chez les animaux clonés, bien que son degré variait considérablement selon les expériences [121–124]. Chez la souris, 24 des 25 descendants clonés portaient l'ADNmt dérivé des cellules du donneur jusqu'à un rapport de 13,1 % du total [125]. Cependant, à notre connaissance, il n'y a aucune preuve expérimentale que l'hétéroplasmie pourrait compromettre le développement d'embryons clonés ou l'état de santé de la progéniture, du moins dans les SCNT conventionnelles. En revanche, la situation des SCNT interspécifiques (iSCNT) est très différente. L'incompatibilité entre les gènes de l'ADNmt et les gènes nucléaires codant pour les protéines mitochondriales est considérée comme l'une des principales causes d'arrêt du développement chez les embryons iSCNT [126]. Dans l'iSCNT chez les canidés et les félidés, cela pourrait ne pas être un problème critique car les loups et les chats sauvages sont nés à partir d'ovocytes de chiens et de chats domestiques, respectivement [127,128].

6. Perspectives d'avenir

(a) La possibilité de ressusciter un animal disparu

Le clonage d'animaux par SCNT offre une opportunité de préserver des espèces de mammifères menacées, à condition que des cellules viables puissent être collectées. Cependant, la « résurrection » d'espèces éteintes du pergélisol (comme le mammouth laineux) est considérée comme peu pratique, car aucune cellule vivante ne sera disponible. En revanche, il est connu que les spermatozoïdes « morts » issus de traitements de lyophilisation [129] ou d'un cadavre entier congelé [130] possèdent encore un génome haploïde complet. Lorsque de tels spermatozoïdes étaient injectés dans des ovocytes, les embryons résultants pouvaient se développer en une progéniture saine à terme. Étonnamment, la ténacité de l'ADN a été démontrée non seulement dans la tête des spermatozoïdes, mais aussi dans les cellules somatiques. Nous avons tenté de produire des souris clonées à partir de cadavres conservés congelés à -20°C jusqu'à 16 ans sans aucune cryoprotection. Ces conditions sont similaires à celles d'un corps congelé récupéré du pergélisol, et les cellules de tous les organes des cadavres ont été complètement perturbées. Lorsque nous avons injecté ces noyaux cellulaires dans des ovocytes de souris énucléés, certains des embryons ont pu se développer en blastocystes. Bien que nous n'ayons pas pu produire directement de descendants clonés à partir des cellules somatiques, plusieurs lignées cellulaires ES ont été établies à partir des embryons clonés. Enfin, des souris clonées saines ont été produites à partir de ces cellules ES par un deuxième cycle de NT (figure 2) [36,131]. Ainsi, ces techniques pourraient être utilisées pour ressusciter des animaux ou pour maintenir des stocks de génomes à partir de tissus qui ont été congelés pendant des périodes prolongées ou même lorsqu'aucune cellule vivante n'est disponible. Dans de tels cas, tous les clones attendus seraient du même sexe que le donneur et ils ne pourraient jamais se propager par reproduction naturelle. Dans une récente expérience de clonage, nous avons obtenu une souris femelle à partir d'une cellule de Sertoli immature. Ce clone « féminin dérivé du mâle » est devenu un adulte normal et a produit une progéniture par accouplement naturel [132]. Bien qu'il s'agisse d'un phénomène accidentel résultant d'une erreur chromosomique sexuelle, le résultat suggère sans équivoque la possibilité de produire des femelles à partir d'animaux donneurs mâles si les techniques de manipulation des chromosomes sexuels sont suffisamment développées.

(b) La possibilité de sélectionner des embryons de haute qualité avant le transfert

En plus des altérations épigénétiques, des anomalies génétiques survenant au cours des premiers stades de clivage, telles que des anomalies chromosomiques [105,133,134], pourraient également être à l'origine du faible taux de réussite du clonage. Si tel est le cas, il est probable que les embryons dérivés de SCNT pourraient se développer à terme si une telle reprogrammation épigénétique se produisait correctement, conduisant à une ségrégation chromosomique normale. Malheureusement, la morphologie et/ou la vitesse de développement jusqu'au stade blastocyste ne sont pas des marqueurs prédictifs significatifs pour le développement à terme des embryons clonés. Cependant, nous avons récemment réussi à développer un système d'imagerie fluorescente à cellules vivantes « moins de dommages » optimisé pour les embryons de souris préimplantatoires [135]. En utilisant ce système, nous avons réussi à sélectionner des embryons clonés chromosomiquement normaux et avons pu améliorer le taux de réussite du clonage après transfert d'embryons [136]. Si ces méthodes de sélection et de modification épigénétique pouvaient être combinées, l'exploration des mécanismes impliqués dans la reprogrammation génomique serait accélérée et les questions sur les différences entre les clones dérivés de cellules embryonnaires et les clones dérivés de SCNT pourraient être résolues. Le taux de réussite du clonage par embryon transféré serait suffisant pour des applications en sélection animale commerciale.

(c) Techniques de transfert nucléaire pour l'analyse de l'épigénétique des cellules germinales

Les cellules germinales pré-méiotiques peuvent également être utilisées pour construire des embryons diploïdes par NT, et cela peut fonctionner comme un outil puissant pour déterminer la dynamique des changements épigénétiques au cours du développement des cellules germinales. Une étude importante dans cette catégorie est l'analyse du statut d'empreinte génomique des cellules germinales, en particulier des cellules germinales primordiales (PGC) et des gonocytes. L'empreinte génomique implique une « mémoire » épigénétique pour l'expression parentale spécifique à l'allèle dans environ 100 gènes chez les mammifères eutheriens [137,138]. Sur la base du principe que la reprogrammation dans l'ooplasme mature ne modifie pas l'empreinte génomique, les fœtus clonés générés à partir de cellules germinales devraient refléter fidèlement le statut d'empreinte génomique du donneur [139]. Par conséquent, l'analyse des fœtus et des placentas reconstruits à partir de cellules germinales pourrait fournir des informations inestimables sur leur statut d'empreinte génomique basée sur le statut de méthylation de l'ADN et le modèle d'expression des gènes. Il est généralement difficile de déterminer le profil d'expression génique des gènes imprimés par une analyse directe conventionnelle des cellules germinales, car la plupart des gènes imprimés sont principalement exprimés dans les fœtus et les placentas en développement [137]. De plus, une telle analyse directe ne nous donne qu'une image moyenne d'une population mixte de cellules germinales. Le clonage NT de cellules germinales peut pallier ces inconvénients biologiques et techniques. En utilisant la technique NT, nous avons pu analyser la dynamique du processus d'effacement de l'empreinte dans les PGC à 11,5 dpc et trouvé l'ordre coordonné d'effacement spécifique pour chaque gène imprimé [57]. Ceci est cohérent avec les résultats d'une analyse génomique complète utilisant des PGC à chaque stade de développement [140]. Nous avons identifié le « statut par défaut » de chaque gène imprimé soit comme une expression biallélique, soit comme aucune expression, ce qui a été atteint dans les PGC à 12,5 dpc. De même, ce système expérimental peut également être appliqué aux cellules germinales mâles pré-méiotiques telles que les gonocytes et les spermatogonies. Selon le modèle d'expression génique des fœtus générés à partir de ces cellules, l'empreinte génomique paternelle était supposée être imposée de 16,5 dpc à la fois pour la H19-DMR (région méthylée différentiellement) et l'IG-DMR (A. Ogura, K. Inoue, non publié Les données). De plus, en utilisant des cellules germinales à différents stades de développement (PGC, gonocytes, cellules souches germinales, spermatides rondes et parthénotes), nous examinons maintenant quel génome assure le bon Xist expression après NT. Les résultats de l'analyse de l'expression de l'ARN FISH et de l'ARNm quantitative impliquent que, pour le Xist gène, la transcription à partir du stade 4 cellules est le modèle par défaut, et une machinerie d'empreinte inconnue, probablement imposée au cours de l'ovogenèse, réprime cette transcription (A. Ogura, K. Inoue, données non publiées). Ceci est cohérent avec la découverte précédente selon laquelle le chromosome X dérivé d'ovocytes non en croissance était inactivé alors que celui d'ovocytes complètement développés restait actif [141]. Fait intéressant, la création de ce Xist-le mécanisme de répression était indépendant de la méthylation de novo de l'ADN [142].

Nous nous attendons également à ce que la NT utilisant des cellules germinales fournisse des indices importants pour comprendre les facteurs qui assurent le processus normal de reprogrammation génomique pour produire la totipotence. Nos récentes découvertes sur les phénotypes des embryons clonés et de la progéniture dérivés des PGC à 10,5 dpc ont suggéré une nature cellulaire somatique de leur génome, ils ont montré un arrêt du développement spécifique au stade et des placentas hyperplasiques comme ceux dérivés de SCNT [56]. Par conséquent, à un certain moment au cours du développement des cellules germinales entre 10,5 dpc et le stade des gamètes matures, le génome des cellules germinales acquiert la capacité d'être entièrement reprogrammé pour le début d'une nouvelle vie. L'analyse épigénétique à haute résolution et à l'échelle du génome récemment développée des cellules germinales pourrait être combinée efficacement pour atteindre cet objectif de recherche [143].


Le clonage de cellules somatiques produit toujours une descendance femelle ? - La biologie

PARTIE III. BIOLOGIE MOLÉCULAIRE, DIVISION CELLULAIRE ET GÉNÉTIQUE

11. Applications de la biotechnologie

11.3. La modification génétique des organismes

Pendant des milliers d'années, les civilisations ont tenté d'améliorer la qualité de leur bétail et de leurs cultures. Les vaches qui produisaient plus de lait ou une viande plus tendre étaient appréciées par rapport à celles qui produisaient peu de lait ou avaient une viande dure. Les tentatives initiales pour développer des stocks agricoles améliorés se sont limitées à des programmes d'élevage sélectif, dans lesquels seuls les organismes possédant les caractéristiques souhaitées étaient autorisés à se reproduire. Au fur et à mesure que les scientifiques posaient des questions plus sophistiquées sur les systèmes génétiques, ils ont développé des moyens de créer et d'étudier des mutations.

Bien que cette approche soit un moyen très instructif d'en apprendre davantage sur la génétique d'un organisme, elle n'avait pas la capacité de créer un changement spécifique souhaité. La création de mutations est un processus très aléatoire. Cependant, aujourd'hui, les résultats sont obtenus de manière beaucoup plus ciblée en utilisant la capacité de la biotechnologie à transférer l'ADN d'un organisme à un autre. La transformation a lieu lorsqu'une cellule obtient de nouvelles informations génétiques de son environnement. Une fois que de nouvelles séquences d'ADN sont transférées dans une cellule hôte, la cellule est génétiquement modifiée et commence à lire le nouvel ADN et à produire de nouveaux produits cellulaires, tels que des enzymes. La nouvelle forme d'ADN qui en résulte est appelée ADN recombinant.

Un clone est une copie exacte d'entités biologiques, telles que des gènes, des organismes ou des cellules. Le terme fait référence au résultat, pas à la manière dont les résultats sont atteints. De nombreux organismes entiers se « clonent » simplement par la façon dont ils se reproduisent. Les bactéries se divisent par division cellulaire et produisent deux cellules génétiquement identiques. Les plants de fraises se clonent en envoyant des coureurs et en établissant de nouvelles plantes. De nombreuses variétés d'arbres fruitiers et d'autres plantes sont clonées en faisant des boutures de la plante et en enracinant les boutures. Avec le développement des techniques avancées de biotechnologie, il est désormais possible de cloner des gènes spécifiques à partir d'un organisme. Il est possible de mettre ce gène cloné dans la cellule d'une espèce totalement différente.

Organismes génétiquement modifiés

Les organismes génétiquement modifiés (GM) contiennent de l'ADN recombinant. Les virus, les bactéries, les champignons, les plantes et les animaux sont des exemples d'organismes qui ont été conçus de manière à contenir des gènes d'au moins un organisme non apparenté.

Au fur et à mesure que cette procédure hautement sophistiquée a été affinée, il est devenu possible d'épisser rapidement et précisément des gènes d'une variété d'espèces dans des bactéries hôtes ou d'autres cellules hôtes par un processus appelé clonage de gènes (How Science Works 11.4). Les organismes génétiquement modifiés sont capables d'exprimer les régions codant pour les protéines trouvées sur l'ADN recombinant. Ainsi, les organismes avec l'ADN recombinant peuvent fabriquer des produits qu'ils étaient auparavant incapables de fabriquer. Puisqu'elles peuvent se reproduire rapidement en grand nombre, les cultures de bactéries de taille industrielle peuvent synthétiser de grandes quantités de protéines. Par exemple, les procédures d'ADN recombinant sont responsables de la production de :

• L'insuline humaine, utilisée dans le contrôle du diabète (figure 11.6)

• « riz doré » enrichi sur le plan nutritionnel, capable de fournir aux pauvres des pays moins développés du bêta-carotène, qui est absent du riz normal

• Interféron, utilisé comme agent antiviral

• Hormone de croissance humaine, utilisée pour stimuler la croissance des enfants dépourvus de cette hormone

• La somatostatine, une hormone cérébrale impliquée dans la croissance.

La principale application de la technologie GM consiste à introduire des gènes de résistance aux herbicides ou aux ravageurs dans les plantes cultivées. Les cultures GM comestibles sont principalement utilisées pour l'alimentation animale. Dans la pratique agricole, deux types d'organismes génétiquement modifiés ont reçu une attention particulière. L'une implique l'insertion de gènes d'un type spécifique de bactérie appelée Bacillus thuringiensis israelienis (Bti). Le Bti produit une protéine qui provoque la destruction de la muqueuse intestinale des insectes qui le mangent. C'est un insecticide naturel. À ce jour, le gène a été inséré dans la constitution génétique de plusieurs plantes cultivées, dont le maïs. Lors d'essais sur le terrain, le maïs génétiquement modifié était protégé contre certains de ses insectes nuisibles, mais on craignait que les grains de pollen du maïs soient soufflés vers les zones voisines et affectent les populations d'insectes non cibles. En particulier, une étude sur les papillons monarques a indiqué que les populations de papillons adjacentes aux champs de ce maïs génétiquement modifié étaient affectées négativement.On pourrait soutenir que puisque l'utilisation du maïs Bti entraîne moins de pulvérisation d'insecticides dans les champs de maïs, il ne s'agit que d'un compromis.

FIGURE 11.6. Insuline humaine provenant de bactéries

Le processus de clonage de gènes est utilisé pour placer une copie du gène de l'insuline humaine dans une cellule bactérienne. Au fur et à mesure que la cellule bactérienne se reproduit, l'ADN humain qu'elle contient est répliqué avec l'ADN bactérien. Le gène de l'insuline est exprimé avec les gènes bactériens et la colonie de bactéries produit de l'insuline. Cette insuline humaine produite par des bactéries est à la fois plus efficace et moins chère que les thérapies précédentes, qui impliquaient d'obtenir de l'insuline à partir du pancréas des animaux abattus.

Un deuxième type de plante génétiquement modifiée consiste à insérer un gène de résistance aux herbicides dans le génome de certaines plantes cultivées (figure 11.7a). La valeur de cela pour les agriculteurs est importante. Par exemple, un agriculteur pourrait planter du coton avec très peu de préparation du champ pour le débarrasser des mauvaises herbes. Lorsque le coton et les mauvaises herbes commencent à pousser, le champ pourrait être pulvérisé avec un herbicide spécifique qui tuerait les mauvaises herbes mais n'endommagerait pas le coton résistant aux herbicides. Cela a été testé sur le terrain et cela fonctionne. Les critiques ont averti que les gènes pourraient éventuellement s'échapper des plantes cultivées et devenir une partie du génome des mauvaises herbes que nous essayons de contrôler, créant ainsi des "super mauvaises herbes".

De nombreux autres produits ont été fabriqués en utilisant ces méthodes. Les cellules génétiquement modifiées ne sont pas seulement utilisées comme usines pour produire des produits chimiques, mais aussi pour leur capacité à décomposer de nombreux produits chimiques toxiques. La biorestauration est l'utilisation d'organismes vivants pour éliminer les agents toxiques de l'environnement. L'utilisation de bactéries génétiquement modifiées pour nettoyer les déversements de pétrole et les décharges de déchets toxiques a connu un grand succès.

FIGURE 11.7. Application d'organismes génétiquement modifiés

Le soja, le maïs, le coton, la papaye hawaïenne, les tomates, le colza, la canne à sucre, les betteraves à sucre, le maïs sucré et le riz sont une courte liste de cultures GM cultivées et vendues. (a) L'une des applications les plus importantes de cette technologie implique l'insertion de gènes qui rendent une plante cultivée résistante aux herbicides. Par conséquent, le champ peut être pulvérisé avec un herbicide et tuer les mauvaises herbes sans nuire à la plante cultivée. (b) Le riz normal ne produit pas de quantités significatives de bêta-carotène. Le bêta-carotène est un composé jaune-orange nécessaire dans l'alimentation pour produire de la vitamine A. (c) Le « riz doré » génétiquement modifié peut fournir du bêta-carotène aux populations qui n'ont pas d'autres sources de ce nutriment.

Le clonage d'un gène spécifique commence par couper l'ADN source en morceaux plus petits et gérables avec des enzymes de restriction. Ensuite, il y a plusieurs étapes de base qui se produisent dans le transfert d'ADN d'un organisme à un autre :

1. L'ADN source est découpé en une taille utilisable en utilisant des enzymes de restriction.

L'ADN source est généralement isolé d'un grand nombre de cellules. Par conséquent, il se compose de nombreuses copies du génome d'un organisme. L'ADN source est coupé en de nombreux petits fragments avec des enzymes de restriction. Isoler la petite portion d'ADN qui contient le gène d'intérêt peut être difficile car le gène d'intérêt ne se trouve que sur quelques-uns de ces fragments. Pour identifier les fragments recherchés, les scientifiques doivent rechercher l'ensemble de la collection. La recherche comporte plusieurs étapes.

2. Les fragments d'ADN sont attachés à une molécule d'ADN porteuse.

La première étape consiste à attacher chaque fragment d'ADN source à une molécule d'ADN porteuse. Un vecteur est le terme que les scientifiques utilisent pour décrire une molécule d'ADN porteuse. Les vecteurs contiennent généralement des séquences d'ADN spéciales qui facilitent la fixation aux fragments d'ADN source. Les vecteurs contiennent également des séquences qui favorisent la réplication de l'ADN et l'expression des gènes.

Un plasmide est un exemple de vecteur utilisé pour transporter l'ADN dans des cellules bactériennes. Un plasmide est un morceau d'ADN circulaire qui se trouve libre dans le cytoplasme de certaines bactéries. Par conséquent, le plasmide doit être coupé avec une enzyme de restriction, de sorte que l'ADN plasmidique ait des extrémités collantes, qui peuvent se fixer à l'ADN source. L'enzyme ligase crée les liaisons covalentes entre l'ADN plasmidique et l'ADN source, de sorte qu'un nouvel anneau plasmidique est formé avec l'ADN source inséré dans l'anneau. Le plasmide et son ADN source inséré sont de l'ADN recombinant. Comme il existe de nombreux fragments d'ADN source différents, ce processus donne lieu à de nombreux plasmides différents, chacun avec un morceau d'ADN source différent. Tous ces plasmides d'ADN recombinant constituent une banque d'ADN pour l'ensemble du génome source.

3. La molécule d'ADN porteur, avec son ADN source attaché, est déplacée dans une cellule appropriée pour l'ADN porteur. Dans la cellule, le nouvel ADN est répliqué ou exprimé.

La première étape du clonage d'un gène spécifique consiste à couper l'ADN source en morceaux plus petits et gérables avec des enzymes de restriction.

L'ADN source est coupé avec des enzymes de restriction pour créer des extrémités collantes. L'ADN vecteur (orange) a des extrémités cohésives compatibles, car il a été coupé avec la même enzyme de restriction. L'enzyme ligase est utilisée pour lier l'ADN source à l'ADN vecteur.

La deuxième étape du processus de clonage consiste à mélanger la banque d'ADN avec des cellules bactériennes qui absorberont les molécules d'ADN. La transformation se produit lorsqu'une cellule obtient des informations génétiques de son environnement. Chaque cellule bactérienne transformée porte une partie différente de l'ADN source de la banque d'ADN. Ces cellules peuvent être cultivées et isolées les unes des autres.

Les cellules bactériennes récupèrent les plasmides avec l'ADN recombinant et sont transformées. Différentes cellules prélèvent des plasmides avec différents inserts d'ADN génomique.

La troisième étape consiste à cribler la banque d'ADN contenue dans les nombreuses cellules bactériennes transformées différentes pour trouver celles qui contiennent le fragment d'ADN d'intérêt. Une fois que les cellules bactériennes avec l'ADN recombinant souhaité sont identifiées, les cellules sélectionnées peuvent être reproduites et, dans le processus, l'ADN souhaité est cloné.

Criblage de la bibliothèque d'ADN

Un certain nombre de techniques sont utilisées pour éliminer les cellules qui ne portent pas de plasmides avec un ADN source attaché. Une fois que ces cellules sont éliminées de l'examen, les cellules restantes sont criblées pour trouver celles qui contiennent les gènes d'intérêt.

Nourriture génétiquement modifiée

Bien que certains produits chimiques aient été produits en petites quantités à partir de micro-organismes génétiquement modifiés, des cultures telles que les navets, le riz, le soja, les pommes de terre, le coton, le maïs et le tabac peuvent générer des dizaines ou des centaines de kilogrammes de produits chimiques spécialisés par an. De telles cultures ont le potentiel de fournir les acides aminés essentiels, les acides gras et d'autres nutriments qui font actuellement défaut dans l'alimentation des populations des pays sous-développés et en développement. Les chercheurs ont également montré, par exemple, que les navets peuvent produire de l'interféron (un agent antiviral), que le tabac peut créer des anticorps pour lutter contre les maladies humaines, que les plantes de colza peuvent servir de source d'hormones cérébrales humaines et que les pommes de terre peuvent synthétiser de l'albumine sérique humaine qui est indiscernable de la véritable protéine du sang humain (figure 11.7b et c).

De nombreuses cultures GM ont également une valeur nutritionnelle accrue, mais peuvent être cultivées en utilisant des méthodes traditionnelles. Il existe de nombreuses préoccupations concernant le développement, la croissance et l'utilisation des aliments GM. Bien que les aliments génétiquement modifiés soient constitués des mêmes éléments constitutifs que tout autre type d'aliment, le public est généralement méfiant. Des pays ont refusé des expéditions entières d'aliments GM ciblés pour lutter contre la faim. Cependant, nous pouvons éventuellement arriver à un point où nous ne pouvons plus choisir d'éviter les aliments GM. Alors que la population humaine mondiale continue de croître, les aliments GM peuvent être un élément important pour répondre aux besoins alimentaires de la population humaine. Voici quelques-unes des questions soulevées au sujet des aliments génétiquement modifiés :

• La falsification des informations génétiques d'un organisme est-elle éthique ?

• Est-ce que quelqu'un ou une agence surveille ces cultures pour déterminer si elles se déplacent au-delà de leurs zones contrôlées ?

• Quelles précautions de sécurité doivent être prises pour éviter d'endommager les écosystèmes dans lesquels les cultures GM sont cultivées ?

• Quel type d'approbation ces produits devraient-ils exiger avant d'être vendus au public ?

• Est-il nécessaire d'étiqueter ces aliments comme génétiquement modifiés ?

Le domaine de la biotechnologie permet aux scientifiques et aux médecins de travailler ensemble et potentiellement de guérir des troubles génétiques. Contrairement aux maladies contagieuses, les maladies génétiques ne peuvent pas être transmises, car elles sont causées par une prédisposition génétique à un trouble particulier, et non par des organismes pathogènes distincts, tels que les bactéries et les virus. La thérapie génique implique l'insertion de gènes, la suppression de gènes et la manipulation de l'action des gènes afin de guérir ou d'atténuer les effets des maladies génétiques. Ces thérapies sont très nouvelles et expérimentales. Bien que ces pistes d'investigation créent de l'espoir, de nombreux problèmes doivent être résolus avant que la thérapie génique ne devienne un traitement fiable pour de nombreux troubles.

La stratégie de traitement d'une personne par thérapie génique varie en fonction du trouble. Lors de la conception d'un traitement de thérapie génique, les scientifiques doivent se demander quel est exactement le problème. Le gène mutant ne fonctionne-t-il pas du tout ? Fonctionne-t-il normalement mais il y a trop peu d'activité ? Y a-t-il trop de protéines produites ? Ou le gène agit-il d'une manière unique et nouvelle ? S'il n'y a pas d'activité génétique ou trop peu d'activité génétique, les scientifiques doivent introduire une version plus active du gène. S'il y a trop d'activité ou si le gène s'engage dans une nouvelle activité, cette activité excessive doit d'abord être arrêtée puis l'activité normale restaurée.

Pour empêcher un gène mutant de fonctionner, les scientifiques doivent le changer. Cela implique généralement l'insertion d'une mutation dans la région codant pour la protéine du gène ou la région qui est nécessaire pour activer le gène. Les scientifiques ont utilisé certains types de virus pour le faire dans des organismes autres que les humains. La difficulté de cette technique est de muter uniquement ce gène sans perturber les autres gènes et créer plus de mutations dans d'autres gènes. Développer des méthodes fiables pour y parvenir est un objectif majeur de la thérapie génique. Une fois le gène mutant réduit au silence, les scientifiques commencent le travail d'introduction d'une « bonne » copie du gène. Encore une fois, ce processus présente de nombreuses difficultés :

• Les scientifiques doivent trouver un moyen de renvoyer l'ADN corrigé dans la cellule.

• L'ADN corrigé doit faire partie de l'ADN de la cellule, afin qu'il soit transmis à chaque division cellulaire, qu'il n'interfère pas avec d'autres gènes et qu'il puisse être transcrit par la cellule au besoin (figure 11.8).

• Les cellules contenant l'ADN corrigé doivent être réintroduites chez le patient.

Une méthode pour introduire l'information génétique correcte dans une cellule consiste à utiliser un virus comme vecteur. Ici, un chien est traité pour une maladie dégénérative de la rétine. Le gène normal est épissé dans le génome viral. Le virus est ensuite utilisé pour infecter les cellules rétiniennes défectueuses. Lorsque le virus infecte les cellules rétiniennes, il transporte le gène fonctionnel dans la cellule.

Le clonage ne se réfère pas toujours à l'échange d'un seul gène. Un autre type de clonage est le clonage d'un organisme entier. Dans ce cas, le but est de créer un nouvel organisme génétiquement identique à l'organisme précédent. Le clonage d'organismes multicellulaires, tels que les protistes, les plantes, les champignons et de nombreux types d'animaux invertébrés, se produit souvent naturellement au cours de la reproduction asexuée et est facilement dupliqué dans les laboratoires. La technique utilisée pour réaliser le clonage chez les vertébrés est appelée transfert nucléaire de cellules somatiques. Le transfert nucléaire de cellules somatiques enlève un noyau d'une cellule de l'organisme qui sera clonée. Après traitement chimique, ce noyau est placé dans un ovule dont le noyau d'origine a été retiré. L'ovule utilisera le nouveau noyau comme information génétique. Dans des expériences de clonage réussies avec des mammifères, un choc électrique est utilisé pour stimuler l'œuf à commencer à se diviser comme s'il s'agissait d'un embryon normal. Après avoir transféré l'ovule avec son nouveau noyau dans un utérus, l'embryon se développe normalement. L'organisme résultant est génétiquement identique à l'organisme qui a donné le noyau.

En 1996, une équipe de scientifiques écossais a réalisé avec succès pour la première fois le transfert nucléaire de cellules somatiques chez le mouton. Le noyau a été prélevé sur la cellule mammaire d'un mouton adulte. L'embryon a été transplanté dans l'utérus d'une brebis, où il s'est développé normalement et est né (figure 11.9). Cette progéniture clonée s'appelait Dolly. Cette technique a été appliquée à de nombreux autres animaux, tels que les singes, les chèvres, les porcs, les vaches, les souris, les mules et les chevaux, et a été utilisée avec succès sur les humains. Cependant, pour des raisons éthiques, l'embryon humain a été créé à dessein avec une mutation qui a empêché l'embryon de se développer pleinement. Le taux de réussite du clonage des animaux est encore très faible pour n'importe quel animal, cependant seulement 3 à 5 % des œufs transplantés se transforment en adultes (figure 11.10).

FIGURE 11.9. Clonage d'un organisme

Le noyau du mouton donneur est combiné avec un œuf d'un autre mouton. Le noyau de l'œuf avait déjà été retiré. L'œuf, avec son nouveau noyau, est stimulé pour se développer par un choc électrique. Après plusieurs divisions cellulaires, l'embryon est implanté artificiellement dans l'utérus d'une brebis, qui portera à terme l'embryon en développement.

ILLUSTRATION 11.10. Taux de réussite dans le clonage de chats

Sur 87 embryons clonés implantés, CC (Copy Cat) est le seul à survivre. Ceci est comparable au taux de réussite chez les moutons, les souris, les vaches, les chèvres et les porcs. (a) Notez que CC est complètement différente de sa mère porteuse tabby. (b) "Rainbow" est son donneur génétique, et les deux sont des chats domestiques calicot à poils courts.

Une expérience de clonage a une grande importance scientifique, car elle représente une avancée dans la compréhension des scientifiques des processus de détermination et de différenciation. Rappelez-vous que la détermination est le processus par lequel passe une cellule pour sélectionner les gènes qu'elle exprimera. Une cellule différenciée est devenue un type cellulaire particulier en raison des protéines qu'elle exprime. La différenciation est plus ou moins une condition permanente. Les techniques qui ont produit Dolly et d'autres animaux clonés utilisent une cellule différenciée et inversent le processus de détermination, de sorte que cette cellule est capable d'exprimer tous les gènes nécessaires pour créer un organisme entièrement nouveau. Jusqu'à présent, les scientifiques n'étaient pas sûrs que cela soit possible.

9. Un scientifique peut cloner un gène. Un organisme peut être un clone. En quoi l'utilisation du mot clone est-elle différente dans ces cas ? En quoi l'utilisation du mot clone est-elle la même dans les deux utilisations ?

10. Quels sont certains des avantages de la création d'aliments génétiquement modifiés (GM) ? Quelles sont certaines des préoccupations?

11. Décrire comment les virus sont utilisés en thérapie génique.

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L'Encyclopédie du Projet Embryon

Dans la seconde moitié du XXe siècle, les scientifiques ont appris à cloner certaines espèces de mammifères. Les scientifiques ont appliqué le transfert nucléaire de cellules somatiques pour cloner des embryons humains et mammifères comme moyen de produire des cellules souches à usage médical et en laboratoire. Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) est une technologie appliquée au clonage, à la recherche sur les cellules souches et à la médecine régénérative. Les cellules somatiques sont des cellules qui sont passées par le processus de différenciation et ne sont pas des cellules germinales. Les cellules somatiques font don de leurs noyaux, que les scientifiques transplantent dans des ovules après avoir retiré leurs noyaux (ovules énucléés). Par conséquent, dans SCNT, les scientifiques remplacent le noyau d'un ovule par le noyau d'une cellule somatique.

Bien que Karl Illmensee ait cloné un mammifère pour la première fois en 1981, d'autres scientifiques avaient théorisé et développé les techniques nécessaires au SCNT sous forme de transfert nucléaire. Hans Spemann, qui a enseigné la zoologie à l'Université de Fribourg à Fribourg, en Allemagne, a théorisé sur SCNT dans son livre de 1938 Développement et induction embryonnaires. Spemann a proposé de transplanter un noyau d'une cellule déjà différenciée d'un embryon dans un ovule après avoir retiré le noyau de l'ovule. Cependant, la technologie requise pour ce genre d'expérience n'était pas disponible pour Spemann à cette époque, il ne pouvait donc pas tester sa théorie du transfert nucléaire ou SCNT. Robert King et Thomas Briggs ont développé le protocole nécessaire pour effectuer un transfert nucléaire préliminaire à l'Institut de recherche sur le cancer et à l'Institut de recherche de l'hôpital Lankenau à Philadelphie, Pennsylvanie, en 1952. Les mêmes techniques de transfert nucléaire servent de base au SCNT.

Tout en recherchant comment les embryons se différencient en 1952, Briggs et King ont transplanté le noyau d'une cellule blastula embryonnaire précoce d'un Rana pipiens embryon de grenouille à un œuf non fécondé après avoir retiré son noyau. Pour énucléer les œufs, Briggs et King ont utilisé une petite aiguille en verre pour percer la membrane cellulaire, pénétrer dans le cytoplasme et aspirer le noyau de l'ovule. Briggs et King ont ensuite transplanté le noyau du donneur à partir d'une cellule blastula distincte pour remplacer le noyau qu'ils ont retiré de l'ovule. Briggs et King ont observé que l'embryon se développait normalement.

Les chercheurs ont eu du mal à cloner des mammifères en utilisant la même procédure que Briggs et King ont utilisée sur les grenouilles. En 1975, Derek Bromhall à Oxford, au Royaume-Uni, a mené des expériences sur des embryons de lapin et a montré qu'après un certain stade de développement appelé stade morula, les embryons produits par transfert nucléaire mouraient. Bromhall a émis l'hypothèse qu'ils sont morts à la suite de complications dues aux perforations pratiquées dans la membrane cellulaire pendant le transfert.

Les scientifiques n'ont effectué le transfert nucléaire que sur des amphibiens jusqu'en 1981, lorsque Illmensee à Genève, en Suisse, a affirmé avoir cloné des souris en utilisant la technique de transfert nucléaire. Son travail a abouti à la naissance de trois souris vivantes. Les expériences d'Illmensee ont fait l'objet d'un examen minutieux et une enquête a été menée concernant la véracité de ses affirmations. Bien que les enquêteurs n'aient jamais trouvé de preuves concluantes contre Illmensee, l'enquête a jeté des doutes quant à savoir s'il avait ou non utilisé le transfert nucléaire pour cloner les souris.

Les scientifiques ont eu du mal à effectuer un transfert nucléaire sur des mammifères plus gros que des souris. Steen Willadsen de l'Institut de physiologie animale du Babraham Institute de Babraham, au Royaume-Uni, a été le premier à cloner un embryon de mouton en 1984. Willadsen a modifié la technique de Briggs et King. Après avoir transféré le noyau, Willadsen a fusionné l'embryon à l'aide d'un appareil d'électrofusion doté de petites électrodes produisant un courant électrique. Willadsen a enduit l'embryon d'une gelée d'agar à base d'algues pour réduire les dommages causés par l'entrée de l'aiguille de verre dans la membrane cellulaire. Une fois qu'il a enduit les embryons de gelée d'agar, Willadsen a placé les embryons dans les oviductes attachés d'un mouton, et il a observé que les embryons se développaient. À partir de cette expérience, Willadsen a fabriqué des embryons de mammifères viables en utilisant ses techniques modifiées, mais ils ne sont pas devenus des organismes adultes.

En 1996, Keith Campbell, Jim McWhir, William Ritchie et Ian Wilmut du Roslin Institute d'Édimbourg, au Royaume-Uni, ont utilisé des techniques de transfert nucléaire pour cloner un mouton né et devenir un adulte. L'équipe a manipulé une étape du cycle cellulaire appelée quiescence, lorsque la cellule subit une période d'hibernation supposée et cesse de se développer.Campbell a induit la quiescence dans les noyaux des blastocystes du donneur avant de les transférer dans les ovules receveurs en privant les cellules de protéines appelées facteurs de croissance. Le changement d'état des noyaux donneurs avant d'entrer dans les ovules receveurs a permis aux embryons de se développer jusqu'à terme chez les brebis porteuses.

Selon Wilmut, l'expérience suivante a appliqué la même procédure au noyau d'une cellule adulte entièrement différenciée par opposition à une cellule de blastocyste. L'équipe de Roslin a émis l'hypothèse que la procédure de transfert nucléaire lancée par Briggs et King pourrait être appliquée aux cellules somatiques, devenant ainsi un transfert nucléaire de cellules somatiques par opposition à un simple transfert nucléaire. L'Institut Roslin a réalisé cette étape en 1997. Le résultat de l'expérience était Dolly la brebis.

Dolly a été le premier mammifère cloné à partir d'une cellule adulte complètement différenciée. La principale différence dans les techniques de production de Dolly était que les scientifiques utilisaient des noyaux de cellules adultes par opposition aux noyaux de cellules embryonnaires utilisés dans les expériences précédentes sur les moutons. Après la naissance de Dolly, les scientifiques ont appliqué ces techniques à des embryons de mammifères génétiquement modifiés. La quiescence a permis aux scientifiques d'effectuer des modifications génétiques sur le noyau de la cellule car les facteurs de croissance n'altèrent pas l'ADN inséré. En 1997, une équipe de l'Institut Roslin a utilisé des techniques similaires pour modifier génétiquement le mouton Polly afin d'exprimer une protéine humaine. Après le succès de Dolly et Polly, certains scientifiques ont travaillé pour cloner des embryons humains à l'aide de SCNT, mais cette pratique a suscité des controverses sociales, éthiques et juridiques. Beaucoup n'étaient pas d'accord avec les affirmations selon lesquelles les scientifiques pourraient ou devraient cloner, ou peut-être modifier génétiquement, des humains à l'aide de SCNT.

Les scientifiques ont cherché des moyens de cloner des embryons humains sans provoquer de controverse. En 2011, Scott Noggle et son équipe de la New York Stem Cell Foundation à New York, New York, ont utilisé le SCNT pour récupérer des cellules souches embryonnaires humaines. Cependant, l'équipe de Noggle n'a pas effectué de SCNT en utilisant les mêmes méthodes que celles qui ont produit Dolly. En fait, Noggle et ses collègues visaient à éviter les implications sociales et éthiques du travail avec des embryons humains. Au lieu de retirer le noyau de l'ovule receveur avant le transfert, les scientifiques ont conservé le noyau de l'ovule et ont inséré le noyau du donneur dans l'ovule. En conséquence, l'embryon s'est développé au stade de blastocyste où les scientifiques ont pu extraire des cellules souches. Le nombre de chromosomes, cependant, était de soixante-neuf par opposition aux quarante-six normaux, car il contenait les chromosomes du noyau complet ainsi que le noyau de l'œuf, qui ne contient que la moitié, ou vingt-trois des chromosomes d'un zygote. . Ce résultat signifiait que le blastocyste ne pouvait pas entraîner une grossesse menant à la naissance car les cellules ne progresseraient pas vers un état de développement ultérieur. Les cellules souches embryonnaires sont dérivées de ces cellules de blastocyste.

Les scientifiques rapportent que la SCNT est une technique plausible pour créer des cellules souches embryonnaires humaines sans chromosomes supplémentaires. En 2013, des scientifiques de l'Oregon ont réussi à utiliser le SCNT pour reprogrammer des cellules somatiques afin qu'elles deviennent des cellules souches embryonnaires. Après avoir examiné les recherches de Noggle, Masahito Tachibana et son équipe du Centre national de recherche sur les primates de l'Oregon à Hillsboro, dans l'Oregon, ont utilisé les mêmes méthodes que Campbell et son équipe pour cloner Dolly, mais ils ont également ajouté quelques procédures supplémentaires. Les principales différences étaient qu'ils ont retiré l'appareil à fuseau, responsable du mouvement des chromosomes dans la mitose et la méiose cellulaires, de l'ovule du donneur avant de retirer le noyau de l'ovule. Ils ont réinséré l'appareil à fuseau dans la cellule lorsqu'ils ont inséré le noyau donneur. Après avoir retiré l'appareil à fuseau, ils ont également ajouté de la caféine, qui inhibe l'enzyme protéine phosphatase, qui active les protéines qui commencent la réplication cellulaire dans le cytoplasme. Parce que l'appareil à fuseau a été retiré et le cytoplasme inactivé, les scientifiques ont pu effectuer leurs procédures sans risque d'activation prématurée de la cellule entraînant des dommages cellulaires et la mort. Les résultats de l'expérience ont montré que les cellules modifiées par SCNT ont atteint le stade de blastocyste et ont produit des lignées de cellules souches embryonnaires viables avec un nombre de chromosomes normal. Depuis 2014, les médecins utilisent cette version de SCNT pour des thérapies et des traitements médicaux, décrits sous le nom de clonage thérapeutique.

Les controverses dues aux SCNT proviennent en grande partie de la possibilité de cloner des humains. En 2003, une société privée appelée Clonaid dont le siège est à Las Vegas, Nevada, a affirmé avoir cloné le premier bébé humain, appelé Eve, à l'aide de SCNT. Cependant, Clonaid n'a pas permis aux scientifiques d'effectuer un test ADN sur Eve pour confirmer qu'elle était bien un clone, et donc de nombreux membres de la communauté scientifique ont douté de leurs affirmations. À partir de 2014, des controverses ont surgi sur la possibilité de clones humains de SCNT. Certains ont critiqué les scientifiques qui ont utilisé le SCNT pour cloner des cellules souches humaines en Oregon. Les scientifiques de l'Oregon ont justifié leurs recherches en affirmant que leur seul objectif était de produire des cellules souches embryonnaires et non de produire un être humain pleinement développé.


Termes de biologie connexes

  • Cellule – L'unité biologique de base des êtres vivants.
  • Gamète – Un spermatozoïde ou un ovule.
  • Apoptose – Mort cellulaire programmée au cours de laquelle une cellule s'autodétruit.
  • Diploïde – Une cellule avec deux copies de chaque chromosome Les cellules somatiques sont diploïdes.

1. Quel type de cellule n'est PAS une cellule somatique ?
UNE. Leucocyte
B. Myocyte
C. Ostéoblaste
RÉ. Gamète

2. Quelle est la durée de vie approximative d'un érythrocytes ?
UNE. 3-4 jours
B. 5-9 jours
C. 100-120 jours
RÉ. 365-395 jours

3. Quelle est la fonction d'un ostéoclaste ?
UNE. Pour former et aider à maintenir l'os
B. Pour attacher à l'os et lui permettre de bouger
C. Pour résorber le vieil os
RÉ. Pour libérer les neurotransmetteurs



Commentaires:

  1. Sigiwald

    De manière improbable!

  2. Peverell

    Je suis désolé, mais, à mon avis, ils se sont trompés. Essayons d'en discuter. Écrivez-moi en MP, parlez.

  3. Yoramar

    Tout le monde n'est pas aussi facile que ça puisse paraître

  4. Zeleny

    Je suis d'accord, c'est une chose drôle.

  5. Huemac

    N'y a-t-il pas quelque chose comme ça ?



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