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Comment identifier le gène GPD lorsque la séquence varie entre les organismes ?

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Je lis un article sur la transformation génétique d'un champignon et le plasmide utilisé dans l'article utilise deux formes du même promoteur GPD (glycéraldéhyde3-phosphate déshydrogénase) pour piloter un gène GFP, l'un d'Agaricus bisporus et l'autre de Lentinula edodes (GenBank : GQ457137.1).

Cependant, j'ai remarqué que les séquences des promoteurs GPD susmentionnés ne correspondent pas à la séquence de référence dans GenBank (NC_007251.2) qui est elle-même dérivée d'un autre organisme.

Pourquoi y a-t-il différentes séquences pour le même promoteur ? De plus, comment identifier le gène GPD dans un autre organisme si je suis incapable de le comparer à une séquence connue ?

L'organisme que je souhaite transformer a eu son génome complet séquencé et ma transformation serait beaucoup plus efficace si je pouvais utiliser un promoteur natif comme GPD.


Je vous comprends peut-être mal ici, mais je déduis de vos liens ci-dessus que vous souhaitez faire correspondre les régions promotrices GPD de deux champignons (lointains liés) Agaricus bisporus et Lentinules edodes, au promoteur GPD de Leishmania majeure, qui appartient à un royaume complètement différent !

Les régions promotrices ont tendance à être relativement mal conservées entre les espèces par rapport aux régions codant pour les protéines, même pour les espèces étroitement apparentées. Compte tenu de la distance évolutive entre les espèces que vous mentionnez, la chance que vous trouviez une homologie entre leurs régions promotrices est probablement nulle.

De plus, comment identifier le gène GPD dans un autre organisme si je suis incapable de le comparer à une séquence connue ?

Ce que je ferais, c'est de prendre la séquence de protéine GPD traduite, qui pour Lentinules edodes serait GenBank BAA83550.1. Je l'utiliserais ensuite pour rechercher des correspondances de protéines en utilisant exploser, en particulier sous-ensemble pour Leishmania majeure; et utiliser le résultat pour localiser le gène codant dans le génome. Vous pouvez également le faire en une seule étape avec tblastn, qui recherche des correspondances dans une base de données de nucléotides traduite (voir cet exemple de requête tblastn).

Vous pouvez alors simplement prendre les 1000 pb environ en amont de la région codante pour représenter votre promoteur GPD.


9 : Conservation des protéines

  • Contribution de Clare M. O&rsquoConnor
  • Professeur agrégé émérite (biologie) au Boston College

A l'issue de ce laboratoire, les étudiants devraient être capables de :

  • identifier les acides aminés par leur code à 1 lettre.
  • expliquer les différences entre les scores élevés et faibles sur la matrice BLOSUM 62.
  • utiliser l'algorithme BLASTP pour comparer les séquences de protéines.
  • identifier les régions conservées dans un alignement de séquences multiples.

Au fur et à mesure que les espèces évoluent, leurs protéines changent. La vitesse à laquelle une séquence protéique individuelle change considérablement, reflétant les pressions évolutives que subissent les organismes et le rôle physiologique de la protéine. Notre objectif ce semestre est de déterminer si les protéines impliquées dans la biosynthèse de Met et Cys ont été fonctionnellement conservées entre S. pombe etS. cerevisiae, espèces qui sont séparées par près d'un milliard d'années d'évolution. Dans cet atelier, vous rechercherez dans les bases de données des homologues de S. cerevisiae séquences chez plusieurs espèces, dont S. pombe. Homologues sont des séquences d'ADN similaires qui descendent d'un gène commun. Lorsque des homologues sont trouvés dans différentes espèces, ils sont appelés orthologues.

Les homologues d'un même génome sont appelés paralogues. Paralogues surviennent par duplication de gènes, mais se diversifient avec le temps et assument des fonctions distinctes. Bien qu'une duplication complète du génome se soit produite au cours de l'évolution de S. cerevisiae (Kellis et al., 2004), seuls quelques gènes de la supervoie de la méthionine ont des paralogues. De façon intéressante, MET17 est paralogue à trois gènes impliqués dans le transfert du soufre : STR1 (CYS3), STR2 et STR4, reflétant de multiples duplications de gènes. La présence de ces quatre enzymes distinctes confère une flexibilité inhabituelle à S. cerevisiae dans son utilisation de sources de soufre. Les SAM1 et SAM2 les gènes sont également des paralogues, mais leurs séquences sont restées presque identiques, fournissant une redondance fonctionnelle si un gène est inactivé (chapitre 6).

Nos expériences de ce semestre testeront si les gènes impliqués dans la synthèse de Met et Cys ont été fonctionnellement conservés au cours de la divergence évolutive de S. cerevisiae et S. pombe . Divers algorithmes offrent aux chercheurs des outils pour étudier l'évolution des séquences protéiques. Dans cette représentation graphique des séquences Sam2p alignées de neuf organismes modèles divergents, la hauteur de la lettre reflète la fréquence d'un acide aminé particulier à cette position.

La fonction des protéines est intimement liée à leur structure. Vous vous souviendrez que la forme repliée finale d'une protéine est déterminée par sa séquence primaire, la séquence d'acides aminés. La fonctionnalité des protéines change moins rapidement au cours de l'évolution lorsque les substitutions d'acides aminés sont conservatrices. Des substitutions conservatrices se produisent lorsque la taille et la chimie d'une nouvelle chaîne latérale d'acides aminés sont similaires à celles qu'elle remplace. Dans ce laboratoire, nous commencerons par une discussion sur les chaînes latérales d'acides aminés. Vous utiliserez ensuite l'algorithme BLASTP pour identifier les orthologues dans plusieurs organismes modèles. Vous effectuerez un alignement de séquences multiples qui distinguera les régions qui sont plus hautement conservées que d'autres.

Au fur et à mesure des exercices, vous remarquerez que les séquences de protéines dans les bases de données sont écrites dans le code à 1 lettre. La connaissance du code à 1 lettre est une compétence essentielle pour les biologistes moléculaires d'aujourd'hui.


Fond

Les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) sont des structures répétitives chez les bactéries et les archées composées de séquences répétées exactes de 24 à 48 bases de long (appelées ici répétitions) séparées par des espaceurs uniques de longueur similaire (appelés ici espaceurs) [1, 2]. Les séquences CRISPR semblent être parmi les éléments évoluant le plus rapidement dans le génome, au point que des espèces et des souches étroitement apparentées, parfois identiques à plus de 99 % au niveau de l'ADN, diffèrent par leur composition CRISPR [3, 4].

Jusqu'à 45 familles de gènes, appelées séquences associées à CRISPR (CAS), apparaissent en conjonction avec ces répétitions et sont supposées être responsables de la propagation et du fonctionnement de CRISPR [2, 5, 6]. Il a été proposé que les CAS puissent être divisés en sept ou huit sous-types, selon leur organisation d'opéron et la phylogénie des gènes [5, 6]. L'analyse phylogénétique indique en outre que les CAS ont subi un important transfert horizontal de gènes, car des gènes CAS très similaires sont trouvés dans des organismes éloignés [6, 7]. Des CRISPR et des CAS ont été trouvés sur des éléments génétiques mobiles, tels que des plasmides, peau des éléments mobiles, et même des prophages, suggérant un mécanisme de distribution possible du système [7-9].

Il a été suggéré que les CRISPR jouent un rôle dans la partition des réplicons [1], la réparation de l'ADN [10], la régulation [5] et le réarrangement chromosomique [11]. Il a été récemment rapporté que les espaceurs sont souvent très similaires à des fragments d'ADN extrachromosomique, tels que l'ADN de phage ou de plasmide [3, 12]. Il a été suggéré que le système CRISPR/CAS participe à une réponse antivirale, probablement par un mécanisme de type ARN interférence. Le mécanisme proposé pour cette fonction CRISPR implique l'échantillonnage et le maintien d'un enregistrement des éléments d'ADN invasifs, et l'inhibition des fonctions géniques nécessaires à l'invasion [12]. En effet, il a été récemment montré que les CRISPR confèrent une résistance acquise aux virus chez les procaryotes [13].

Malgré des analyses approfondies des CAS, la nature des séquences répétées n'a pas été examinée de près. Ceci est probablement dû au fait que les répétitions, en tant que séquences d'ADN courtes, ont un potentiel comparatif moindre que les gènes codant pour les protéines. Des études antérieures ont seulement noté que les répétitions sont très variables et ne semblent pas être similaires entre les organismes [2, 7]. Cependant, nous montrons que les répétitions de divers organismes peuvent être regroupées en grappes en fonction de la similarité de séquence, et que certaines grappes ont des structures secondaires prononcées avec des changements de base compensatoires. Nous montrons en outre qu'il existe une correspondance claire entre les sous-types de CAS et les clusters répétés. Nos résultats ont des implications importantes pour la fonction et la diversité de CRISPR.


Considérations particulières

Annotation de plusieurs assemblages

Lorsque plusieurs assemblages de bonne qualité sont disponibles pour un organisme donné, l'annotation de l'ensemble se fait en coordination. Pour garantir que les régions correspondantes entre les assemblages sont annotées de la même manière, les assemblages sont alignés les uns par rapport aux autres avant l'annotation.

  • Les résultats de l'alignement assemblage-assemblage sont utilisés pour classer le transcrit et les alignements génomiques organisés : pour une séquence de requête donnée, les alignements vers les régions correspondantes de deux assemblages reçoivent le même classement.
  • Les loci correspondants de plusieurs assemblages se voient attribuer le même GeneID et le même type de locus.

Les alignements assemblage-assemblage sont disponibles via le service de remappage du génome NCBI.

Ré-annotation

Les organismes sont périodiquement réannotés lorsque de nouvelles preuves sont disponibles (par exemple, RNA-Seq) ou lorsqu'un nouvel assemblage est publié. Une attention particulière est accordée au suivi des modèles et des gènes d'une version de l'annotation à la suivante. Les modèles précédents et actuels annotés à des emplacements génomiques qui se chevauchent sont identifiés et le type de locus et le GeneID des modèles précédents sont pris en compte lors de l'attribution des GeneID aux nouveaux modèles. Si l'assemblage a été mis à jour entre les deux cycles d'annotation, les assemblages sont alignés les uns par rapport aux autres et les alignements utilisés pour faire correspondre les modèles précédents et actuels dans les régions mappées.


Résultats

Workflow bioinformatique pour la caractérisation moléculaire des événements de riz GM

De nombreux chercheurs ont des difficultés à gérer de grandes quantités de données bioinformatiques. Nous avons développé une méthode conviviale pour détecter les jonctions d'ADN-T insérées à l'aide de données NGS à la place des méthodes de détection conventionnelles. Un diagramme du flux de travail bioinformatique est présenté à la figure 1. Dans la première étape, des lectures d'extrémités appariées brutes qualifiées ont été alignées contre un vecteur plasmidique de transformation à l'aide du logiciel Burrows-Wheeler Aligner avec des correspondances exactes maximales (BWA-MEM) [22] . Comme la structure du vecteur plasmidique de transformation est circulaire, nous avons créé une séquence de référence de vecteur linéarisé (pPZP200) où les deux séquences de bordure gauche et droite contenaient 150 pb de l'extrémité opposée de la séquence plasmidique. Pour sélectionner ces lectures couvrant les jonctions, les lectures mappées ont été soustraites en fonction de leurs positions mappées, sur la base de l'emplacement de l'ADN-T (de 6392 à 10 291 pb). Ces lectures collectées ont été utilisées comme requêtes pour l'analyse BLASTN afin de classer les lectures faussement positives par rapport à un génome de riz de référence (O. sativa version 7.0) [23]. Comme l'ADN-T inséré est conçu pour contenir des éléments endogènes, les lectures contenant la séquence de promoteur endogène RbcS3 ont été soigneusement retirés sur la base du score de similarité de séquence (à la séquence de riz natif) pour réduire l'alignement ambigu. Les lectures restantes ont été alignées contre le vecteur transgénique et visualisées à l'aide d'IGV avec des lectures appariées. À partir des résultats, nous avons sélectionné des lectures de jonction qui correspondaient partiellement aux deux extrémités de l'ADN-T (c'est-à-dire des lectures qui couvraient à la fois l'ADN-T et le génome du riz) et extrait les séquences FASTA pour identifier l'ADN-T inséré dans la région de jonction du génome (Fig. 1).

Emplacement et numéro de copie de l'ADN-T

Environ 28 Go de données de séquence brutes, correspondant à une profondeur de séquençage de 72 ×, ont été obtenus à partir du cultivar parent témoin « Illmi ». De plus, 30 Go, 21 Go et 26 Go de données brutes ont été obtenus à partir de SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 et SNU-Bt9–109, respectivement, représentant environ 78×, 54× et 68× couverture du génome, respectivement (tableau 1).

À partir des étapes consécutives appliquées dans notre analyse de détection de jonction (comme décrit dans la section « Analyse du site d'insertion d'ADN-T » des Méthodes), 11 539 lectures ont été obtenues à partir du riz GM SNU-Bt9-5, dont 2790 lectures mappées appariées. De plus, 8371 et 9767 lectures ont été cartographiées à partir du riz GM SNU-Bt9-30 et SNU-Bt9-109, respectivement, comprenant respectivement 1792 et 2336 paires de lectures appropriées (tableau 2). De manière inattendue, 8125 lectures dérivées de « Illmi » de type sauvage ont été mappées sur les séquences du vecteur transgénique, dont seulement 648 paires de lectures appropriées. Les lectures appariées non appariées restantes étaient supposées être dues à une caractéristique des séquences Illumina qui peut être causée par une courte longueur de séquence. Il convient également de noter que notre construction d'ADN-T utilisée dans cette étude a été conçue pour contenir le gène du promoteur endogène du riz. rbcS3 (Os12g0291100), qui absorbe 1824 pb d'ADN-T et est exprimé sur le chromosome 12 du riz [24]. Pour éliminer les lectures faussement positives trompeuses provenant du génome natif (c'est-à-dire pas de l'ADN-T), chaque séquence cartographiée a été comparée à la séquence de référence du riz en utilisant BLASTN. Un total de 915, 1019, 729 et 899 lectures correspondant au riz Illmi, SNU-Bt9-5, SNU-Bt9-30 et SNU-Bt9-109, respectivement, tous alignés sur le chromosome 12 et ont été classés comme faux positifs.

Les lectures qui s'alignaient partiellement avec les deux extrémités de la région frontalière du transgène ont été collectées (Fig. 2a et b) en fonction de leur position cartographique. Ensuite, les lectures sélectionnées ont été alignées sur la séquence d'ADN-T entière pour identifier le site flanquant. Les résultats représentaient des jonctions d'insertion sur les chromosomes du riz (Fig. 2c). Lit les régions de jonction entre le génome de l'hôte et le transgène obtenu à partir du riz SNU-Bt9-5 parfaitement mappé sur le chromosome 10 du riz de 22 498 218 à 22 498 279 pb avec des délétions de 79 pb. L'événement riz SNU-Bt9-30 a été correctement mappé sur le chromosome 11 du riz de 22 473 585 à 22 473 636 pb avec des délétions de 51 pb (tableau 3 et figure 3). Les deux événements transgéniques ont détecté avec succès une seule copie et un seul locus dans le génome du riz, et les deux résultats étaient identiques à ceux obtenus par la méthode de détection basée sur le Southern blot [21].

Caractérisation moléculaire du riz transgénique à l'aide d'alignements de lecture NGS. une Illustration du plasmide de transformation pPZP200 contenant l'ADN-T utilisé pour Agrobactérie-transformation médiée pour créer SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 et SNU-Bt9–109. MCS, site de clonage multiple. b Exemple détaillé de résultats IGV. Les lignes horizontales sur la piste de séquence (en haut du panneau) indiquent la séquence de référence (c. Les pistes présentées présentent une orientation appariée (panneau supérieur = lecture 1, panneau inférieur = lecture 2). Les cases colorées indiquent la région de jonction contenant des lectures couvrant à la fois la bordure d'ADN-T et la séquence flanquante génomique. c Alignements de séquences de lectures couvrant la jonction (supérieure = séquences flanquantes de bordure gauche, inférieure = séquences flanquantes de bordure droite). Les nucléotides rouges et noirs indiquent respectivement le chromosome du riz et l'ADN-T

Représentation des loci déduits d'une insertion d'ADN-T dans un chromosome de riz

Bien que les sites d'intégration du riz SNU-Bt9-109 n'aient pas été identifiés à l'aide de la méthode décrite ici (tableau 3 et figure 3), le site d'intégration près de la bordure droite (RB) a été trouvé sur le chromosome 3 de 14 707 459 à 14 707 391 pb. Les séquences flanquantes près de la région de la bordure gauche (LB) n'ont pas été identifiées. L'analyse BLASTN (en utilisant la base de données NCBI nr) a montré que la jonction entre la région LB et le génome de l'hôte présentait une grande similarité avec le « Gene trapping Ds/T-DNA vector pDsG8 (e-value : 4e-28) » et le Solanum tuberosum gène inhibiteur de la protéinase (valeur e : 6e-28). Cependant, le S. tuberosum Le gène était considéré comme un artefact en raison de sa courte requête et de sa faible spécificité.

Pour valider les résultats ci-dessus, nous avons conçu des amorces basées sur les lectures de séquence de jonction obtenues (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Nos résultats de PCR ont vérifié que la détection d'insertion des deux événements de riz transgénique a été caractérisée avec succès à l'aide de NGS. De plus, la séquence de jonction de SNU-Bt-109 a également été détectée par PCR flanquant à l'aide de séquences LB voisines (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2).

Détermination du réarrangement de l'ADN-T

Pour déterminer la séquence d'ADN-T, nous avons calculé les distributions de taille d'insert à l'aide de lectures de paires mappées contre l'ADN plasmidique transgénique (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). En calculant la taille de l'insert, il est possible de décider si l'ADN inséré a été réarrangé. Les tailles moyennes des inserts étaient de 479, 469 et 535 pb pour SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 et SNU-Bt9–109, respectivement, ce qui correspondait correctement aux tailles préparées dans la construction de la bibliothèque (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4 ). Il a supposé qu'il n'y avait pas de réarrangements internes ou de duplications à l'intérieur de l'ADN-T. Les résultats correspondent à ceux de la récupération d'ADN-T entier par PCR d'ADN génomique et analyse de séquençage dans notre article précédent [21].

Présence possible de séquences de squelette dans les plantes transgéniques

Des changements génomiques involontaires peuvent se produire pendant le développement de nouvelles plantes GM. Il est possible que les séquences du squelette plasmidique soient intégrées dans le génome d'un hôte pendant Agrobactérie-transformation médiée [10]. Par conséquent, les alignements de séquences ont été visualisés avec IGV pour détecter une éventuelle contamination des squelettes plasmidiques. Aucune lecture n'a été mappée sur la structure du squelette du plasmide (Fichier supplémentaire 1 : Figures S5 et S6). Cette découverte démontre que les séquences dérivées du squelette n'ont pas été introduites dans ces génomes transgéniques.


Utiliser le génome du canari pour déchiffrer l'évolution de la régulation des gènes hormono-sensibles chez les oiseaux chanteurs saisonniers

Fond: Alors que le chant de tous les oiseaux chanteurs est contrôlé par le même circuit neuronal, la dépendance hormonale du comportement de chant varie considérablement d'une espèce à l'autre. Pour cette raison, les oiseaux chanteurs sont des organismes idéaux pour étudier les mécanismes ultimes et proches du comportement hormono-dépendant et de la plasticité neuronale.

Résultats: Nous présentons l'assemblage et l'annotation de haute qualité d'un génome de canari femelle de 1,2 Gbp. Les alignements de génomes entiers entre le canari et 13 génomes dans tous les taxons d'oiseaux montrent une synténie très conservée, alors qu'à la résolution à base unique, il existe des différences considérables entre les espèces. Ces différences ont un impact sur les petits motifs de séquence tels que les sites de liaison des facteurs de transcription tels que les éléments de réponse aux œstrogènes et les éléments de réponse aux androgènes. Pour relier ces éléments de réponse spécifiques à l'espèce à la sensibilité aux hormones du comportement de chant du canari, nous identifions les transcriptomes saisonniers sensibles à la testostérone des principales régions cérébrales liées au chant, HVC et RA, et trouvons les réseaux de gènes saisonniers liés à la différenciation neuronale uniquement dans le HVC. Les réseaux de gènes régulés à la hausse sensibles à la testostérone de HVC de mâles chanteurs concernaient la différenciation neuronale. Parmi les gènes régulés par la testostérone du VHC canari, 20 % manquent d'éléments de réponse aux œstrogènes et 4 à 8 % manquent d'éléments de réponse aux androgènes dans les promoteurs orthologues chez le diamant mandarin.

Conclusion : La séquence du génome du canari et l'analyse complémentaire de l'expression révèlent des changements évolutifs intrarégionaux dans un circuit neuronal multirégional contrôlant le comportement de chant saisonnier et identifient l'évolution des gènes liés à la sensibilité aux hormones de ce comportement de chant saisonnier. De tels gènes qui sont sensibles à la testostérone et aux œstrogènes spécifiquement chez le canari et qui sont impliqués dans le recâblage des neurones pourraient être cruciaux pour la re-différenciation saisonnière de la structuration des chants saisonniers sous-jacents du HVC.


Sérologie : Aperçu

Autres fluides corporels

Le profilage ADN a été réalisé avec succès sur un large éventail de fluides corporels et de tissus pour lesquels il n'existe pas de tests communs. Les exemples incluent la peau (y compris les pellicules), la transpiration, le mucus nasal, le pus, le lait maternel et le cérumen. Pour la plupart, l'origine biologique dans ces cas est déduite de l'apparence du matériau ou de son emplacement sur l'article testé, par exemple, la transpiration des bandes de chapeau, le mucus nasal sur les tissus, etc. Il y a peu de demandes de tests spécifiques pour déterminer l'identité cellulaire de ces matériaux, cependant, chacun a une biochimie caractéristique qui pourrait être exploitée pour développer un test d'identification si cela s'avérait nécessaire.


Résultats et discussion

Nous avons choisi le 5 ′ -UTR du bien étudié S. cerevisiae CYC1 promoteur [15, 16]. Nous avons fusionné pCYC1min (à partir de la position -143) à une protéine fluorescente verte améliorée par la levure (yEGFP) [17] et le CYC1 terminateur. Par rapport à l'ensemble CYC1 promoteur, pCYC1min contient deux des trois boîtes TATA et aucune séquence d'activation en amont. pCYC1min est un promoteur modérément faible et, pour cette raison, semble être un candidat idéal pour détecter à la fois les effets positifs et négatifs des mutations ponctuelles dans la séquence leader sur l'expression de la protéine rapporteur en aval. Les CYC1 le promoteur 5'-UTR a une longueur de 71 nucléotides.

Dans l'analyse qui suit, nous nous référons à la partie de CYC1 5 ′ -UTR aux positions -1 à -8 comme séquence de Kozak étendue et qu'à -9 à -15 comme région amont. Dans la séquence étendue de Kozak, l'adénine est fortement conservée en cinq positions, tandis que dans la région amont, aucun nucléotide n'est fortement conservé. Cependant, l'adénine est la plus fréquente sur presque tous les sites (voir Contexte).

La séquence de Kozak étendue

L'original CYC1 la séquence des positions -15 à -1 est CACACTAAATTAATA (ci-après dénommé k 0). Selon Dvir et al. [9], la présence d'une adénine aux positions -1, -3 et -4, ainsi que l'absence de guanine en position -2, devraient rendre cette séquence leader presque optimale pour une expression élevée. Cependant, la thymine en position -2 et la cytosine en position -13 ont une fréquence inférieure à 20 % et 10 %, respectivement, parmi les fortement exprimés S. cerevisiae gènes [8]. Nous avons construit notre premier synthétique CYC1 séquence de tête (k 1) en plaçant une adénine à chaque position de -1 à -15.

Le niveau de fluorescence associé à k 1 était de 6,5 % supérieur à celui mesuré avec k 0. Cependant, aucune différence statistiquement significative n'est ressortie des données recueillies sur ces deux séquences leader (p-valeur = 0,13). nous avons gardé k 1 (la séquence leader optimisée) comme modèle pour nos prochaines constructions synthétiques et construit 57 autres 5 ′ -UTR synthétiques en mutant un ou plusieurs nucléotides dans k 1.

Le premier groupe de séquences leader synthétiques a été constitué par une mutation ponctuelle unique de la position -1 à la position -8 (voir tableau 1). Par conséquent, nous avons modifié uniquement la séquence Kozak étendue, tandis que la région en amont a été maintenue dans une configuration optimisée pour une expression génique élevée avec des adénines aux positions -9 à -15.

La fluorescence la plus élevée a été enregistrée pour k 16 (où une guanine a substitué l'adénine en position -5) et le plus bas par k 9 (où une thymine a remplacé l'adénine en position -3). De plus, le niveau de fluorescence de k 16 était statistiquement significativement différente de celle de k 0 et k 1. Une amélioration de la fluorescence due à une guanine en position -5 était un résultat surprenant car la guanine est le nucléotide le moins fréquent chez la levure S. cerevisiae séquences de tête. De plus, aucune guanine n'a jamais été détectée à cette position parmi les gènes fortement exprimés [8] ni n'a provoqué d'amélioration de fluorescence dans les travaux de Dvir et al. [9].

Malgré l'absence de différence statistiquement significative par rapport à k 1, les seules constructions autres que k 16 qui a entraîné une augmentation de >5 % au niveau de fluorescence de k 1 étaient k 3, k 10, et k 24. En particulier, dans k 3, une thymine a remplacé une adénine en position -1 et en k 10 l'adénine en position -3 a été mutée en une guanine. Comme indiqué ci-dessus, l'adénine aux positions -1 et -3 devrait garantir une expression génique élevée. Néanmoins, sur un tel fond d'adénine, des nucléotides moins fréquents aux positions -1 ou -3 semblent être nécessaires pour améliorer davantage l'expression des gènes. En revanche, une thymine au lieu d'une adénine en position -3 (k 9) était la seule mutation qui a induit un >5 % réduction de k 1 niveau de fluorescence. Ce résultat est cohérent avec l'observation dans [9] qu'une thymine en position -3 est abondante dans les gènes faiblement exprimés (Fig. 1 a).

Effet des mutations ponctuelles dans la séquence étendue de Kozak sur l'expression de la fluorescence. Les niveaux de fluorescence sont tracés par rapport à k 1 (une) et k 0 (b). Le contrôle correspond à une souche de levure sans le gène yEGFP. Le nucléotide qui a remplacé une adénine dans k 1 et la position à laquelle la mutation a eu lieu sont données sous le nom de chaque séquence leader synthétique. astérisques, p-valeur <0.05 vs. k 1 (une) ou k 0 (b)

En ce qui concerne k 0, les 25 nouvelles séquences de tête synthétiques contenaient entre six et huit mutations. En dehors de k 9, tous les 5 ′ -UTR synthétiques ont montré un niveau de fluorescence supérieur à celui de k 0, dont cinq étaient significativement plus élevés. Ceux-ci comprenaient les positions -1, -4 et -5. Comme déjà noté dans la comparaison avec k 1, une adénine juste en amont du codon START ne semble pas présenter d'intérêt particulier pour l'expression des gènes. Ici, une cytosine et une thymine (k 2 et k 3, respectivement) a donné de bien meilleurs résultats qu'une adénine. Cependant, en ce qui concerne k 0, il y avait sept autres mutations ponctuelles en amont. En position -4 une thymine (k 12) a entraîné l'augmentation de fluorescence la plus élevée, alors qu'à la position -5, à la fois une cytosine (k 14) et une guanine (k 16) fluorescence améliorée jusqu'à >10 % au-dessus de celui de k 0. Depuis k 0 a une thymine aux positions -2, -5 et -6, chacun des cinq 5 ′ -UTR synthétiques qui ont montré des différences statistiquement significatives par rapport à k 0 ont été affectés par une mutation ponctuelle sur deux sites adjacents ou plus. Trois séquences leader synthétiques supplémentaires (k 10,k 17, et k 24) a causé un >10 % augmentation de la fluorescence par rapport à k 0, bien que ces différences ne soient pas significatives (p-valeur >0.05). k 10 et k 17 présentaient également des mutations ponctuelles doubles sur des sites adjacents (Fig. 1 b).

Mutations multiples à la guanine

L'analyse de nos 25 premières séquences synthétiques 5 -UTR a donné le résultat surprenant qu'une mutation ponctuelle unique en guanine, qui est essentiellement absente de la séquence étendue de Kozak de S. cerevisiae gènes-peut augmenter le niveau de fluorescence de k 1, une séquence leader optimisée pour l'expression génique. De plus, cinq de nos 5 ′ -UTR synthétiques sans ambiguïté (>9 %) a augmenté le niveau de fluorescence associé à pCYC1min.

Selon nos données, une seule mutation en guanine peut améliorer l'expression des gènes. Cependant, deux articles précédents [18, 19] ont rapporté que plusieurs guanines placées devant un codon START réduiraient considérablement la synthèse des protéines. Par conséquent, nous avons évalué comment plusieurs mutations ponctuelles de la guanine affectaient l'efficacité de la traduction de pCYC1min, afin de déterminer si elles pouvaient être utilisées pour moduler l'expression des gènes.

D'après [8], parmi les S. cerevisiae gènes, la guanine est le nucléotide le moins fréquent entre les positions -1 et -15, à l'exception de la position -7, dans laquelle le nucléotide le moins fréquent est la cytosine. Nous avons construit un 5 ′ -UTR synthétique qui reflète cette séquence (k 26 Tableau 2). Cette expression génique arrêtée, comme le montre le niveau de fluorescence correspondant n'étant pas significativement différent (p-valeur =0,21) de notre contrôle négatif (un S. cerevisiae souche qui ne contenait pas le gène yEGFP).

Nous avons testé si plusieurs mutations de la guanine (cytosine en position -7) affecteraient l'expression des gènes d'une manière différente lorsqu'elles couvraient soit la totalité de la séquence Kozak étendue (k 27) ou la région amont (k 28). Étant donné que des mutations ont été faites en ce qui concerne k 1, tous les sites non mutés contenaient une adénine. Étonnamment, nous avons constaté que les deux configurations étaient équivalentes pour l'expression des gènes (p-value >0.40) et réduit k 1 niveau de fluorescence d'environ la moitié.

Partant de k 27, nous avons remplacé la guanine aux positions -1 (k 29), −2 (k 30) et -3 (k 31) avec une adénine pour déterminer si une seule adénine aux trois positions juste en amont du codon START augmenterait l'expression de fluorescence lorsque les autres sites de la séquence Kozak étendue étaient occupés soit par une guanine soit par une cytosine. A la position -1 une adénine n'a montré aucune amélioration sur la fluorescence de k 27. Fait intéressant, aux positions -2 et -3, une adénine a provoqué une baisse de l'expression des gènes à environ 7 % du k 1 niveau de fluorescence. Ces résultats démontrent qu'une adénine en soi ne peut pas améliorer l'expression du gène même lorsqu'il occupe la position -3 ou -1. Plus généralement, nous pouvons conclure que l'effet sur l'expression génique d'une mutation ponctuelle unique dans la séquence leader est fortement dépendant du contexte.

Enfin, pour mieux comprendre l'importance de la région amont pour l'expression des gènes, nous avons progressivement réduit le nombre de guanines de sept (k 28) à une (k 38). En partant de la position -9, nous avons remplacé une guanine par une adénine à chaque étape et avons vu que le niveau de fluorescence augmentait presque linéairement avec le nombre d'adénines (Fig. 2 et Fiche complémentaire 1). La dernière séquence dans laquelle le niveau de fluorescence était statistiquement significativement différent de celui de k 1 était k 36, dans laquelle les guanines étaient présentes aux positions -13 à -15. Une guanine seule à la position -15 ou accompagnée d'une autre à la position -14 n'a pas entraîné de différence significative du niveau de fluorescence par rapport à celui de k 1. Par conséquent, même en présence d'une séquence Kozak étendue optimisée pour une expression génique élevée, de multiples mutations dans la région en amont ont des répercussions évidentes sur la synthèse des protéines et peuvent être utilisées comme moyen d'ajuster l'abondance des protéines. Une explication de ce résultat est présentée dans la section Analyse computationnelle ci-dessous. Fait intéressant, quatre guanines mélangées avec des adénines (k 33) dans la région amont réduite k 1 fluorescence dans une moindre mesure que quatre guanines d'affilée (k 32), fournissant une confirmation supplémentaire que l'effet sur l'expression génique des mutations ponctuelles à l'intérieur de la 5 ′ -UTR dépend fortement du contexte nucléotidique (Fig. 2 voir le fichier supplémentaire 1 pour une comparaison avec k 0 fluorescence).

Mutations ponctuelles multiples en guanine. Le rapport entre le niveau de fluorescence des 5 ′ -UTR synthétiques de k 26 à k 38 et celui de k 1 sont rapportés. Le nombre d'adénines ou de guanines dans la région amont est indiqué sous le nom de la séquence de tête (de k 27 à k 38). Les indices -1, -2 et -3 indiquent qu'une adénine est présente dans la séquence Kozak étendue uniquement à la position correspondante. Indice je représente entremêlé (voir texte principal). Astérisques, p-valeur <0.05 vs. k 1

La région amont

L'analyse précédente a confirmé que l'effet sur l'expression génique dû à la fois à des mutations simples et multiples dans le 5 ′ -UTR est fortement dépendant du contexte. De plus, nos données ont clairement montré que les changements non seulement dans la séquence de Kozak mais aussi à l'intérieur de la région en amont affectent de manière marquée l'expression des gènes. Nous avons donc effectué des mutations ponctuelles sur k 1 entre les positions -9 et -15 (tableau 3) pour évaluer si un seul nucléotide différent de l'adénine peut modifier la vitesse de traduction lorsqu'il est placé dans la région en amont.

Toutes les mutations ponctuelles (sauf celle dans k 38) a entraîné un niveau de fluorescence supérieur à celui associé à k 1. Notamment, dans huit cas, l'augmentation de la fluorescence était statistiquement significative (>10 % plus haut que k 1 fluorescence). Ces huit mutations comprenaient quatre positions contiguës, de -11 à -14. Aucun de ceux-ci n'a été pris en compte dans l'ouvrage de référence de Dvir et al. [9].

En position -11, une guanine au lieu d'une adénine (k 47) expression de fluorescence améliorée par >15 %, alors que la cytosine et la thymine n'ont eu aucun effet significatif. Chaque mutation à la position -12 a augmenté la fluorescence de k 1. Le plus grand changement (>15 %) était due à une guanine (k 50). Les mutations en position -13 sont également fortement améliorées k 1 niveau de fluorescence. Deux mutations ponctuelles—cytosine (k 51) et la guanine (k 53) - a entraîné des différences statistiquement significatives dans la fluorescence de k 1, tandis qu'une thymine (k 52) augmenté k 1 fluorescence d'environ 14 % mais cela n'a pas atteint la signification statistique. Il est à noter que parmi l'ensemble de nos 58 5 ′ -UTR synthétiques, k 51 avait le niveau de fluorescence le plus élevé - près de 17 % supérieur à celui de k 1.

Enfin, deux mutations ponctuelles différentes en position -14 ont conduit à une augmentation de la fluorescence : une cytosine (k 54) et une thymine (k 55) (Fig. 3 voir le fichier supplémentaire 1 pour une comparaison avec k 0).

Effet des mutations ponctuelles dans la région amont sur la fluorescence par rapport à k 1. The nucleotide that replaced an adenine in k 1 and the position at which the mutation took place are given below the name of each synthetic leader sequence. Asterisks, p-value <0.05 vs. k 1

Together, the results of this last analysis of the upstream region underline another surprising result: single point mutations upstream of the Kozak sequence, in particular at positions −12 and −13, were those that most enhanced gene expression from a context rich in adenines.

Computational analysis

We carried out simulations with RNAfold to investigate possible correlations between computed mRNA secondary structures, together with their corresponding minimum free energies (MFEs), and measured fluorescence levels. Our analysis provides an explanation for the drop in fluorescence due to multiple mutations from adenine to guanine (and cytosine) in the −15…−1 region. In contrast, no plausible justification for the effects of single point mutations on translational efficiency emerged from simulations with RNAfold.

As an input for RNAfold, we used mRNA sequences starting at the transcription start site of pCYC1min [16] and ending at the poly-A site of the CYC1 terminator [20]. Each sequence was 937 nucleotides long. From preliminary simulations, we observed that a poly-A chain with a variable length of 150–200 nucleotides had no significant effect on mRNA folding. All mRNA secondary structures were calculated at 30 °C (the temperature at which we grew S. cerevisiae cells for the FACS experiments).

k 0 et k 1 have the same MFE: −241.21 kcal/mol. This is the highest—and the most common—within the collection of 59 sequences analyzed in this work (see Additional file 1). The mRNA secondary structure corresponding to this MFE is characterized by the presence of a giant hairpin between positions −40 and +10. The hairpin loop goes from position −31 to position +1 and contains the whole 5 ′ -UTR portion we have targeted here. The hairpin stem is made of nine base-pairs, of which only one gave a “mismatch” because of an adenine at position −38 and +8 (see Fig. 4 a).

mRNA secondary structures. une UNE giant hairpin is present in the mRNA secondary structure corresponding to the MFE of both k 0 et k 1. The hairpin loop contains the −15…−1 region. The portion of the 5 ′ -UTR in our analysis is free from any pairing interactions in its wild-type configuration (k 0) and in that theoretically optimized for high protein expression (k 1). The loop of the giant hairpin is reduced in k 4 owing to the base-pairing interaction between the guanine at position −1 and the cytosine at position −31. In every mRNA structure presented, a green arrow indicates position +1, and a red arrow indicates position −15. b The disruption of the giant hairpin induces a decrease in the MFE of the mRNA secondary structure. k 26 et k 31 are associated with the lowest MFEs computed in our analysis. The two sequences contain multiple guanines in the extended Kozak sequence involved in pairing interactions with the CDS. A similar pattern is also present in k 30. Here, however, a second mini-loop around the START codon provokes an increase in MFE. The MFE of k 26 is substantially lower than those of k 30 et k 31 because of the presence of another stem due to pairing interactions between the upstream region and the CYC1 terminateur. Nevertheless, the fluorescence levels of k 30 et k 31 are only approximately 1.2-fold higher than that of k 26

Multiple mutations to guanines either in the upstream region or the extended Kozak sequence originate base-pairing interactions between, at least, a portion of the −15…−1 region and the CDS (yEGFP) or the CYC1 terminateur. As a consequence, the giant hairpin is destroyed and replaced by one or two stems that lower the MFE of the mRNA secondary structure (Table 2). Most of the MFE values smaller than −241.21 kcal/mol were associated with fluorescence levels lower than that of k 1 (Fig. 5). This result is in agreement with the notion, supported also by [8, 9], that stable mRNA secondary structures in the 5 ′ -UTR reduce protein expression. However, the fluorescence levels we measured did not increase proportionally to increments in the MFE. Moreover, in two cases (k 32 et k 36) RNAfold predicted a giant hairpin in the mRNA structure, whereas the fluorescence levels from our experiments were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5 and Additional file 1).

Low MFE values are associated with reduced fluorescence expression. Red bars, difference between MFEs of the corresponding 5 ′ -UTR and k 1 (??MFE). Blue bars, 10-fold magnified ratio between the fluorescence level of the indicated 5 ′ -UTR and that of k 1. En dehors de k 1, sequences are sorted by increasing ??MFE. All sequences except k 4 contain multiple point mutations with respect to k 1. Asterisks above blue bars, p-value <0.05 vs. k 1

k 26 was designed by choosing the least frequent nucleotides between positions −15 and −1 among a set of highly expressed S. cerevisiae gènes. The corresponding MFE (−261.39 kcal/mol) was the lowest within the ensemble of transcription units considered in this work. No giant hairpin was present in the MFE mRNA secondary structure as the −15…−1 region was sequestered into two different stems. The guanines between positions −1 and −6 were part of a long stem and paired with a hexamer at the beginning of the yEGFP sequence (positions +33 to +38). In contrast, positions −9 to −15 paired with a region of the CYC1 terminator, at positions +750 to +758 (Fig. 4 b).

A fluorescence level just above that of k 26 was registered for k 30 et k 31. Both differed from k 26 for the upstream region (made of seven adenines) and the presence of an adenine in the extended Kozak region (at positions −2 and −3, respectively). Similaire à k 26, the first five nucleotides of the extended Kozak region of k 30 and the first six of k 31 were sequestered into a stem with the CDS. However, differently from k 26, the upstream regions of k 30 et k 31 were entirely free from any pairing interactions (see Fig. 4 b). Their MFEs (−244.28 and −247.26 kcal/mol, respectively) were also significantly higher than that of k 26. These three sequences suggest that a condition for markedly lowering protein expression is to enclose the nucleotides at positions −1 to −5 in an mRNA secondary structure. Moreover, not all of these nucleotides have to participate in base-pairing interactions. Indeed, a guanine at position −1 (k 30) or −2 (k 26 et k 31) is “free” and responsible for the presence of a mini-loop in the mRNA structure.

However, this hypothesis is contradicted by k 29. The MFE of this sequence (−245.97 kcal/mol) is comparable to that of k 30 et k 31, and the corresponding mRNA secondary structure is very similar to that of k 31 (Fig. 6 a). Nevertheless, the fluorescence level associated with k 29 was more than 6-fold higher than that of k 31 and amounted to 45% of that of k 1.

mRNA secondary structures. une k 27 diffère de k 29 only by a guanine instead of an adenine at position −1. However, their mRNA secondary structures are dissimilar. Dans k 27, the extended Kozak sequence is involved in base-pairing interactions with the CYC1 terminator, whereas in k 29 the extended Kozak sequence is locked into a stem with the CDS. The MFE associated with k 27 is lower than that of k 29, but there is no difference between the fluorescence levels of the two sequences (p-value =0.20). b Multiple guanines in the upstream region give rise to mRNA structures characterized by base-pairing interactions between the 5 ′ -UTR and the CYC1 terminateur. k 28 et k 34 have six guanines in a stem with the CYC1 terminator, whereas k 35 has only 5 guanines in an analogous structure. This causes an increase in MFE and consequently a higher fluorescence

k 27 shared with k 29k 31 an upstream region made only of adenines. However, unlike in these three sequences, the extended Kozak sequence of k 27 did not contain any adenine. The MFE of k 27 (−247.04 kcal/mol) was comparable to that of k 29k 31, but its corresponding mRNA secondary structure had a different configuration. Indeed, all nucleotides of the extended Kozak sequence (with the exception of the cytosine at position −7) were involved in base-pairing interaction not with the CDS but with the CYC1 terminator (positions +755 to +762 Fig. 6 a). The fluorescence level of k 27 was slightly higher than that of k 29, i.e. almost 7-fold greater than that of k 31.

The five sequences considered so far (k 26, k 27, k 29k 31) have in common an extended Kozak region rich in guanine that was sequestered into a stem in the MFE mRNA secondary structure. In four cases, the extended Kozak sequence paired (partially) with the CDS, and in one case (k 27) with the CYC1 terminateur. The MFE of k 26 was the lowest, as its upstream region was also sequestered into a stem. The other four sequences showed very similar MFE values but rather different fluorescence levels.

The other group of sequences affected by multiple mutations with respect to k 1 had only adenines in the extended Kozak sequence and a variable number of guanines in the upstream region.

k 28, k 34, et k 35 had, respectively, 7, 6, and 5 guanines in a row from position −15 downstream. Although the MFE of k 35 was clearly higher than that of k 28 et k 34 (Table 2), the three sequences gave rise to similar mRNA structures where at least five guanines of the upstream region (plus the first adenine downstream) were locked into a stem due to base-pairing interactions with the CYC1 terminator (see Fig. 6 b).

Interestingly, both the MFE and fluorescence level of k 28 were comparable to those of k 27 et k 29. Hence, even if the Kozak sequence was free of pairing interactions, the sequestering of the upstream region into a stem was enough to guarantee a clear drop in protein expression. This is further confirmation of the role played by the nucleotides upstream of the Kozak sequence in tuning protein expression.

A different MFE mRNA secondary structure was obtained for k 33 (four guanines, intermixed with adenines), in which half of the extended Kozak sequence and almost the whole upstream region were involved in base-pairing interactions with the CDS, giving rise to a long stem. However, compared to k 35, where only five nucleotides of the upstream region were locked into a stem with the CYC1 terminator, k 33 showed a higher MFE as well as a higher fluorescence level (Fig. 5 and Additional file 1).

Finally, for k 32, k 36, et k 37 (with four, three, and two guanines in the upstream region, respectively) RNAfold returned the same MFE as for k 1. The corresponding mRNA secondary structures were all characterized by the presence of the the giant hairpin (see Additional file 1). Compared to our experimental data, this result was plausible only for k 37 but in apparent disagreement with the measurements for k 32 et k 36, whose fluorescence levels were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5). In particular, the fluorescence of k 32 only corresponded to about 69% of that of k 1. Therefore, it can be argued that in vivo k 32 et k 1 share the same MFE and mRNA secondary structure, as suggested by the in silico simulations.

In contrast to the multiple point mutations, of the single point mutations on k 1, seul k 4 caused a modification in the structure of the giant hairpin and a consequent decrease in the MFE. k 4 carries a guanine at position −1 that pairs with the cytosine at position −31 such that the length of the loop is reduced from 32 to 29 nucleotides and the MFE is lowered to −241.42 kcal/mol (Fig. 4 a). According to our data, this minimal change has no effect on fluorescence expression. All the other point mutations that induced a fluorescence level significantly higher than that of k 1 (namely, k 16, k 47k 51, et k 53k 55) were characterized by the same MFE and corresponding mRNA secondary structure as k 1, according to the RNAfold simulations.


The next steps: making new DNA

One of the original DNA strands is used as a template for the synthesis of new DNA. The primers anneal to the template strand, and the DNA polymerase enzyme makes a new strand of DNA by creating a complementary sequence of nucleotides drawn from the reaction mixture.

The new DNA strand is made by complementary base pairing with the original DNA template. Because all four ordinary DNA nucleotides are present in large amounts, the chain elongation continues normally – until by chance a dideoxynucleotide (terminator) is added in the place of a normal DNA nucleotide.

The dideoxynucleotides are just like ordinary DNA nucleotides except that one hydroxyl (OH) group has been chemically changed to a hydrogen (H). With normal DNA nucleotides, one nucleotide can be attached to another and so on, forming a chain. The chemical change in a dideoxynucleotide, however, means that no additional nucleotides can be added, hence the name ‘terminator nucleotides’.

The synthesis of new DNA is terminated when one of the dideoxynucleotides is added to the strand. Because there are many more ordinary nucleotides than dideoxynucleotides, some chains will be several hundred nucleotides long before a dideoxynucleotide is added. The end result is a whole lot of new DNA fragments, of varying length, all ending with a dideoxynucleotide.


How to identify the GPD gene when the sequence varies between organisms? - La biologie

Proteomics is the study of the entire set of proteins produced by a cell type in order to understand its structure and function.

Objectifs d'apprentissage

Explain how the field of genomics led to the development of proteomics

Points clés à retenir

Points clés

  • Proteomics investigates how proteins affect and are affected by cell processes or the external environment.
  • Within an individual organism, the genome is constant, but the proteome varies and is dynamic.
  • Every cell in an individual organism has the same set of genes, but the set of proteins produced in different tissues differ from one another and are dependent on gene expression.

Mots clés

  • protéomique: the branch of molecular biology that studies the set of proteins expressed by the genome of an organism
  • proteome: the complete set of proteins encoded by a particular genome
  • génomique: the study of the complete genome of an organism

Proteomics is a relatively-recent field the term was coined in 1994 while the science itself had its origins in electrophoresis techniques of the 1970’s and 1980’s. The study of proteins, however, has been a scientific focus for a much longer time. Studying proteins generates insight into how they affect cell processes. Conversely, this study also investigates how proteins themselves are affected by cell processes or the external environment. Proteins provide intricate control of cellular machinery they are, in many cases, components of that same machinery. They serve a variety of functions within the cell there are thousands of distinct proteins and peptides in almost every organism. The goal of proteomics is to analyze the varying proteomes of an organism at different times in order to highlight differences between them. Put more simply, proteomics analyzes the structure and function of biological systems. For example, the protein content of a cancerous cell is often different from that of a healthy cell. Certain proteins in the cancerous cell may not be present in the healthy cell, making these unique proteins good targets for anti-cancer drugs. The realization of this goal is difficult both purification and identification of proteins in any organism can be hindered by a multitude of biological and environmental factors.

L'étude de la fonction des protéomes est appelée protéomique. Un protéome est l'ensemble des protéines produites par un type cellulaire. Genomics led to proteomics (via transcriptomics) as a logical step. Proteomes can be studied using the knowledge of genomes because genes code for mRNAs and the mRNAs encode proteins. Although mRNA analysis is a step in the right direction, not all mRNAs are translated into proteins. La protéomique complète la génomique et est utile lorsque les scientifiques veulent tester leurs hypothèses basées sur les gènes. Even though all cells of a multicellular organism have the same set of genes, the set of proteins produced in different tissues is different and dependent on gene expression. Ainsi, le génome est constant, mais le protéome varie et est dynamique au sein d'un organisme. In addition, RNAs can be alternately spliced (cut and pasted to create novel combinations and novel proteins) and many proteins are modified after translation by processes such as proteolytic cleavage, phosphorylation, glycosylation, and ubiquitination. There are also protein-protein interactions, which complicate the study of proteomes. Bien que le génome fournisse un modèle, l'architecture finale dépend de plusieurs facteurs qui peuvent modifier la progression des événements qui génèrent le protéome.

Large-scale proteomics machinery: This machine is preparing to do a proteomic pattern analysis to identify specific cancers so that an accurate cancer prognosis can be made.


Few steps to find amino acid sequence

STEP 1 – Know which DNA strand is given. There are two strands: Coding strand or non-coding strand.

One can either read the coding strand from 3’ to 5’ or read the template strand from 5’ to 3’ when making the corresponding m-RNA strand.

STEP 2 – Write the corresponding m-RNA strand.

Using Coding strand: (A= U, T= A, G=C, C=G) Read from left to right

Using template strand: (T=U)Read from left to right

We can see that we achieve the same sequence irrespective of the strand used.

STEP 3 – Convert m-RNA as a sequence of codons. ALWAYS start from the codon AUG and NEVER count the same nucleotide twice!

STEP 4 – Use the below table to find the relevant amino acid sequence.

Also remember,
une. Start codon AUG stands for Methionine.
b. If you come across a stop codon UAA, UGA, UAG you should stop sequencing.