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Combien de segments terminaux possède l'axone d'une cellule pyramidale corticale typique ?

Combien de segments terminaux possède l'axone d'une cellule pyramidale corticale typique ?


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J'ai essayé de faire des recherches - en commençant par une recherche Google pour "arbres axonaux typiques" - et j'ai trouvé les images suivantes :

la source

source (les axones sont rouges)

mais je n'ai pas trouvé de réponse concise à cette question et à certaines questions connexes :

Combien de segments d'extrémité (qui ne se ramifient plus) l'axone d'une cellule pyramidale corticale typique a-t-il généralement. Je suppose que c'est un nombre beaucoup plus petit que le nombre de segments d'extrémité d'une dendrite typique, mais quelle est sa taille approximative : quelques dizaines, parfois moins de dix ?

J'aimerais exclure de cette question les "arbres terminaux" axonaux typiques qui se ramifient dans les terminaux axonaux.


Strate Pyramidale

La corne d'Ammon est une structure incurvée. Il a une organisation laminaire avec cinq couches. Du fait de sa forme en U, les couches (et alvéoles pyramidales) sont à l'envers dans CA1 par rapport à CA3 (voir Graphiques 19.2 b et 19.6 b).

Les cellules principales sont appelées les cellules pyramidales, elles utilisent le glutamate comme neurotransmetteur

Les cellules principales, les cellules pyramidales, ont leur soma aligné dans une fine couche appelée le couche de cellules pyramidales ou strate pyramidale (P, Graphique 19.2 b). Le nom de ces cellules vient de la forme triangulaire claire de leur corps cellulaire ( Graphique 19.4 une). Le corps cellulaire a un diamètre de 20 µm. Trois troncs dendritiques principaux émergent du corps cellulaire, un apical et deux basaux. Les dendrites apicales s'étendent dans le stratum radiatum (appelé ainsi en raison de l'organisation radiale des dendrites apicales de toutes les cellules pyramidales) et s'arborisent en stratum lacunosum moléculaire (LAC-MOL). Les dendrites basales se ramifient en strate oriens (OU). Les dendrites ont de nombreuses épines. Dans CA3, la partie proximale des dendrites apicales des cellules pyramidales présente des épines géantes (excroissances épineuses Graphique 19.4 b) qui sont les éléments postsynaptiques des synapses avec les cellules granuleuses du gyrus denté. Les axones des cellules pyramidales pénètrent strate alvéale (ALV) où elles émettent de nombreuses collatérales avant de quitter l'hippocampe.

Graphique 19.4. Microphotographies de neurones pyramidaux de Golgi CA1 et CA3 colorés et d'interneurones CA1.

(une) Neurone pyramidal CA1. (b) Neurone pyramidal CA3. La coloration Nissl sous-jacente montre la densité des corps cellulaires neuronaux dans la couche pyramidale. La flèche pointe vers les épines dendritiques géantes. (CD) Exemples d'interneurones CA1 GABAergiques marqués à la GFP. Leur corps cellulaire est situé à l'intérieur ou à proximité de la couche cellulaire pyramidale (P). Le marquage fin correspond aux axones et collatérales axonales. Échelles : 50 m po une. Photographies: (une) par Olivier Robain (b) de Jean Luc Gaiarsa (c,d) d'Agnès Baude.

Plusieurs types d'interneurones inhibiteurs innervent les neurones pyramidaux, ils utilisent le GABA comme neurotransmetteur

L'activité des cellules pyramidales est modulée non seulement par les afférences glutamatergiques mais aussi par celles provenant des interneurones inhibiteurs locaux. Quatre principaux types d'interneurones inhibiteurs ont été décrits dans la corne d'Ammon, tous GABAergiques. Ils ont leurs corps cellulaires dans les cinq couches des régions CA qui vont de la partie externe à la partie interne de l'hippocampe ( Graphiques 19.2 b et 19.5 une , à gauche) : stratum alveus (ALV), stratum oriens (OR), stratum pyramidale (P), stratum radiatum (RAD) et stratum lacunosum moleculaire (LAC-MOL). Les interneurones peuvent être classés selon leur(s) site(s) de terminaison sur les neurones pyramidaux ( Graphique 19.5 une, à droite), mais aussi de leur schéma de décharge, de leur contenu neurochimique, de leur date de naissance ou de leur origine spatiale :

Graphique 19.5. Connexions intrinsèques dans CA1 et CA3.

(une) Schéma d'une cellule pyramidale indiquant la localisation des corps cellulaires des différents interneurones (à gauche) et les domaines postsynaptiques ségrégués innervés par les interneurones présynaptiques distincts (à droite). (b) Illustration de l'anticipation et de l'inhibition de la rétroaction. Voir le texte pour les abréviations.

Partie (une) adapté de Maccaferri G, Roberts DB, Szucs P et al. (2000) Courants postsynaptiques spécifiques au domaine de la surface cellulaire évoqués par les neurones GABAergiques identifiés dans l'hippocampe du rat in vitro. J. Physiol. 524, 91–116, avec permission.

Les cellules panier (BC) innervent le soma et les dendrites proximales situées dans la strate pyramidale et radiatum. Les corps cellulaires des cellules paniers sont principalement situés dans la strate pyramidale. Certains d'entre eux sont également positifs pour la cholécystokinine. Ils proviennent tous de l'éminence ganglionnaire médiale

Les cellules bistratifiées (BiC) innervent les dendrites apicales et basales sur leur partie proximale située dans le stratum radiatum et oriens. Les corps cellulaires des cellules bistratifiées sont situés dans la strate oriens/radiatum ou stratum pyramidale. Ils sont positifs à la somatostatine et proviennent de l'éminence ganglionnaire médiale

Les cellules d'Oriens-lacunosum moléculaire (O-LMC) innervent les dendrites apicales distales situées dans le stratum lacunosum moléculaire. Les corps cellulaires d'O-LMC sont situés dans la strate oriens. Ils sont positifs à la somatostatine et proviennent de l'éminence ganglionnaire médiale

Les cellules axo-axoniques (AAC), également appelées cellules lustres, innervent exclusivement le segment initial de l'axone. Les corps cellulaires des cellules axo-axoniques sont situés à l'intérieur ou à proximité de la strate pyramidale.

Lorsque les interneurones sont activés par des afférences extrinsèques, ils participent à la rétro-inhibition lorsqu'ils sont activés par les collatérales axonales récurrentes des cellules pyramidales, ils participent à la rétro-inhibition ( Graphique 19.5 b). Certains interneurones comme l'O-LMC ne sont impliqués que dans la rétro-inhibition puisqu'ils ne sont activés que par les collatéraux axonaux des cellules principales.


Fond

La fonction du système nerveux dépend de neurones ayant une extrémité réceptrice (les dendrites) et une extrémité émettrice (un seul axone). Un neurone pyramidal cortical développe une grande dendrite apicale au sommet du corps cellulaire, plusieurs dendrites basales plus courtes et un seul axone à partir de la base pour se connecter à des cibles distantes. La polarisation précoce se produit peu après la naissance du neurone, pendant la phase migratoire à travers la zone intermédiaire. Le neurone nouveau-né devient d'abord multipolaire avec plusieurs neurites courts, puis devient bipolaire avec un processus principal orienté vers l'extérieur dans le sens de la migration loin du ventricule. Au cours de sa migration, il étend un axone à partir de l'extrémité arrière, mais n'amorce pas la croissance des dendrites avant la fin de la migration.

Les événements de polarisation précoce peuvent être modélisés dans des cultures dissociées de neurones hippocampiques ou corticaux embryonnaires [1]. Lors de la repolarisation in vitro, les neurones apparaissent d'abord ronds et plats comme un fibroblaste (stade 1, non polarisé). En une journée, ils commencent à étendre plusieurs neurites indifférenciés de longueur à peu près égale (stade 2, multipolaire). Les neurites en croissance sont remplis de microtubules et se terminent par des cônes de croissance riches en actine avec des lamelles et des filopodes. De manière stochastique, l'un des neurites s'allonge rapidement pour devenir l'axone (stade 3, polarisé). Les neurites restants deviennent des dendrites et restent plus courts et plus épais que l'axone. Ce système inestimable a révélé de nombreux facteurs importants pour la polarisation [2], mais les mécanismes cytosquelettiques qui sous-tendent le développement de la morphologie neuronale complexe ne sont pas encore bien compris [3, 4].

Diverses protéines motrices de la kinésine sont cruciales pour établir ou maintenir la polarité et la structure neuronales grâce à leurs interactions avec les microtubules et les cargaisons [5]. Les membres de la sous-famille Kinésine-6 ​​sont des moteurs de microtubules dirigés vers l'extrémité plus connus sous le nom de kinésines « mitotiques » pour leur rôle dans la cytokinèse, mais certains peuvent avoir des fonctions supplémentaires [6]. Les cellules de mammifères expriment trois membres de la famille Kinésine-6 : Kif23/MKLP1, Kif20a/MKLP2 et Kif20b (anciennement appelée phospho-protéine mitotique 1, MPP1 ou Mphosph1). ARNi de Kif23 chez le rat en culture, les neurones sympathiques ont perturbé la polarité des microtubules des dendrites et ont entraîné des axones et des dendrites plus longs [7, 8]. Mutation de la Drosophile Kif23 orthologue, pavarotti (pav), a provoqué un glissement excessif des microtubules, une croissance axonale et une ramification axonale [9, 10].

Le troisième membre de la sous-famille des mammifères Kinesin-6, Kif20b, est moins compris et a un poids moléculaire plus élevé et une abondance inférieure à Kif23 ou Kif20a. Fait intéressant, il a une tige deux fois plus longue composée de quatre domaines enroulés reliés par trois charnières [11, 12]. Dans les tests in vitro, KIF20B était suffisant pour faire glisser et regrouper les microtubules d'une manière dépendante de l'ATP [11]. Dans un précédent écran ENU de souris, nous avons trouvé un mutant létal néonatal récessif qui présentait une microcéphalie et des défauts de guidage axonal dans un sous-ensemble d'axones thalamocorticaux au jour embryonnaire (E) 18,5 [13]. Cartographie génétique et test de complémentation identifiés Kif20b comme le gène mutant [14]. La mutation ponctuelle dans Kif20b provoque une erreur d'épissage de l'ARNm, un décalage du cadre de lecture et des codons de terminaison prématurés, et réduit la protéine Kif20b à des niveaux indétectables sur les immunoblots ou la coloration cellulaire [14]. Les mutants présentent des défauts de cytokinèse dans les cellules souches neurales du cortex embryonnaire. La taille et l'épaisseur corticales sont réduites dans le Kif20b mutants en raison de la diminution du nombre de neurones et de progéniteurs intermédiaires. Malgré cela, l'organisation laminaire et la plupart des voies axonales semblent globalement normales à la naissance [13, 14].

Ici, à découvrir Kif20b rôles dans le développement neuronal au cours de la corticogenèse, nous avons profité de ce mutant génétique de perte de fonction. Dans Kif20b cerveaux mutants, les neurones pyramidaux corticaux ont des dendrites apicales plus courtes et plus minces qui se ramifient plus près du corps cellulaire, des ramifications axonales supplémentaires et sont parfois mal orientées. Pour séparer les effets non cellulaires autonomes, nous avons poursuivi des analyses supplémentaires dans des cultures de neurones dissociés. Étonnamment, lorsqu'ils sont isolés de leur environnement cérébral normal, Kif20b les neurones mutants présentent un fort défaut de polarisation. Ce défaut peut s'expliquer au moins en partie par un rôle de Kif20b dans la localisation de la protéine de polarité Shootin1. Le défaut de polarisation n'est pas dû à des changements dans le destin des cellules et affecte à la fois les types de couches profondes et superficielles. De plus, le Kif20b les neurones mutants qui réussissent à se polariser présentent une variété de changements morphologiques, notamment des axones plus courts et plus ramifiés et des neurites mineurs plus longs. Les neurites mutants sont plus larges et les filopodes des cônes de croissance sont plus longs avec une pénétration accrue des microtubules. En imagerie en direct, les axones de Kif20b les neurones mutants semblent s'arrêter moins et se rétracter davantage. Ces données indiquent que le Kif20b est important pour la polarisation, le maintien de la croissance des axones et la prévention de la ramification, et suggèrent qu'il agit à la fois en localisant la cargaison et en organisant des faisceaux de microtubules.


Résultats

Pour comprendre comment l'activité des cellules L5 est régulée pendant le traitement de l'information corticale, nous avons examiné les modèles de réponse des cellules L5 évoqués par la stimulation PC L2/3, une voie excitatrice majeure dans le cortex moteur. La channelrhodopsine-2 (ChR2) a été exprimée sélectivement dans les PC L2/3 dans la partie rostrale du cortex, y compris les zones motrices, en utilisant l'électroporation in utero à E17,5 (Fig. 1a, b). Les PC L2/3 exprimant ChR2 ont été dépolarisées avec une courte durée d'illumination en lumière bleue, en fonction de l'intensité lumineuse (Fig. 1c). Une intensité lumineuse de 0,25 ± 0,05 mW (durée, 5 ms) était suffisante pour induire un pic (m = 10 cellules), indiquant l'expression fonctionnelle de ChR2 dans les cellules électroporées. Pour examiner l'activité du réseau dans le cortex moteur, nous avons fourni un éclairage lumineux en forme de rampe, où l'intensité lumineuse a été progressivement augmentée, jusqu'à L2/3 dans les préparations de tranches. Au cours d'un éclairage lumineux en forme de rampe, une activité de membrane oscillatoire a été observée dans les PC L5, ainsi que dans les cellules FS (Fig. 1d–f). La fréquence de crête des oscillations induites était de 30,9 ± 3,5 Hz dans les PC et de 31,5 ± 3,3 Hz dans les cellules FS (fig. 1f encarts). Ces résultats indiquent que le cortex moteur peut générer des oscillations de bande bêta/gamma élevée (bêta/gamma). L'induction de l'activité oscillatoire par photostimulation en forme de rampe aux PC L2/3 exprimant ChR2 a également été rapportée dans les cortex somatosensoriel et visuel 21 .

une Vue à faible grossissement d'un cerveau de rat exprimant mCherry et ChR2-Venus par électroporation in utero à E17.5. b Coupe sagittale du cortex frontal. ChR2-Venus a été exprimé sélectivement dans les PC L2/3. Les lignes pointillées indiquent la frontière de L1/L2 et L2/3/L5. En médaillon, vue schématique de l'ensemble (une) et coupe sagittale (b) des rectangles en pointillés du cerveau correspondent aux images. c Réponses à une brève illumination (5 ms en durée 3 intensités) dans un PC ChR2 positif L2/3. Potentiels membranaires oscillatoires d'un PC L5 en réponse à une stimulation lumineuse en forme de rampe vers L2/3. En médaillon, dessin schématique de l'expérience dans la préparation des tranches. Le triangle et le cercle gris indiquent les PC L5 et les cellules FS. respectivement. Les cellules rouges et grises dans L2/3 indiquent respectivement des PC L2/3 positifs et négatifs pour ChR2. La ligne en forme de rampe indique le changement d'intensité de la stimulation lumineuse. e Trace agrandie des potentiels membranaires de la cellule montrée dans () pendant la stimulation (supérieure) et aucune stimulation (inférieure). F Spectres de puissance des potentiels membranaires. En médaillon, boîtes à moustaches des fréquences de crête autour de 25-45 Hz induites par la stimulation lumineuse dans les PC L5 et les cellules FS (m = 60 et 42, respectivement).

Pour comprendre comment l'activité oscillatoire est générée dans les circuits corticaux, nous avons effectué des enregistrements doubles à partir de cellules L5 et examiné la relation temporelle des potentiels membranaires pendant l'oscillation induite par des stimulations lumineuses aux PC L2/3. Sans stimulation lumineuse, les cellules L5 PC et FS ont reçu des courants synaptiques excitateurs spontanés (sEPSC) à 3,02 ± 1,18 et 12,83 ± 2,2 Hz, respectivement. Les sEPSC synchronisés entre deux cellules, qui se sont produits dans les 5 ms, ont rarement été trouvés dans les paires de cellules PC/PC (0,05 ± 0,02 Hz 4 paires sur 5) et les paires de cellules PC/FS (0,14 ± 0,05 Hz 5 paires). Pendant les stimulations lumineuses, les paires de cellules PC/PC et PC/FS ont montré des oscillations de potentiel membranaire bien synchronisées pendant les stimulations lumineuses (Fig. 2a, b). Les phases oscillatoires étaient cohérentes entre les paires PC/PC (pic positif le plus proche du temps 0 = 2,09 ± 1,04 ms, 15 paires de cellules) mais n'étaient pas appariées entre les paires de cellules PC/FS (pic positif le plus proche = 18,43 ± 9,08 ms, 15 paires de cellules P < 0,0001, test de rang signé de Wilcoxon, fig. 2c). Une activité oscillatoire pendant la stimulation lumineuse a également été observée dans les interneurones L5 non-FS (29,21 ± 3,49 Hz en fréquence de crête, m = 15), mais la corrélation avec les CP était faible (Fig. complémentaire 1). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les PC L5 et les cellules FS sont dépolarisées à différentes phases des oscillations bêta/gamma induites par la stimulation PC L2/3. Si l'activité oscillatoire générée par L2/3 était simplement transmise aux cellules L5, les cellules PC et FS seraient dépolarisées de manière synchrone. De plus, les PC L5 et les cellules FS forment fréquemment des connexions réciproques entre eux, mais reçoivent des entrées excitatrices communes des PC L2/3 avec une très faible probabilité 22 , suggérant la génération d'une activité oscillatoire au niveau des circuits locaux L5, en utilisant des connexions réciproques entre les PC L5 et les cellules FS .

une Deux enregistrements à partir de PC L5 (en haut) et d'un corrélogramme croisé. b Double enregistrement depuis un PC et une cellule FS en L5, et un cross-corrélogramme (PC, point de référence). La ligne pointillée indique le temps 0. Les lignes grises indiquent des intervalles de confiance à 95 %. c Différences temporelles entre le temps 0 et le pic positif le plus proche dans les corrélogrammes croisés des paires PC/PC (m = 15) et des paires de cellules PC/FS (m = 15). ***, une différence significative (P < 0,0001, test de rang signé de Wilcoxon). Les données sont exprimées en moyenne ± SD.

Activité oscillatoire dans les sous-types de PC

Les PC L5 sont en grande partie classés en deux types, les cellules du tractus pyramidal (PT) et les cellules à projection intratélencéphalique (IT) 23,24. Les cellules PT et IT forment des connexions synaptiques entre elles d'une manière différente 4,6,7,8,9. Nous avons examiné comment les cellules L5 PT et IT sont impliquées dans la génération de l'activité oscillatoire. Les PC de type PT et IT ont été identifiés simultanément par des injections de traceurs fluorescents rétrogrades dans les zones cibles (Fig. 3a). Des enregistrements doubles ont été obtenus à partir de cellules L5 PT et IT, tandis qu'un éclairage lumineux en forme de rampe a été appliqué à L2/3. Des oscillations de potentiel membranaire pendant les photostimulations ont été fréquemment observées dans les cellules PT, mais pas dans la majorité des cellules IT (Fig. 3b, c). De plus, une hyperpolarisation des potentiels membranaires pendant la stimulation a souvent été observée dans les cellules IT (11 sur 27 cellules, amplitude de pic = -1,74 ± 0,37 mV, aire de tension = 0,73 ± 0,16 mV*s, Fig. 3b). Ces résultats suggèrent que les cellules PT sont impliquées dans la génération de l'activité oscillatoire.

une Identification des sous-types de PC L5 par injections de traceurs fluorescents rétrogrades dans le cortex controlatéral et les noyaux pontiques ipsilatéraux. b Doubles enregistrements à partir de cellules PT et IT identifiées. La stimulation lumineuse en forme de rampe à L2/3 induit des oscillations dans les cellules PT, mais pas dans les cellules IT. Graphique de droite, spectres de puissance des potentiels membranaires des cellules PT et IT pendant la stimulation. c Proportion de cellules PT et IT qui présentaient une activité oscillatoire, respectivement (27 paires de cellules PT/IT). Les oscillations ont été adoptées lorsque le rapport entre la puissance de crête (bande 25-40 Hz) et la puissance moyenne (bande 45-55 Hz) >10, et la puissance crête (bande 25-40 Hz) >0,5 mV 2 Hz -1 . Enregistrements attachés aux cellules obtenus à partir de cellules IT, PT, FS et non-FS pendant la stimulation en forme de rampe vers L2/3 (trace supérieure). e Nombre de pointes induites dans les types cellulaires individuels pendant la photostimulation. La barre horizontale indique le nombre médian de pointes. L'astérisque indique une différence significative (ANOVA à un facteur, F(3, 49) = 8.202, P = 0,00016 test de Bonferroni, IT vs PT, P = 0,0359, IT contre FS, P = 0,0001, FS vs non FS, P = 0.0071).

Il a été proposé que l'interaction synaptique réciproque entre les PC excitatrices et les cellules inhibitrices est l'un des principaux mécanismes sous-jacents à la génération de l'activité oscillatoire 25 . Les observations ci-dessus, combinées à cette proposition, suggèrent que les cellules L5 PT et FS, plutôt que les cellules IT et non-FS, déchargent des pointes pendant la photostimulation L2/3.Pour confirmer cela, l'activité de dopage a été enregistrée à partir de sous-types de PC L5 en mode attaché aux cellules pour préserver les circonstances intracellulaires des cellules. Dans la plupart des cellules IT enregistrées, aucun pic n'a été observé pendant la photostimulation L2/3 (11 sur 12 cellules). En revanche, 11 des 17 cellules PT ont généré des pics en réponse à la photostimulation L2/3 (Fig. 3d, e). Le nombre de pointes était de 5,2 ± 5,04 dans les cellules PT qui présentaient au moins une pointe pendant la stimulation (durée, 2 s). Dans les enregistrements de pointes d'interneurones inhibiteurs, les types de cellules identifiés en fonction des propriétés de déclenchement en mode cellule entière après les enregistrements liés aux cellules, les cellules L5 FS se sont avérées décharger plus de pointes pendant la période de photostimulation que les cellules non-FS (Fig. 3d, e ). Ces résultats suggèrent que les interactions synaptiques entre les cellules L5 PT et FS génèrent une activité oscillatoire dans les circuits corticaux L5.

Les connexions électriques entre les cellules FS via des jonctions communicantes jouent un rôle important dans la régulation de l'activité des cellules FS 26 . Les cellules FS connectées électriquement reçoivent fréquemment des entrées communes des PC environnants, ce qui pourrait générer une activité synchrone entre elles 27 . Nous avons donc examiné si les connexions électriques entre les cellules FS étaient nécessaires pour les oscillations bêta/gamma L5 induites par la stimulation PC L2/3. Un bloqueur de jonction lacunaire a supprimé l'activité oscillatoire dans les cellules PC et FS (Fig. 2 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que les connexions électriques entre les cellules FS sont impliquées dans la génération d'oscillations bêta/gamma dans les circuits corticaux.

Oscillations induites par la stimulation du sous-type PC L5

Nous avons examiné si l'activation de sous-types spécifiques de PC L5 est suffisante pour induire des oscillations bêta/gamma dans L5. Le cortex se développe des couches profondes aux couches superficielles de manière inversée. Ainsi, les PC L2/3 ou L5 peuvent être sélectivement ciblés en utilisant une électroporation in utero réalisée à différents jours embryonnaires 28 . De plus, les cellules L5 PT et IT sont générées à des moments différents chez la souris 29 . Nous avons effectué une électroporation in utero à E14.5 ou E15.5 et examiné l'expression de CTIP2, un marqueur des cellules PT 30,31, dans des PC L5 marqués. Chez les rats électroporés avec mCherry à E15,5, seulement 2,82 ± 1,02 % des cellules L5 marquées étaient CTIP2 positives. En revanche, la plupart des cellules L5 marquées étaient CTIP2 positives chez les rats électroporés à E14,5 (96,92 ± 1,05 %, six animaux, Fig. 4a, b). Dans les deux cas, les cellules marquées étaient principalement positionnées dans L5 (Fig. 3 supplémentaire). Conformément à la distribution des cellules L5 PT et IT 32, la distribution des cellules marquées dans L5 était quelque peu différente entre les rats électroporés à E15,5 et E14,5. Les cellules marquées à E15.5 étaient situées dans la L5 supérieure plus que celles dans la L5 inférieure. En revanche, la proportion de cellules marquées à E14.5 situées dans le L5 inférieur a augmenté. Ces résultats indiquent que les cellules PT et IT peuvent être ciblées sélectivement par électroporation in utero à différents jours embryonnaires.

une Expression de CTIP2 dans des PC L5 transfectées avec mCherry par électroporation à E15.5 ou E14.5. b Proportion de cellules CTIP2-positives parmi les PC exprimant mCherry (six rats, respectivement). Les données sont exprimées en moyenne ± SD. c Schéma de photostimulation L5 et enregistrement à partir de cellules non marquées. Enregistrements de sous-types de cellules L5 lors d'une photostimulation en forme de rampe vers L5 dans des tranches obtenues à partir de rats électroporés avec ChR2 à E15.5 (stimulation de la population cellulaire IT). Sous-types de tir PC : type SA-d (adaptation à pointes lentes avec pointes initiales de doublet), chevauchant considérablement avec la population de cellules PT de type FA (adaptation à pointes rapides), chevauchant la population de cellules IT. Graphique de droite, spectres de puissance des potentiels membranaires pendant la stimulation. e Potentiels membranaires des sous-types L5 lors de la photostimulation dans des tranches obtenues à partir de rats électroporés avec ChR2 à E14.5 (stimulation de la population cellulaire PT). Bon, spectres de puissance. F Proportion de cellules L5 présentant des oscillations lors de la photostimulation des populations de cellules IT ou PT. Les oscillations ont été adoptées lorsque le rapport entre la puissance de crête (bande 25-40 Hz) et la puissance moyenne (bande 45-55 Hz) >10, et la puissance crête (bande 25-40 Hz) >0,5 mV 2 Hz -1 .

Pour examiner l'activité induite par une stimulation de sous-type PC L5 spécifique, des enregistrements ont été obtenus à partir de PC L5 ChR2-négatifs et de cellules FS (Fig. 4c). Une brève photostimulation (durée, 5 ms) de L5 a induit des réponses synaptiques transitoires dans des cellules L5 de rats électroporées à E15,5 ou E14,5 (données non présentées). En réponse à l'éclairage lumineux en forme de rampe de L5, une activité oscillatoire a été observée dans certaines cellules PC L5 et cellules FS de rats électroporés à E14,5 (stimulation PT Fig. 4e fréquence de crête = 31,1 ± 3,05 Hz) et dans quelques cellules de rats électroporés à E15,5 (stimulation IT Fig. 4d). De plus, l'activité oscillatoire induite par la stimulation PT était fortement dépendante du sous-type de PC. Nous avons classé les PC en fonction des propriétés de tir, car il est difficile d'identifier les sous-types de PC L5 par des traceurs rétrogrades chez les animaux avec des PC L5 marqués par fluorescence par électroporation in utero. Il a été démontré que les propriétés de tir dans les PC L5 sont en corrélation avec leurs zones de projection 4,5,6. Les cellules PT présentent des pics répétitifs lors des injections d'impulsions de courant avec une adaptation de fréquence de pic lent (type SA). En particulier, les cellules de type SA avec une rafale de pointes de doublet initial (SA-d) n'ont été observées que dans les cellules PT 4 . Au contraire, la majorité des cellules IT présentent une adaptation rapide de la fréquence des pics en réponse aux injections d'impulsions de courant (type FA). En utilisant l'identification basée sur les propriétés de tir des sous-types L5 PC, nous avons comparé leurs modèles de réponse aux illuminations lumineuses en forme de rampe. L'activité oscillatoire induite par la stimulation des cellules PT a été trouvée dans 15 des 19 PC de type L5 PT (SA-d) et dans 2 des 16 PC de type IT (FA) (Fig. 4f). Ces résultats suggèrent que les cellules PT sont impliquées dans la génération d'une activité oscillatoire au sein des circuits locaux de L5.

Activité oscillatoire dans le modèle de circuit

Nos données expérimentales suggèrent que les interactions entre les sous-réseaux cellulaires PT et FS jouent un rôle clé dans la génération d'oscillations L5. Des études antérieures ont rapporté des caractéristiques uniques du sous-réseau de cellules PT dans les modèles de connexion, les propriétés synaptiques et les propriétés de tir des cellules PT dans le cortex frontal de rat 4,7,8,22. Les cellules PT déchargent des pointes avec une adaptation de pointe lente, en réponse à la dépolarisation, et forment des connexions synaptiques qui montrent une réciprocité de connexion et une facilitation à court terme en réponse à des pointes répétitives. Ces propriétés pourraient sous-tendre la génération d'activité oscillatoire dans L5. Pour confirmer cette notion, nous avons construit des circuits modèles L5 sur la base de données expérimentales. Notre modèle consistait en 400 PC (200 cellules de type PT et IT, respectivement) et 50 cellules FS réparties aléatoirement sur un plan carré de 500 µm de côté. Les cellules modèles PT, IT et FS ont reproduit les propriétés de tir observées dans les expériences (Fig. 5a). Les connexions synaptiques, y compris les synapses électriques entre les cellules FS, ont été établies entre des cellules modèles situées à une distance de 150 m les unes des autres à des probabilités de connexion obtenues à partir d'expériences en tranches (Fig. 5b). Pour induire une activité de réseau dans les circuits modèles, des entrées synaptiques externes ont été appliquées au hasard à des cellules individuelles à des fréquences d'entrée reflétant les probabilités de connexion relatives des types de cellules L2/3 à L5 4,22. En présence d'entrées externes dans le modèle, des oscillations ont été évoquées dans les cellules modèles PT et FS à des fréquences similaires à celles observées dans les expériences de coupe (Fig. 5c). Ces résultats suggèrent que les sous-réseaux de cellules L5 PT et FS agissent comme des générateurs d'oscillations.

une Propriétés de tir des modèles de cellules PT, IT et FS en réponse à l'injection de courant somatique. b Caractéristiques de connexion des cellules L5 dans les circuits modèles. Les flèches noires et rouges indiquent respectivement la connexion synaptique chimique et électrique. « p » indique la probabilité de connexion synaptique aux cellules environnantes situées à une distance de 150 m. « p(reciprocal) » indique une probabilité de connexion réciproque entre les cellules connectées. c Potentiels membranaires somatiques des cellules PT, IT et FS dans le modèle de réseau. Des entrées externes ont été appliquées à tous les modèles de cellules. Le graphique de droite indique les spectres de puissance des potentiels membranaires en présence d'entrées externes. c, e Potentiels membranaires somatiques des cellules PT, IT, FS dans le modèle avec modification des paramètres du modèle. Les propriétés de tir dans les modèles de cellules PT ont été modifiées du type d'adaptation de pointe lente à rapide en augmentant la conductance du potassium de type M à 1. e Manipulation des propriétés de connexion dans les sous-réseaux de cellules PT et FS dans le modèle. À gauche, la plasticité à court terme des cellules PT est passée du type facilitation au type dépression, similaire à celle des cellules IT. Au milieu, réduction de la probabilité de connexion réciproque dans le sous-réseau de cellules PT de 0,5 à 0,1. A droite, suppression des connexions électriques entre les cellules FS. La conductance du sodium a été définie sur 0 dans les cellules indiquées dans (ce).

Nous avons identifié des facteurs critiques pour la génération d'oscillations dans le modèle. Lorsque les propriétés de tir des cellules PT ont été commutées sur celles du type IT qui ont montré une adaptation rapide des pointes pendant la dépolarisation, les oscillations ont été supprimées (Fig. 5d). Nous avons également examiné la contribution des caractéristiques connexionnelles entre les cellules PT à la génération d'oscillations. L'altération des propriétés synaptiques entre les cellules PT au type de dépression a aboli les oscillations (Fig. 5e, à gauche). La réduction de la probabilité de connexion réciproque entre les cellules PT a perturbé la génération d'activité oscillatoire (Fig. 5e au milieu). Conformément aux observations expérimentales, l'élimination des synapses électriques entre les cellules FS a supprimé l'activité oscillatoire (Fig. 5e, à droite). Ces résultats démontrent que les circuits L5 sont bien organisés pour générer des oscillations au sein de sous-réseaux excitateurs et inhibiteurs spécifiques.

Activité oscillatoire pendant l'apprentissage moteur

L'activité oscillatoire dans le cortex moteur dépend des états comportementaux 33,34,35,36. Nous avons étudié quels types de conditions comportementales induisaient des oscillations bêta/gamma observées dans des expériences in vitro pour comprendre leurs rôles fonctionnels dans le cortex moteur. Nous avons comparé les LFP dans L5 du cortex moteur qui se sont produits lors de mouvements de locomotive simples avec ceux observés lors de mouvements plus difficiles qui doivent être appris. Nous avons adopté une tâche de course de roue forcée, dans laquelle les animaux couraient sur des barres de pied placées le long d'une jante de roue rotative afin de boire l'eau du port d'alimentation 37 . Les rats étaient habitués à courir sur des barres à intervalles réguliers (tâche régulière), puis à courir sur des barres à intervalles réguliers (tâche d'apprentissage des modèles) (Fig. 6a, b). Au cours de la phase initiale des essais d'apprentissage, les animaux tombaient fréquemment des marchepieds et touchaient le sol des pieds. Cependant, le nombre de touches au sol a progressivement diminué au fil des essais, indiquant l'apprentissage du motif de la barre (Fig. 6c, Fig. 4 supplémentaire et film 1). Nous avons ensuite obtenu des LFP de la zone des membres antérieurs M1 au repos (pas de rotation des roues), lors de tâches régulières et lors de tâches d'apprentissage de motifs au stade d'apprentissage initial (jour 1) (Fig. 6d). Dans les spectres de puissance, nous avons trouvé trois bandes de fréquences qui augmentaient pendant les tâches : 5 à 10 Hz (bande thêta) et 60 à 70 Hz pendant les tâches d'apprentissage régulières et de modèle et 25 à 45 Hz (bande de fréquence bêta/gamma) uniquement pendant l'apprentissage de modèle tâches (Fig. 6e). La fréquence maximale de la bande bêta/gamma dans L5 était de 32,9 ± 3,4 Hz (Fig. 6g, 18 rats), similaire à celle observée dans les cellules PC et FS dans les expériences de tranche (ANOVA à sens unique, F(2, 117)=2.415, P = 0,0938 test de Bonferroni, versus PC, P = 0,0937, par rapport aux cellules FS, P = 0,4821). L'augmentation de la bande de fréquence bêta/gamma était spécifique à la couche. Dans les LFP obtenus en L2/3 au jour 1, l'activité des bandes bêta/gamma était faible pendant les tâches (Fig. 6f). Dans l'analyse de densité de source de courant (CSD), les composants de puits et de source de courant ont été observés dans L5 (Fig. 5 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que l'activité de bande bêta/gamma est générée dans les circuits locaux L5.

une Dessin schématique de la tâche de fonctionnement de la roue. La roue était entraînée par un moteur à vitesse constante. Le port d'alimentation en eau a été inséré du côté de la roue. b Modèles de barre de pied utilisés pour l'accoutumance (tâche régulière) et pour l'apprentissage (tâche d'apprentissage de modèle). c Progrès de l'apprentissage suivi par la réduction du nombre de contacts des membres antérieurs avec le sol pendant la tâche d'apprentissage du jour 1 au jour 3 (5 essais par jour). Le nombre de touches a été normalisé à celui du premier essai. Les données sont exprimées en moyenne ± SD (n = 18 rats avec canules optiques implantées). Traces brutes (supérieures) et LFP (inférieures) pendant la tâche régulière et la tâche d'apprentissage de modèle (jour 1). Les LFP ont été traités par un filtre passe-bande (4-100 Hz). e Spectres de puissance des LFP au repos (m = 12), pendant la tâche régulière (m = 15), et pendant la tâche d'apprentissage de modèle (m = 18) obtenu au jour 1. La puissance a augmenté autour de 30-40 Hz dans la tâche d'apprentissage du modèle (flèche), mais n'a pas été modifiée autour de thêta et 60-70 Hz dans les tâches régulières et d'apprentissage. Les spectres de puissance ont été représentés en moyenne ± SEM (ligne noire et grise, respectivement). F Spectres de puissance des LFP, représentés en moyenne ± SEM (ligne noire et grise, respectivement), obtenus à L2/3 lors de la tâche d'apprentissage le jour 1 (m = 10). g Boîte à moustaches des fréquences de crête entre 25 et 45 Hz dans les spectres de puissance LFP en L5 pendant la tâche d'apprentissage de motif (jour 1 m = 18). h Puissance à une fréquence de crête de la bande de fréquences thêta, 25-45 et 60-70 Hz des LFP obtenue les jours 1 à 3 de la tâche d'apprentissage. Notez une diminution significative de la puissance autour de 25-45 Hz au cours des jours d'essai (jumelé t-test, jour 1 vs jour 2, **P = 0,00038, jour 2 vs jour 3, *P = 0,0124, jour 1 vs jour 3, **P = 0.0012).

Au cours d'un essai d'apprentissage, la vitesse de rotation des roues a été modifiée pour examiner si l'activité de locomotion affecte ces bandes de fréquences. Conformément à l'étude précédente 38 , les bandes de fréquences thêta et 60-70 Hz ont été modifiées en fonction de la vitesse de locomotion. En revanche, la bande de fréquence bêta/gamma n'a pas été modifiée (Fig. 6 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que les bandes de fréquences thêta et 60-70 Hz sont liées à la locomotion elle-même, mais celle de la bande bêta/gamma est liée au processus d'apprentissage. En effet, la puissance de la bande bêta/gamma a progressivement diminué au fil des jours d'essai (Fig. 6h). L'activité des bandes de fréquences thêta et 60-70 Hz est restée constante.

Si l'activité de la bande bêta/gamma est nécessaire pour l'apprentissage moteur, la manipulation de cette activité pendant les tâches affecterait le processus d'apprentissage. À cette fin, nous avons examiné les effets de la photostimulation sur les LFP par un éclairage lumineux en forme de rampe, similaire à ceux des expériences en tranches, sur la zone des membres antérieurs M1 chez les rats exprimant ChR2 dans les PC L2/3. La photostimulation a augmenté la puissance de la bande bêta/gamma de manière sélective (34,67 ± 0,16%, test de rang signé de Wilcoxon, P = 0,0078, 8 rats, Fig. 7a, b). Cependant, la fréquence de crête de cette bande n'a pas changé pendant la photostimulation (Fig. 7c). En revanche, la puissance de la bande 60-70 Hz n'a pas changé pendant la stimulation (puissance et fréquence de crête, -1,46 ± 9,37 % et -1,7 ± 4,2 % de changement, respectivement). L'activité de la bande thêta a également été préservée pendant la stimulation (puissance et fréquence de crête, -0,07 ± 2,8 % et 0,75 ± 14,32 % de changement, respectivement).

une Trace brute (supérieure) et LFP (inférieure), filtrées passe-bande entre 20 et 70 Hz, observées lors de la tâche d'apprentissage des motifs au jour 1. Les cellules L2/3 ont été stimulées par un éclairage lumineux en forme de rampe. A droite, spectres de puissance des LFP enregistrés en présence et en l'absence d'éclairage lumineux. b Rapports de puissance à fréquence crête comprise entre 25 et 45 Hz à puissance moyenne comprise entre 45 et 55 Hz en présence et en absence de photostimulation (**, test de Wilcoxon, P = 0,0078, 8 rats). c Fréquences de crête des spectres de puissance LFP entre 25 et 45 Hz obtenus lors d'une tâche d'apprentissage en présence et en absence de photostimulation (8 rats). Effets de la photostimulation ChR2 sur les progrès de l'apprentissage. Nombre de touchers des membres antérieurs au plancher du pied normalisé à celui du premier essai. La photostimulation a été appliquée aux deux hémisphères de rats exprimant ChR2 par électroporation à E17,5 (L2/3 PC, rouge, m = 12), E15.5 (IT, gris, m = 10), ou E14.5 (PT, bleu, m = 11). Des rats implantés avec des canules et connectés avec une fibre optique lors des essais, mais sans stimulation, ont été utilisés comme témoins (noir, m = 18). Notez que l'apprentissage a été significativement accéléré par la stimulation des cellules L2/3 et L5 PT. **P < 0,001 en rouge pour L2/3 vs contrôle et vs IT, et en bleu pour PT vs contrôle et vs IT (test post hoc de Bonferroni). P les valeurs sont indiquées dans le tableau supplémentaire 2. Les données sont exprimées en moyennes ± SD.

Parallèlement à l'augmentation stimulée de la puissance bêta/gamma, l'apprentissage s'est déroulé plus rapidement avec la photostimulation PC L2/3 chez les rats exprimant ChR2 dans les PC L2/3 que ceux qui n'en ont pas (Fig. 7d). De plus, conformément aux observations dans les expériences de coupe, PT, mais pas IT, la stimulation cellulaire a accéléré l'apprentissage (Fig. 7d). La stimulation des PC peut affecter le comportement de la locomotive lui-même plutôt que l'apprentissage moteur. Nous avons donc comparé les distances de déplacement chez les rats avec une photostimulation sélective de sous-types individuels de PC dans un test en champ ouvert. Cependant, aucune différence significative n'a été trouvée entre les animaux stimulés par les cellules témoins, L2/3, PT et IT (Fig. 7 supplémentaire), suggérant que la stimulation optogénétique utilisée dans la tâche d'apprentissage n'affectait pas la locomotion.

L'activation du PC de type L2/3 ou L5 PT par éclairage lumineux accélère l'apprentissage moteur. Pour déterminer davantage l'implication de sous-types de PC spécifiques dans l'apprentissage, nous avons supprimé sélectivement l'activité des sous-types de PC individuels pendant les tâches d'apprentissage, en utilisant l'activation continue de l'archaerhodopsine (eArch) (Fig. 8). Contrairement à l'activation de ChR2, les cours de temps d'apprentissage étaient significativement ralentis chez les rats exprimant eArch dans les cellules L5 PT, mais pas chez ceux exprimant eArch dans les PC de type IT L2/3 ou L5 (Fig. 8a). Nous avons examiné si la puissance de la bande bêta/gamma était affectée par la suppression sélective de l'activité du sous-type PC. Les LFP pendant la photostimulation ont été enregistrés pendant les tâches d'apprentissage du modèle le jour 1. La puissance de la bande bêta/gamma dans les LFP pendant une tâche était inhibée lorsque L5 PT, mais pas L2/3 ou L5 IT, l'activité cellulaire était supprimée (Fig. 8b, c).La puissance de la bande 60-70 Hz n'a pas changé pendant la suppression (changement en % de la puissance de crête et de la fréquence de crête 0,41 ± 3,57 et -1,36 ± 2,66 dans les cellules PT, 0,66 ± 3,45 et -0,43 ± 2,36 dans les cellules IT, et 2,03 ± 2,92 et -0,11 ± 3,04 dans les PC L2/3). L'activité de la bande de fréquence thêta a également été préservée pendant la stimulation (changement en % de la puissance de crête et de la fréquence de crête 0,41 ± 1,95 et 5,93 ± 6,65 dans les cellules PT, 0,72 ± 1,44 et -1,68 ± 8,14 dans les cellules IT, et 0,92 ± 2,3 et 1,37 ± 8,71 dans PC L2/3). Nous avons également confirmé que la locomotion n'était pas affectée par la suppression d'eArch des PC L5 PT, L5 IT ou L2/3 en utilisant le test en champ ouvert (Fig. 7). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les cellules PT jouent un rôle important dans la génération de l'activité oscillatoire liée à l'apprentissage moteur.

une Tâche d'apprentissage de modèle utilisant des rats exprimant eArch dans des PC L2/3 (rouge, n = 11), des cellules IT L5 (gris, m = 10), ou des cellules L5 PT (bleu, m = 11) des deux hémisphères par électroporation à E17,5, E15,5 ou E14,5. Pendant la tâche, une lumière verte de 1 mW a été appliquée en continu des deux côtés. Le nombre de touchers au sol des membres antérieurs a été normalisé à celui du premier essai. Rats témoins (noirs, m = 18) étaient les mêmes que dans les expériences de stimulation ChR2. Notez que l'apprentissage a été considérablement ralenti par l'inhibition des cellules L5 PT. (**P < 0.01, *P < 0,05 en noir, rouge et gris pour PT vs contrôle, PT vs L2/3 et PT vs IT, respectivement). P les valeurs sont indiquées dans le tableau supplémentaire 3. Les données sont exprimées en moyennes ± SD. b Traces brutes (en haut) et LFP (en bas) enregistrées en présence et en l'absence d'éclairage lumineux sur des animaux exprimant eArch dans des cellules L5 PT lors d'une tâche d'apprentissage le jour 1. c Rapports de puissance à une fréquence crête comprise entre 25 et 45 Hz à une puissance moyenne comprise entre 45 et 55 Hz lors des tâches d'apprentissage. La puissance à la fréquence maximale a été significativement supprimée par l'inhibition des cellules L5 PT (quatre rats dans le groupe individuel ** appariés t-test, F = 3, P = 0.00023). Dessin schématique des circuits corticaux moteurs. Les PC L5 (noir, gris cellule PT, cellule IT) forment des sous-réseaux excitateurs en fonction de leurs sous-types de projection et interagissent réciproquement avec les interneurones inhibiteurs FS (cercle plein) qui forment également des sous-réseaux via des jonctions communicantes dendritiques. Les oscillations bêta/gamma sont générées par les interactions entre les sous-réseaux cellulaires PT et FS (flèche rouge) et régulent l'apprentissage moteur. Les flèches entre les types de cellules indiquent la direction des connexions synaptiques.


3. Cellules oligodendrogliales et leurs interactions avec les neurones

3.1. Cellules de la lignée oligodendrogliale

Les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) prolifèrent et migrent dans le système nerveux central (SNC) avant de se différencier en oligodendrocytes formant de la myéline [98]. Plusieurs signaux intrinsèques et extrinsèques favorisent l'expression de marqueurs spécifiques au stade au cours de la maturation, résultant en des sous-groupes de cellules de la lignée oligodendrocytes avec des capacités distinctes à proliférer et à migrer, à mesure que leur morphologie change [99]. Cette diversité de cellules de lignée a été explorée avec le séquençage d'ARN unicellulaire, l'anatomie et les réponses fonctionnelles aux neurones [100] (revue par Bostrand et Williams dans ce numéro).

Les OPC sont de petites cellules bipolaires exprimant des marqueurs spécifiques, notamment le protéoglycane transmembranaire NG2, le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes α (PDGFRα) et les facteurs de transcription Olig1/2 ainsi que le ganglioside A2B5. Les OPC ont des capacités élevées à proliférer et à migrer dans les premiers stades de développement [101,102]. Au cours de la migration, ils étendent et rétractent les processus de type cône de croissance, pour détecter les signaux chimiotactiques tels que le sonic hedgehog (Shh), les protéines morphogéniques osseuses (BMP) et les glycoprotéines Wingless-related site d'intégration (Wnt) [99]. Les processus OPC surveillent également les cellules voisines par des contacts succincts suivis invariablement d'une rétraction. Ce mécanisme d'auto-évitement sous-tend le maintien d'un espacement assez uniforme entre les OPC dans le cerveau et la moelle épinière [103]. Les cellules précurseurs restent abondantes chez l'adulte, représentant 5 % des cellules, et maintiennent le potentiel de générer de nouveaux oligodendrocytes en réponse aux signaux environnementaux [104].

Au début de la vie postnatale, certaines OPC sortent du cycle cellulaire et se différencient en oligodendrocytes immatures pré-myélinisants. Les expressions de NG2 et PDGFRα diminuent [105] tandis que l'expression du sulfatide (O4) et du glycolipide galactocérébroside (GalC) commence [106]. Des changements morphologiques sont initiés, car les cellules s'arborisent abondamment avec des processus qui recherchent des axones pour la myélinisation [107]. Les oligodendrocytes prémyélinisants mûrissent sur plusieurs jours, exprimant des molécules myélinisantes dont la protéine basique de la myéline (MBP), la protéine protéolipide (PLP) et la glycoprotéine associée à la myéline (MAG) [108]. En s'enroulant autour des axones, les cellules arrivent au point final de la lignée : les oligodendrocytes myélinisants exprimant la glycoprotéine myéline/oligodendrocytes (MOG) [109].

Les cellules de la lignée oligodendrocyte expriment les protéoglycanes de sulfate de chondroïtine (CSPG), dont Brevican, Versican isoform V2, Phosphacan et NG2, ainsi que les glycoprotéines Tenascin-R [110,111,112,113,114,115] et Bral1 [116]. Ces molécules sont intégrées dans un complexe avec l'acide hyaluronique, un composant clé de la matrice extracellulaire cérébrale (MEC) [117,118]. L'ECM forme une matrice périsynaptique et axonale dynamique, qui entoure les neurones et les cellules gliales et peut participer aux processus plastiques et adaptatifs du SNC [119, 120]. La MEC est modifiée par les métalloprotéinases matricielles de manière activité-dépendante sous l'action des neurones et des cellules gliales [121,122]. Nous notons que les astrocytes et les neurones produisent également des protéines ECM avec des variantes d'épissage et des profils de glycosylation distincts.

3.2. Interactions des cellules oligodendrogliales avec les neurones

Les interactions bidirectionnelles entre les neurones et les oligodendroglies sont cruciales pour la fonction du circuit cortical. Les OPC détectent le déclenchement des cellules excitatrices ou inhibitrices par des mécanismes distincts mais incomplètement compris, comme décrit dans la revue de Habermacher [123]. Les oligodendrocytes myélinisent les axones des neurones glutamatergiques et GABAergiques et remplissent des fonctions distinctes dans les interactions avec d'autres compartiments neuronaux (Figure 2).

Les cellules oligodendrogliales interagissent avec différents compartiments neuronaux. Représentation schématique des interactions entre les cellules de la lignée oligodendrocytes et les neurones du SNC. Les corps cellulaires neuronaux sont illustrés comme entourés d'oligodendrocytes périneuronaux et de réseaux périneuronaux formant une matrice extracellulaire (ECM) (qui sont spécifiques des cellules PV +). Les oligodendrocytes myélinisants enveloppent les axones de myéline, laissant de petits nœuds non myélinisés de Ranvier. Les nœuds sont enrichis en canaux Na +, en ECM dérivées d'oligodendrogliales et en contact avec des cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC). Les neurones excitateurs et inhibiteurs établissent des contacts synaptiques avec les OPC.

3.2.1. Myélinisation axonale

La myéline correspond à des couches compactées d'extensions de membrane plasmique qui s'enroulent en spirale autour des axones. Les éléments myélinisants du système nerveux périphérique sont les cellules de Schwann, qui forment une seule gaine de myéline autour de chaque axone. Les oligodendrocytes du SNC forment jusqu'à 50 gaines autour de plusieurs axones [124]. Les propriétés isolantes de la myéline permettent une propagation rapide et précise du potentiel d'action sur de longues distances [4,125]. La gaine de myéline autour d'un axone est périodiquement interrompue par des nœuds de Ranvier, de petits domaines fortement enrichis en Na voltage-dépendantv canaux, qui stimulent les potentiels d'action. Différents aspects de la myélinisation des cellules corticales excitatrices et inhibitrices sont décrits dans la section 4. Les oligodendrocytes myélinisants fournissent également un soutien métabolique, notamment l'exportation du lactate vers les axones neuronaux [5,6,7], voir également la revue de Tepavcevic sur le métabolisme énergétique oligodendroglial et ( re)myélinisation dans ce problème.

3.2.2. Interactions périneuronales

Les oligodendrocytes périneuronaux, ou oligodendrocytes satellites, dans les couches corticales profondes entourent préférentiellement le soma et les dendrites basales des neurones glutamatergiques [126,127]. Ils sont moins fréquemment associés aux neurones GABAergiques [126]. Les oligodendrocytes satellites forment de la myéline compacte et agissent pour limiter l'excitabilité de leurs neurones hôtes en tamponnant rapidement le K + après décharge [127].

3.2.3. Interactions nodales

Le regroupement des protéines nodales au cours de la myélinisation dépend des interactions avec les oligodendrocytes (voir section 4.3). Au niveau des nœuds de Ranvier, les protéoglycanes de sulfate de chondroïtine (CSPG dont Brevican, Phosphacan et Versican V2, associés à Tenascin-R et Bral-1) forment des complexes moléculaires polyanioniques qui aident à stabiliser les structures nodales [113,128,129,130]. Ces complexes ont une forte affinité pour les cations et peuvent empêcher la diffusion de Na + aux nœuds et ainsi accélérer la conduction. Les interactions de la MEC avec les molécules d'adhésion cellulaire sont suggérées pour localiser les amas nodaux lors de l'assemblage initial (voir la section 4.3) et contribuent également à stabiliser les nœuds du SNC [129,131,132].

Les analyses ultrastructurales ont fourni la première preuve d'interactions d'autres types de cellules gliales au niveau des nœuds de Ranvier [133,134,135]. Les processus astrocytes peuvent participer au tamponnage potassique au niveau de l'espace nodal [136,137]. Des travaux récents montrent que les cellules microgliales contactent préférentiellement les axones au niveau des nœuds de Ranvier, et la probabilité de contact est augmentée par le K + libéré au niveau des nœuds par l'activité neuronale [138]. Les cellules précurseurs d'oligodendrocytes entrent également en contact avec les ganglions de Ranvier, mais leur rôle reste insaisissable [137]. La présence de types cellulaires distincts indique que les nœuds de Ranvier constituent un site critique pour les interactions entre la glie et les neurones.

3.2.4. Filets périneuronaux

La structure et la composition de la MEC au niveau des sites nodaux du SNC sont similaires à celles des réseaux périneuronaux (PNN) qui enveloppent le soma et les dendrites proximales des neurones inhibiteurs PV + [120]. Les PNN sont suggérés pour stabiliser les connexions synaptiques et ainsi contrôler la plasticité à long terme. Il est à noter que les PNN avec PV + cellules panier se forment pendant le développement post-natal à la fin de la période critique. À ce stade, les expériences sensorielles initient moins efficacement la plasticité dans les circuits neuronaux. La plasticité de la période critique revient lorsque l'ECM est éliminée enzymatiquement par la chondroïtinase ABC, suggérant que les PNN agissent comme un frein à la plasticité dépendante de l'expérience [139, 140, 141]. Les PNN peuvent alors protéger les interneurones de la suractivation sensorielle et stabiliser les réseaux corticaux [142,143], même au prix d'une plasticité corticale réduite et de déficits dans l'acquisition des compétences des adultes [142].

3.3. Effets des cellules de la lignée oligodendrocytes sur les synapses

Les travaux sur la façon dont les cellules gliales affectent le développement du circuit neuronal ont été grandement facilités par la capacité de purifier et de cultiver des neurones de manière isolée. Il y a vingt ans, le laboratoire de Ben Barres a développé des cultures de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) sans glie [144] et a montré que la formation de synapses excitatrices fonctionnelles était renforcée lorsque les astrocytes étaient présents dans les co-cultures [145,146,147]. Des travaux ultérieurs ont montré que le milieu conditionné par les astrocytes améliore la synaptogenèse excitatrice [1]. Il a été démontré que les OPC ou oligodendrocytes régulent la physiologie neuronale en utilisant des approches similaires. La signalisation est indépendante de la myéline et la communication est bidirectionnelle. De plus, les OPC créent des synapses fonctionnelles avec les neurones excitateurs et inhibiteurs [123,148,149]. La sécrétion d'OPC de micro-vésicules contenant des protéines aux actions trophiques, modulatrices et neuroprotectrices contribue à l'homéostasie de la neurotransmission [150,151,152,153,154,155].

Les oligodendrocytes et les OPC participent à une régulation bidirectionnelle de la neurotransmission. L'activité neuronale clive l'ectodomaine NG2 sur la membrane OPC pour libérer un domaine extracellulaire, qui à son tour module la potentialisation à long terme NMDAR-dépendante dans les cellules pyramidales [150]. L'ablation d'OPC induit un déficit de la signalisation glutamatergique par les cellules pyramidales corticales, qui semble être médié par une sécrétion réduite du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) par les cellules NG2 [156]. Les oligodendrocytes matures sécrètent le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) qui module la libération de glutamate par les synapses excitatrices [152]. Les cellules matures affectent également le métabolisme du glutamate via l'enzyme glutamine synthétase [157]. Les effets de l'expression des oligodendrocytes de la glutamine synthétase varient entre les sites cérébraux, probablement en raison de la spécialisation régionale. Alors que le rôle des astrocytes dans l'absorption du glutamate est bien établi, des travaux supplémentaires sont nécessaires pour définir si le glutamate et la glutamine sont échangés directement via des transporteurs d'oligodendrocytes ou indirectement par des intermédiaires astrocytes.

La production récente de cultures pures de neurones GABAergiques permettra de mieux comprendre comment ces cellules sont affectées par les facteurs sécrétés par la glie [158]. Les cultures pures sont basées sur le tri cellulaire de neurones GABAergiques fluorescents [159] de rats VGAT-Venus-Wistar [160]. Ainsi, Turko et al. (2019) ont montré que les facteurs sécrétés gliales influencent la croissance et la survie des cellules inhibitrices et pyramidales et que les facteurs gliaux sont nécessaires à la formation de synapses excitatrices mais non inhibitrices [161]. Cependant, l'identité des cellules gliales n'était pas clairement définie. Notre groupe a récemment tenté de corriger ce déficit par des travaux sur les interactions entre les neurones GABAergiques et les facteurs sécrétés sélectivement par les oligodendroglies [162]. L'analyse électrophysiologique et transcriptomique de neurones GABAergiques uniques a révélé que la présence de cellules gliales augmente la décharge de potentiel d'action et les potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSP) reçus par les neurones GABAergiques [162]. Des changements spécifiques dans les transcrits pour les canaux ioniques, les transporteurs et les marqueurs synaptiques ont été induits dans des co-cultures de cellules gliales et l'ajout de milieu conditionné d'oligodendrocytes [163] à des cultures de cellules GABAergiques purifiées a en partie récapitulé ces changements. Le milieu conditionné a également augmenté la longueur axonale et les arborisations dendritiques [112,162]. Le BDNF, un régulateur clé du développement des interneurones [164], est un candidat possible comme l'un des facteurs sécrétés par les oligodendrocytes.


Tome 3

Nathan Stevenson , Anton Tokariev , dans Encyclopédie du génie biomédical , 2019

EEG néonatal

L'EEG enregistré au niveau du cuir chevelu est la somme des potentiels principalement postsynaptiques des neurones pyramidaux du cortex déformés par la matière dure, le crâne et le cuir chevelu (Nunez et Srinivasan, 2006). Il mesure le potentiel de champ moyen du cortex externe, est de l'ordre de dizaines de microvolts (μV) et est échantillonné à des fréquences allant de 100 à 2000 Hz (des fréquences d'échantillonnage plus élevées ont tendance à être utilisées pour les études de potentiel évoqué). L'EEG a une large plage dynamique et est généralement quantifié avec 16 bits sur une plage de tensions EEG allant de centaines à plusieurs dizaines de milliers de microvolts selon le fabricant. Les fréquences dominantes de l'EEG néonatal sont plus basses que chez l'adulte et se concentrent dans les bandes delta, thêta et alpha (0,5 à 13 Hz). En règle générale, un enregistrement EEG dans l'USIN est soit un enregistrement instantané d'environ 1 à 2 heures avec 8 à 19 électrodes, soit un enregistrement de longue durée de 24 à plus de 72 heures avec 2 à 4 électrodes. Les neurophysiologistes cliniques recommandent des enregistrements de longue durée avec de nombreuses électrodes ( Shellhaas et al., 2011 ), une pratique qui n'est pas couramment mise en œuvre dans les unités de soins intensifs néonatals en raison du coût de l'expertise requise pour maintenir une qualité EEG suffisante et interpréter les enregistrements ultérieurs ( Abend et al., 2015 ).


Développement de cellules pyramidales corticales et de dendrites interneuronales : un rôle pour les sous-unités du récepteur Kainate et NETO1

Au cours du développement neuronal, les récepteurs AMPA (AMPAR) et les récepteurs NMDA (NMDAR) sont importants pour la différenciation neuronale. Les récepteurs Kainate (KAR) sont étroitement liés aux AMPAR et impliqués dans la régulation de l'activité du réseau cortical. Cependant, leur rôle dans la croissance des neurites et la différenciation des neurones corticaux n'est pas clair. Ici, nous avons utilisé des agonistes KAR et la surexpression de sous-unités KAR sélectionnées et de leurs neuropilines auxiliaires et protéines de type tolloïde, les NETO, pour étudier leur influence sur la croissance dendritique et l'activité du réseau dans les cultures organotypiques du cortex visuel du rat. Le kainate à 500 nM a amélioré l'activité du réseau et favorisé le développement de dendrites dans les cellules pyramidales des couches II/III, mais pas les interneurones. La surexpression de GluK2 a favorisé la croissance dendritique dans les cellules pyramidales et les interneurones. Les transfectants GluK2 étaient très actifs et agissaient comme moteurs de l'activité du réseau. GluK1 et NETO1 ont spécifiquement favorisé la croissance dendritique des interneurones. Notre étude fournit de nouvelles informations sur les rôles des KAR et des NETO dans le développement morphologique et physiologique du cortex visuel.

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Résultats

Présence de -actinine et de synaptopodine dans l'AIS des neurones pyramidaux néocorticaux et hippocampiques

Microscopie optique

Lorsque l'immunocoloration de la protéine synaptopodine a été examinée à la fois dans le néocortex et l'hippocampe (figures 1 et 2), la protéine s'est avérée être distribuée dans de petits points qui, dans les études précédentes, étaient considérés comme correspondant aux épines dendritiques (Deller et al. 2003, 2007 Vlachos et al. 2009). Dans la couche III du néocortex et dans la région CA1, une double coloration par immunofluorescence pour la synaptopodine et l'ankyrine G a révélé la présence d'éléments allongés immunoréactifs (-ir) pour la synaptopodine et plus gros que ceux situés dans les épines dendritiques. Étant donné que ces structures contenaient également le marqueur AIS ankyrine G, la synaptopodine a été considérée comme localisée dans l'AIS (Fig. 1A–C,J–L). Les éléments de l'AIS synaptopodine-ir étaient particulièrement importants dans une population de neurones pyramidaux de la couche V où un seul processus synaptopodine-ir en forme de tige s'étendait sur presque toute la longueur de l'AIS (Fig. 1G, J–L). Ces processus synaptopodin-ir en forme de bâtonnet étaient fréquemment une continuation de, et provenaient probablement de, des structures allongées similaires dans le cytoplasme à la base du soma pyramidal qui changeaient de direction pour entrer dans la butte d'axone et pour se diriger vers l'AIS ( Fig. 2A –C). Ces processus synaptopodine-ir en forme de bâtonnet étaient plus fréquemment retrouvés dans les aires somatosensorielles et motrices que dans d'autres régions du néocortex frontal pariétal, temporal et occipital, où ils étaient très rares.

Microphotographies de coupes de rat (UNEC, JL) ou souris (je, MO) néocortex pariétal montrant la distribution de la synaptopodine (synpo) et de la -actinine-2 dans l'AIS. Notez la présence de grands amas d'immunocoloration synaptopodine dans l'AIS, qui a été identifiée par immunocoloration pour l'ankyrine G. Notez que le nombre et la longueur des éléments synaptopodin-ir varient entre les différentes populations neuronales de cellules pyramidales (couche III dans UNEF et la couche V dans gO). L'α-actinine-2 et la synaptopodine colocalisent en grande partie dans l'organite cisternale de l'AIS dans les cellules pyramidales néocorticales (je). MO montrer la présence de -actinine (M) et des filaments d'actine épais, comme le révèle la coloration à la phalloïdine (N), dans un long élément en forme de tige dans l'AIS des cellules pyramidales de la couche V. Barre d'échelle = 6 m dans UNEF et JO et 16 m dans gje.

Microphotographies de coupes de rat (UNEC, JL) ou souris (je, MO) néocortex pariétal montrant la distribution de la synaptopodine (synpo) et de la -actinine-2 dans l'AIS. Notez la présence de grands amas d'immunocoloration synaptopodine dans l'AIS, qui a été identifiée par immunocoloration pour l'ankyrine G. Notez que le nombre et la longueur des éléments synaptopodin-ir varient entre les différentes populations neuronales de cellules pyramidales (couche III dans UNEF et la couche V dans gO). L'α-actinine-2 et la synaptopodine colocalisent en grande partie dans l'organite cisternale de l'AIS dans les cellules pyramidales néocorticales (je). MO montrer la présence de -actinine (M) et des filaments d'actine épais, comme le révèle la coloration à la phalloïdine (N), dans un long élément en forme de tige dans l'AIS des cellules pyramidales de la couche V. Barre d'échelle = 6 m dans UNEF et JO et 16 m dans gje.

Microphotographies de la couche V du néocortex pariétal de souris (UNEC) et la région hippocampique CA1 (J) montrant la distribution de la synaptopodine (synpo), de la -actinine-2 et de l'actine dans l'AIS. UNEC montrent que l'élément en forme de bâtonnet dans les cellules pyramidales de la couche V, immunocoloré pour la synaptopodine (UNE), ou double coloration pour la -actinine et l'actine/phalloïdine (BC), est une continuation des éléments marqués dans le cytoplasme à la base du soma pyramidal qui traversent la butte axonale et pénètrent dans l'AIS (pointes de flèches). Notez la grande étendue de la colocalisation de la -actinine-2 et de la synaptopodine dans l'organite cisternale de l'AIS (g, flèches). HJ montrer la présence de -actinine (H) et des filaments d'actine (tels que révélés par la coloration à la phalloïdine : je) dans l'AIS des cellules pyramidales CA1 (flèches). Barre d'échelle = 7,5 m dans UNE, 10,5 m dans B, 5,7 m dans , et 4,7 m dans EJ.

Microphotographies de la couche V du néocortex pariétal de souris (UNEC) et la région hippocampique CA1 (J) montrant la distribution de la synaptopodine (synpo), de la -actinine-2 et de l'actine dans l'AIS. UNEC montrent que l'élément en forme de bâtonnet dans les cellules pyramidales de la couche V, immunocoloré pour la synaptopodine (UNE), ou double coloration pour la -actinine et l'actine/phalloïdine (BC), est une continuation des éléments marqués dans le cytoplasme à la base du soma pyramidal qui traversent la butte axonale et pénètrent dans l'AIS (pointes de flèches). Notez la grande étendue de la colocalisation de la -actinine-2 et de la synaptopodine dans l'organite cisternale de l'AIS (g, flèches). HJ montrer la présence de -actinine (H) et des filaments d'actine (tels que révélés par la coloration à la phalloïdine : je) dans l'AIS des cellules pyramidales CA1 (flèches). Barre d'échelle = 7,5 m dans UNE, 10,5 m dans B, 5,7 m dans , et 4,7 m dans EJ.

L'immunocoloration de la -actinine a révélé un schéma d'immunocoloration similaire à celui de la synaptopodine, à la fois dans le néocortex et dans l'hippocampe CA1 (figures 1 et 2). Dans l'AIS, les éléments α-actinine-ir se sont largement colocalisés avec la synaptopodine dans des expériences de double marquage, bien qu'ils aient été observés de manière variable dans les différentes populations neuronales examinées. Les anticorps dirigés contre la -actinine ont marqué l'organite cisternale dans les cellules pyramidales néocorticales de la couche III ( Fig. 1D-F) et CA1 ( Fig. 2D-G) et l'élément en forme de bâtonnet dans les neurones pyramidaux de la couche V ( Fig. 1G-L et 2A –C).

Une double coloration avec des anticorps dirigés contre la -actinine et la phalloïdine marquée Alexa Fluor 488 a démontré que les filaments d'actine étaient associés aux structures α-actinine-ir dans l'AIS. Cette association comprenait les éléments en forme de bâtonnet dans l'AIS des cellules pyramidales de la couche V (Fig. 1M–O et 2B,C) et les éléments de l'organite cisternale dans les cellules pyramidales CA1 (Fig. 2H–J).

Microscopie électronique

Le marquage à l'immunoperoxydase pré-inclusion et la microscopie électronique corrélative à la lumière et à la transmission (MET) ont été utilisés dans des études ultrastructurales pour analyser la distribution subcellulaire de la -actinine dans l'AIS (figures 3 et 4). Bien que le produit de réaction de l'immunoperoxydase -actinine était évident dans les épines dendritiques et l'AIS, nous avons concentré notre attention ici sur l'AIS. En effet, la -actinine s'est associée à des structures en forme de bâtonnets dans l'AIS des neurones néocorticaux de la couche V (Fig. 3) et dans les puncta de la strate pyramidale des neurones de l'hippocampe CA1 (Fig. 4). Ce motif a d'abord été identifié dans des coupes de vibratome (50 µm d'épaisseur, Fig. 3A), qui ont ensuite été noyées dans de l'araldite pour obtenir des coupes semi-fines (2 µm d'épaisseur, Figs 3B et 4A) qui ont été étudiées en microscopie optique. Après avoir sélectionné le domaine d'intérêt qui comprenait les AIS -actinine-ir, les sections semi-fines ont été intégrées dans de l'araldite pour générer des sections ultrafines pouvant être étudiées par MET (Figs 3C-E et 4B-I). Au niveau ultrastructural, les AIS ont été identifiés sur la base de la présence de la sous-couche sous la membrane plasmique (pointes de flèches sur les figures 3 et 4) et à travers les faisceaux de microtubules.

Images de microscopie optique et électronique corrélatives montrant la distribution de la -actinine dans l'organite cisternale des cellules pyramidales de la couche V du néocortex pariétal de souris. La structure en forme de bâtonnet -actinine-ir dans l'AIS des neurones pyramidaux de la couche V (AIS) a été identifiée par microscopie optique dans des coupes de vibratome (50 μm, UNE) et en coupes semi-fines (2 m) et par microscopie électronique en coupes ultrafines (70 nm, CE). Les régions encadrées dans UNE et B sont affichés à un grossissement plus élevé dans B et C, respectivement. Notez que le produit de la réaction -actinine se trouve dans une structure tubulaire centrale qui s'étend le long de l'AIS (flèches dans ), et les plaques de produit de réaction de la -actinine (astérisques) sont associées à des microfilaments. Les pointes de flèches pointent vers le sous-poil AIS. mt : microtubules. Barre d'échelle : 16 m dans UNE, 11 m dans B, 6 m dans C, 800 nm dans , et 270 nm dans E.

Images de microscopie optique et électronique corrélatives montrant la distribution de la -actinine dans l'organite cisternale des cellules pyramidales de la couche V du néocortex pariétal de souris. La structure en forme de bâtonnet -actinine-ir dans l'AIS des neurones pyramidaux de la couche V (AIS) a été identifiée par microscopie optique dans des coupes de vibratome (50 μm, UNE) et en coupes semi-fines (2 m) et par microscopie électronique en coupes ultrafines (70 nm, CE). Les régions encadrées dans UNE et B sont affichés à un grossissement plus élevé dans B et C, respectivement. Notez que le produit de la réaction -actinine se trouve dans une structure tubulaire centrale qui s'étend le long de l'AIS (flèches dans ), et les plaques de produit de réaction de la -actinine (astérisques) sont associées à des microfilaments. Les pointes de flèches pointent vers le sous-poil AIS. mt : microtubules. Barre d'échelle : 16 m dans UNE, 11 m dans B, 6 m dans C, 800 nm dans , et 270 nm dans E.

Microscopie optique et électronique corrélative montrant la distribution de la -actinine dans l'organite cisternale de l'AIS dans les cellules pyramidales de l'hippocampe CA1. De nombreux grands points d'immunocoloration de la -actinine ont été identifiés par microscopie optique (régions encadrées dans UNE) et sont montrés à un grossissement plus élevé dans différentes sections ultrafines (B et E). C et F sont des grossissements plus élevés de B et E, respectivement. g montre 2 -actinine-ir puncta (5 et 6) correspondant aux organites cisternales d'un seul AIS montré à un grossissement plus élevé dans H et je. Notez que le produit de réaction -actinine s'associe aux plaques denses entre les citernes membraneuses des organites cisternales. Les astérisques indiquent la position des corps cellulaires neuronaux. ais, segment initial de l'axone mt, microtubules. Barre d'échelle : 17 m dans UNE 6 m dans B 620 nm dans C 500 nm dans , F, H, et je 1,6 m dans E et 1,3 m dans g.

Microscopie optique et électronique corrélative montrant la distribution de la -actinine dans l'organite cisternale de l'AIS dans les cellules pyramidales de l'hippocampe CA1. De nombreux grands points d'immunocoloration de la -actinine ont été identifiés par microscopie optique (régions encadrées dans UNE) et sont montrés à un grossissement plus élevé dans différentes sections ultrafines (B et E). C et F sont des grossissements plus élevés de B et E, respectivement. g montre 2 -actinine-ir puncta (5 et 6) correspondant aux organites cisternales d'un seul AIS montré à un grossissement plus élevé dans H et je. Notez que le produit de réaction -actinine s'associe aux plaques denses entre les citernes membraneuses des organites cisternales. Les astérisques indiquent la position des corps cellulaires neuronaux. ais, segment initial de l'axone mt, microtubules. Barre d'échelle : 17 m dans UNE 6 m dans B 620 nm dans C 500 nm dans , F, H, et je 1,6 m dans E et 1,3 m dans g.

Dans l'AIS des neurones pyramidaux néocorticaux de la couche V ( Fig. 3), la distribution de la -actinine variait par rapport à celle des cellules CA1 ( Fig. 4), et les structures en bâtonnets de la -actinine-ir ne correspondent pas à l'organite cisternale. Au contraire, la α-actinine semblait être associée à une structure allongée très proéminente qui s'étendait sur toute la longueur de l'AIS, parallèlement à l'axe longitudinal de l'axone ( Fig. 3D, E). Nous appelons cette structure "l'organite sacculaire géante", qui était composée d'un nombre discret de longs tubules et de sacs aplatis orientés parallèlement au grand axe de l'axone et situés entre les microtubules et les microfilaments. Le produit de réaction -actinine DAB a été observé entre les sacs et souvent, sous forme de taches discontinues le long des surfaces de cet organite sacculaire géant. De plus, des faisceaux de filaments sans -actinine mais préférentiellement orientés parallèlement à l'organite sacculaire géante se sont fréquemment associés latéralement ou se terminant par des plaques de α-actinine (Fig. 3E). On a souvent observé que l'extrémité opposée de ces filaments s'associait aux microtubules AIS ou au côté cytoplasmique du plasmalemme. En coupe transversale, ces filaments mesuraient moins de 10 nm de diamètre, et le motif de coloration à la phalloïdine dans l'AIS décrit ci-dessus suggère qu'il s'agissait de microfilaments d'actine qui pourraient participer à la stabilisation de l'organite sacculaire géante au sein de cette population de neurones pyramidaux de la couche V. .

Dans l'AIS des neurones pyramidaux CA1 et conformément aux études précédentes, l'organite cisternale était constituée d'empilements de citernes membraneuses plates avec une lumière étroite alternant avec un matériau dense aux électrons. Les citernes les plus externes associées à la face interne de la membrane plasmique. Le produit de la réaction -actinine DAB a été trouvé à différents points le long de l'AIS (Fig. 4G), et il était associé aux plaques denses de matériau situées entre les citernes membraneuses de l'organite cisternal (Fig. 4). En revanche, il était généralement absent des autres structures endoplasmiques lisses de l'AIS.

Neurones hippocampiques cultivés

Expression de la -actinine dans l'AIS

Dans les neurones hippocampiques cultivés pendant 21 jours, la -actinine a été détectée dans l'AIS, qui a été identifiée par immunocoloration pIκBα. Comme dans le tissu CA1, le marquage à l'-actinine dans l'AIS s'est regroupé en de nombreuses petites plaques le long de l'AIS (Fig. 5A–H), qui correspondaient probablement à l'organite cisternale. Les éléments -actinine-ir grands et ronds ou légèrement allongés étaient enrichis dans l'AIS mais pas dans les régions plus distales de l'axone ou dans les processus dendritiques. En raison de la distribution similaire de la -actinine et de la synaptopodine dans l'AIS (Bas Orth et al. 2007 Sánchez-Ponce et al. 2011b), nous avons effectué une double coloration pour évaluer si elles pouvaient colocaliser. En effet, la -actinine largement colocalisée avec la synaptopodine dans la grande majorité des neurones, suggérant une association structurelle et/ou fonctionnelle (Fig. 5E–H).

Microphotographies en microscopie confocale montrant des neurones hippocampiques cultivés pendant 18 jours et double immunocoloration pour la α-actinine-2 (vert) et pIκBα (rouge) dans UNE, et pour la α-actinine-2 (vert) et la synaptopodine (rouge) dans EH. Des grossissements plus élevés des régions encadrées de UNE et E sont montrés dans B et FH, respectivement. Notez la présence de grands amas d'immunocoloration -actinine-2 dans le segment initial d'un processus unique émergeant du soma, identifié comme l'AIS par immunocoloration pIκBα. Notez la grande étendue de la colocalisation de la -actinine-2 et de la synaptopodine dans les microdomaines des organites cisternales de l'AIS (EH). Barre d'échelle = 9,5 m dans UNE et E et 3,5 m dans B et FH.

Microphotographies en microscopie confocale montrant des neurones hippocampiques cultivés pendant 18 jours et double immunocoloration pour la α-actinine-2 (vert) et pIκBα (rouge) dans UNE, et pour la α-actinine-2 (vert) et la synaptopodine (rouge) dans EH. Des grossissements plus élevés des régions encadrées de UNE et E sont montrés dans B et FH, respectivement. Notez la présence de grands amas d'immunocoloration -actinine-2 dans le segment initial d'un seul processus émergeant du soma, identifié comme l'AIS par immunocoloration pIκBα. Notez la grande étendue de la colocalisation de la -actinine-2 et de la synaptopodine dans les microdomaines des organites cisternales de l'AIS (EH). Barre d'échelle = 9,5 m dans UNE et E et 3,5 m dans B et FH.

Expression développementale de la -actinine dans l'AIS

Nous avons étudié l'expression et la localisation de la -actinine dans des neurones hippocampiques en culture à différents stades de développement (1, 3, 5, 8, 10, 13, 15, 18 et 21 DIV : Fig. 6). Dans ce modèle, un axone apparaît pour la première fois dans ces cellules après 24 à 36 h de culture ( Banker et Goslin 1988), et avant l'excroissance de l'axone, une légère immunocoloration α-actinine a été observée dans le soma avec une coloration plus intense aux extrémités des neurites, comme indiqué précédemment pour la synaptopodine ( Sánchez-Ponce et al. 2011b). Au cours de la première semaine in vitro, la -actinine était pratiquement absente de l'AIS des neurones (Fig. 6A–C), après quoi la proportion de neurones avec de grosses particules le long de l'AIS, contenant de la -actinine, augmentait progressivement à mesure que le développement s'est poursuivi (0 % à 24 et 72 h, 2,21 ± 0,84 % à 5 DIV, 9,97 ± 3,12 % à 8 DIV, 24,21 ± 2,73 % à 10 DIV, 31,01 ± 2,3 % à 13 DIV, 40,31 ± 0,71 % à 15 DIV , 42,87 ± 1,62 % à 18 DIV et 47,76 ± 2,90 % à 21 DIV données obtenues à partir de 3 expériences distinctes où m 100 pour chaque point temporel et expérience : Fig. 6). De plus, à partir d'environ 15 DIV, des synaptopodines-ir puncta ont été observées dans les processus dendritiques, correspondant probablement aux épines dendritiques où la α-actinine a été localisée précédemment ( Nakagawa et al. 2004).

Maturation de l'expression de l'-actinine-2 dans le développement des neurones de l'hippocampe. Les neurones de l'hippocampe ont été cultivés in vitro à faible densité pendant différentes durées (5000/cm 2 ), fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %, et doublés colorés avec des anticorps contre la α-actinine-2 (vert) et pIκBα (rouge), avant d'être contre-coloré au DAPI (bleu). Les images montrent une immunocoloration diffuse de la α-actinine-2 dans les corps cellulaires. A partir de 10 DIV (gL), la -actinine-2 s'est regroupée en grandes plaques intensément colorées dans le segment initial d'un processus unique émergeant du soma, qui a été identifié comme l'AIS (flèches) par la présence de pIκBα. Notez également que la -actinine-2 est absente de l'AIS pendant les 10 premières DIV. La barre d'échelle indique 7 m.

Maturation de l'expression de l'-actinine-2 dans le développement des neurones de l'hippocampe. Les neurones de l'hippocampe ont été cultivés in vitro à faible densité pendant différentes durées (5000/cm 2 ), fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %, et doublés colorés avec des anticorps contre la α-actinine-2 (vert) et pIκBα (rouge), avant d'être contre-coloré au DAPI (bleu). Les images montrent une immunocoloration diffuse de la α-actinine-2 dans les corps cellulaires. A partir de 10 DIV (gL), la α-actinine-2 s'est regroupée en grandes plaques intensément colorées dans le segment initial d'un processus unique émergeant du soma, qui a été identifié comme l'AIS (flèches) par la présence de pIκBα. Notez également que la -actinine-2 est absente de l'AIS pendant les 10 premières DIV. La barre d'échelle indique 7 m.

Le regroupement de la -actinine dans l'AIS dépend du cytosquelette d'actine

Il a récemment été démontré que l'organite cisternale est stabilisée par le cytosquelette d'actine puisque la dépolymérisation induite par la cytochalasine D affecte à la fois les caractéristiques structurelles et neurochimiques de l'organite cisternale (Sánchez-Ponce et al. 2011b). Nous avons analysé la distribution de la -actinine dans l'AIS après traitement avec l'agent dépolymérisant l'actine, la cytochalasine D (Figs 7-9) pour déterminer si les filaments d'actine pouvaient stabiliser l'organite cisternale et la concentration de la α-actinine dans l'AIS. Dans nos conditions, le traitement à la cytochalasine D a effectivement perturbé le cytosquelette d'actine, comme en témoigne le changement des schémas de coloration de la phalloïdine par rapport aux neurones témoins (Fig. 7A, B), bien que la morphologie générale des neurones ne semble pas être affectée, comme révélé par immunocoloration MAP (Fig. 7C, D). En effet, la cytochalasine D a modifié la coloration de la phalloïdine à la fois dans le domaine somatodendritique et dans les axones, qui étaient considérés comme des processus MAP2 négatifs individuels sortant du corps cellulaire (Fig. 7E–J). La forme des éléments α-actinine-ir a également été affectée, passant de structures rondes à des structures allongées, et augmentant en longueur dans les neurones traités avec la cytochalasine D (Fig. 8). Ces changements ont non seulement affecté les éléments α-actinine-ir dans l'AIS, tels qu'identifiés par immunocoloration pIκBα, mais également ceux situés dans le corps cellulaire et les processus dendritiques (Fig. 8G, H). De plus, la -actinine colocalisée complètement avec la synaptopodine dans les processus AIS des neurones de contrôle ( Fig. 8D-F) et dans les structures allongées formées dans les différents compartiments neuronaux en présence de cytochalasine D, y compris l'AIS ( Fig. 8H, L –N).

Images confocales montrant un neurone hippocampique de culture témoin (UNE, C, et Eg) et un neurone traité avec l'agent dépolymérisant l'actine, la cytochalasine D (B, , et HJ). Les filaments d'actine ont été colorés avec de l'alexa 488-phalloidine dans les cellules (UNE, B, E, et H), ou ils ont été immunocolorés avec des anticorps anti-MAP 2 (C, , F, et je) pour révéler leur morphologie. Régions encadrées dans UNE, y compris l'AIS négatif MAP2 (pointes de flèches), sont affichés à un grossissement plus élevé dans EJ. Malgré l'absence apparente d'altérations morphologiques flagrantes, notez le modèle modifié de coloration de la phalloïdine dans les neurones traités par la cytochalasine D par rapport aux neurones témoins, à la fois dans le domaine somadendritique et l'AIS (flèches dans EJ).

Images confocales montrant un neurone hippocampique de culture témoin (UNE, C, et Eg) et un neurone traité avec l'agent dépolymérisant l'actine, la cytochalasine D (B, , et HJ). Les filaments d'actine ont été colorés avec de l'alexa 488-phalloidine dans les cellules (UNE, B, E, et H), ou ils ont été immunocolorés avec des anticorps anti-MAP 2 (C, , F, et je) pour révéler leur morphologie. Régions encadrées dans UNE, y compris l'AIS négatif MAP2 (pointes de flèches), sont affichés à un grossissement plus élevé dans EJ. Malgré l'absence apparente d'altérations morphologiques flagrantes, notez le modèle modifié de coloration de la phalloïdine dans les neurones traités par la cytochalasine D par rapport aux neurones témoins, à la fois dans le domaine somadendritique et l'AIS (flèches dans EJ).

Dépendance au cytosquelette d'actine. Images confocales montrant que les caractéristiques morphologiques de la synaptopodine (synpo) (H, LN) et -actinine-2 (gN) les éléments positifs dans l'AIS sont affectés par le traitement à la cytochalasine D des neurones hippocampiques par rapport aux cellules témoins (UNEF). Notez la diminution du nombre d'éléments synaptopodin-ir dans l'AIS et l'augmentation de leur longueur (). Des grossissements plus élevés des régions encadrées de g et H sont montrés dans jeK et LN, respectivement. Barres d'échelle = 6 m dans UNEF et jeN et 9 m dans g et H.

Dépendance au cytosquelette d'actine. Images confocales montrant que les caractéristiques morphologiques de la synaptopodine (synpo) (H, LN) et -actinine-2 (gN) les éléments positifs dans l'AIS sont affectés par le traitement à la cytochalasine D des neurones hippocampiques par rapport aux cellules témoins (UNEF). Notez la diminution du nombre d'éléments synaptopodin-ir dans l'AIS et l'augmentation de leur longueur (). Des grossissements plus élevés des régions encadrées de g et H sont montrés dans jeK et LN, respectivement. Barres d'échelle = 6 m dans UNEF et jeN et 9 m dans g et H.

Ces résultats indiquent que l'intégrité du cytosquelette d'actine ne semble pas être requise pour l'association structurelle et/ou fonctionnelle de la -actinine et de la synaptopodine. Cependant, ils montrent qu'en plus de la synaptopodine, la position stratégique de la -actinine est affectée par l'état polymérisé des microfilaments d'actine et que le cytosquelette d'actine joue un rôle actif dans le maintien des caractéristiques morphologiques de l'organite cisternal dans l'AIS. Conformément aux résultats des coupes de cerveau, les filaments d'actine marqués à la phalloïdine étaient associés à la -actinine-ir dans l'AIS des cellules de culture hippocampique de contrôle (Fig. 9A–D,I–L). De plus, la cytochalasine D a modifié les schémas de coloration de la phalloïdine dans différentes régions cellulaires, y compris l'AIS, reflétant l'effet de la dépolymérisation de l'actine F dans nos conditions (Fig. 9E, H, M, Q). Ces modifications ont été associées à l'allongement de la synaptopodine-ir ( Fig. 9E–H) et de la -actinine-ir AIS ( Fig. 9M–Q), soutenant davantage l'implication du cytosquelette d'actine dans le maintien des caractéristiques morphologiques de l'organite cisternale dans l'AIS.

Images confocales montrant la relation entre les filaments d'actine AIS, marqués avec de la phalloïdine couplée à l'Alexa 488 et l'organite cisternale immunoréactive pour la synaptopodine (synpo) ou la α-actinine-2. Notez que les altérations du cytosquelette d'actine induites par la cytochalasine D, révélées par des changements dans la distribution de la F-actine marquée à la phalloïdine, sont parallèles à l'allongement de l'organite cisternale synaptopodine-ir ou -actinine-2-ir dans l'AIS . La barre d'échelle représente 17 m dans UNE, E, je, et M et 6,5 m dans B, FH, JL, et OQ.

Images confocales montrant la relation entre les filaments d'actine AIS, marqués avec de la phalloïdine couplée à l'Alexa 488 et l'organite cisternale immunoréactive pour la synaptopodine (synpo) ou la -actinine-2. Notez que les altérations du cytosquelette d'actine induites par la cytochalasine D, révélées par des changements dans la distribution de la F-actine marquée à la phalloïdine, sont parallèles à l'allongement de l'organite cisternale synaptopodine-ir ou -actinine-2-ir dans l'AIS . La barre d'échelle représente 17 μm dans UNE, E, je, et M et 6,5 m dans B, FH, JL, et OQ.


Résultats

Imagerie à résolution axonale unique de la dégénérescence wallérienne dans le cerveau vivant

Afin d'étudier la progression de la WD à une résolution d'axone unique sur plusieurs jours dans le cerveau des mammifères, nous avons implanté des fenêtres crâniennes sur le cortex somatosensoriel de la souris [43] et combiné l'imagerie à 2 photons avec un paradigme de microlésion bien établi basé sur le laser femtoseconde. ablation subcellulaire médiée [36, 40] (Fig. 1a, b). Pour surveiller l'intégrité de la membrane axonale en temps réel [4, 7], nous avons opté pour une forme de GFP ciblée sur la membrane sous le promoteur Thy1.2, qui dans le cortex cérébral entraîne l'expression du transgène principalement dans les cellules excitatrices de couches corticales 2/3/5/6 et origine thalamique [44]. Pour démontrer la puissance de cette méthodologie pour l'étude de l'axone cortical WD, nous décrivons plusieurs applications visant à faire la lumière sur l'évolution dans le temps et les facteurs régulateurs de la dégénérescence dans les circuits néocorticaux blessés.

Imagerie à résolution axonale unique de la dégénérescence axonale dans le cerveau vivant. une Chronologie de l'imagerie et des blessures pour étudier la dégénérescence des axones corticaux in vivo. b Une région de l'axone prête pour la lésion (à gauche), un masque binaire (4 m) est placé sur l'axone (cercle vert) et un faisceau laser focalisé utilisé pour induire l'axotomie, vérifié par imagerie immédiatement après la lésion (à droite). Le proximal est en haut et le distal en bas. c Dessins représentatifs des segments axonaux avant lésion utilisés tout au long de l'étude. Les cercles noirs indiquent les terminaisons axonales terminales. Un axone représentatif avant lésion, longueur totale 1289 µm. e Dessins représentatifs de la partie déconnectée de l'axone dans la boîte en pointillés illustrant la dégénérescence axonale à des moments choisis. Le temps en heures post-lésion et le pourcentage d'axone restant sont indiqués. F Exemple représentatif de quantification du début de la dégénérescence (23 h) et g calcul du taux de fragmentation de l'axone dans , e (1,45 µm/min). Barre d'échelle = 5 m (b), 150 m (c), 200 µm () et 300 m (e)

Une forme d'apparition rapide de dégénérescence wallérienne

Des axones corticaux individuels ont été identifiés comme des terminaisons terminales et sectionnés à l'aide d'une lésion à médiation laser (Fig. 1b–d) [37,38,39] pour générer des segments axonaux déconnectés de longueur connue du bord du site de la lésion à la terminaison terminale ( plage 0,12–1,5 mm). Le début (Fig. 1e, f) et le taux (Fig. 1e, g) de fragmentation ont été calculés pour chaque axone par une analyse détaillée des images capturées séquentiellement. Pour déterminer le début et le taux de fragmentation, les axones sectionnés ont été imagés à des intervalles réguliers allant jusqu'à 5 h (ou pour un sous-ensemble de 8 axones de moins de 2 h, voir les méthodes) et le moment de la séance d'imagerie précédant immédiatement le premier signe de rupture clairement visible dans l'axone (c'est-à-dire fragmentation) enregistrée comme le « temps d'apparition ». Une diminution de la longueur de plus de 10 m sur deux séances consécutives et une rupture nette de la tige axonale ont été considérées comme une dégénérescence. À chaque session d'imagerie suivante, la somme des longueurs de fragments individuels a été exprimée en pourcentage de la longueur de l'axone déconnecté immédiatement avant la fragmentation. Le gradient (m) de la pente résultante a été utilisé pour calculer le taux de fragmentation en utilisant la formule oui = mx + c (où c est le oui intercepter). Nous avons constaté que les axones déconnectés plus courts, <

600 m de longueur, a commencé le processus de dégénérescence en se fragmentant beaucoup plus tôt que les segments plus longs, >

600 µm de longueur (Fig. 2a, b, Fiche complémentaire 1). La relation entre la longueur et les temps d'apparition de 38 axones corticaux sectionnés a suggéré la présence de deux types de réponses de dégénérescence (Fig. 2c).

Une forme d'apparition rapide de dégénérescence wallérienne dans le cortex adulte. une Images représentatives d'un axone long se terminant par une dégénérescence wallérienne (WD) avec le temps post-lésion et le pourcentage d'axone perdu indiqués. b Des images représentatives d'un axone plus court se terminant par une WD à début rapide (roWD) avec le temps post-lésion et le pourcentage d'axone perdu indiqués. c Diagramme de dispersion indiquant la présence de deux populations axonales avec un temps de début de fragmentation différent. Longueur de survie de chaque axone blessé in vivo (m = 38) sur les points temporels indiqués illustrant une population en roWD (lignes bleues). e Histogramme démontrant un temps d'apparition précoce significatif de la fragmentation des axones < 600 um de longueur (roWD, bleu) par rapport aux axones plus longs (WD, gris). Moyenne ± SEM. Mann Whitney U test. ****p < 0,0001. F, g Aucune corrélation entre le temps et la durée d'apparition de la roWD (f, m = 21 axones < 600 μm de 13 souris, p > 0,05) ou pour les axones plus longs soumis à une WD (g, m = 17 axones > 600 μm de 14 souris, p > 0,05). Barre d'échelle : 135 m (une), 70 m (b). Pour d'autres exemples de fragmentation des axones comme dans les panneaux une-b, voir le fichier supplémentaire 1

Suite à cette observation de bimodalité au sein des données de longueur axonale et de temps d'apparition de la fragmentation, nous avons cherché à tester rigoureusement l'existence de deux populations. Les deux composantes gaussiennes de ces distributions bimodales ont été ajustées à l'aide des packages R mixtools (version 1.0.2). La moyenne et les écarts types ont été calculés pour ces composantes gaussiennes modélisées, et les intervalles de confiance supérieurs à 95 % des composantes avec la moyenne inférieure à la fois dans les mesures de temps d'apparition et de longueur identifiées. Cela a permis de classer un sous-ensemble de points de données en tant que valeurs aberrantes significatives par rapport aux composantes inférieures du temps et de la durée d'apparition. Cette sous-classe de points de données s'est avérée avoir des temps d'apparition moyens significativement plus élevés par rapport au reste des données (p < 0,01, test de somme des rangs de Wilcoxon). En effet, le suivi continu des axones blessés jusqu'à 153 h à des intervalles de < 5 h pour capturer le début de la fragmentation a montré que les segments axonaux transectés plus longs (généralement > 600 m de la moyenne finale = 973 ± 65 μm, m = 17 axones provenant de 14 souris) a systématiquement initié la fragmentation après 19 à 127 h conformément à l'apparition relativement lente décrite dans la littérature WD (15 sur 17 exemples, c'est-à-dire 88 %, Fig. 2a, d, e). En revanche, des segments axonaux transectés plus courts (généralement < 600 m de la moyenne finale = 339 ± 32 μm, m = 21 axones de 13 souris) a systématiquement initié la fragmentation en moyenne

20 fois plus tôt que les portions plus longues (20 exemples sur 21, soit 95% Fig. 2b, d, e, < 600 m, temps d'apparition = 1,7 ± 0,4 h, m = 21 > 600 μm, temps d'apparition = 40,0 ± 8,7 h, m = 17, p < 0,0001), via un processus que nous avons appelé WD à début rapide (roWD). Cependant, malgré le fait de tomber dans deux groupes clairs, nous n'avons trouvé aucune corrélation entre le moment du début de la fragmentation et la longueur réelle de chaque terminaison axonale déconnectée. au sein de chaque groupe (Fig. 2f, < 600 m subissant le temps d'apparition de la ligne en fonction de la longueur, R 2 = 0.08, p > 0,05 Fig. 2g, > 600 m en cours de WD, R 2 = 0.07, p > 0,05).

Ces résultats sont cohérents avec la possibilité que la partie distale de l'axone, à moins de 600 um de la terminaison, ait une compétence différente pour la dégénérescence par rapport aux emplacements plus proximaux (> 600 um de la terminaison). Pour tester cette idée, nous avons utilisé la microchirurgie laser pour couper des segments de longueur égale de différentes régions le long de l'axone, soit situés à moins de 600 m de la terminaison axonale (distale), ou plus loin le long de la tige axonale où le fragment axonal généré était situé plus à plus de 600 m de l'extrémité (proximale). Nous avons induit des lésions à chaque extrémité des deux segments de sorte que les segments distaux et proximaux étaient comparables (double lésion (distale) et double lésion (proximale), Fig. 3a). Pour l'expérience du segment à double lésion (proximale), cela a également généré un deuxième segment contenant la terminaison axonale et mesurant au moins 600 um de longueur - ce segment a été ignoré aux fins de cette expérience. Nous n'avons trouvé aucune différence dans le délai d'apparition de la dégénérescence entre ces deux groupes de segments axonaux (double lésion (distale) et double lésion (proximale), p > 0,05, figure 3b). Dans certains cas, nous avons pu couper deux segments d'axone de longueur égale séparés d'au moins 600 m l'un de l'autre le long de la même axone (Fig. 3b m = 5 axones de 3 souris, lignes grises reliant les points de données) et n'a trouvé à nouveau aucune différence dans le début de la dégénérescence (p > 0,05). Ces données suggèrent que l'emplacement des segments axonaux déconnectés le long de l'axone n'affecte pas la cinétique du processus de dégénérescence.

Sonder la cinétique de dégénérescence axonale in vivo. une Schéma illustrant des expériences de lésions simples et doubles de différentes régions de l'axone. b Temps moyen de début de fragmentation pour les axones distaux à double lésion (cercles noirs, m = 13 axones, 10 souris), axones proximaux à double lésion (cercles vides, m = 8 axones, 7 souris) et axones lésés simples (cercles bleus, m = 18 axones, 9 souris). Les lignes grises relient les points de données des segments distaux et proximaux à double lésion le long du même axone (m = 5 axones, 3 souris). Test de Wilcoxon, *** p < 0,001. c Taux de fragmentation plus lent des axones plus courts subissant un roWD (points bleus) par rapport aux axones plus longs subissant un WD (points gris) après une seule lésion axonale, **** p < 0,0001. Aucune corrélation entre le taux de fragmentation roWD et la longueur des axones (points bleus, m = 21 axones, 13 souris, p > 0.05) ou pour un taux de fragmentation WD et une longueur d'axone plus longs (e, points gris, m = 14 axones, 14 souris, p > 0,05)

Une autre possibilité pour expliquer l'apparition plus rapide de la dégénérescence dans les segments axonaux plus courts est qu'un mécanisme dépendant du seuil contrôle la cinétique de la roWD corticale et de la WD [7]. Ce modèle de seuil, dans lequel l'initiation de la dégénérescence axonale pourrait être médiée par la perte d'un facteur de protection et/ou l'accumulation d'un déclencheur de dégénérescence (voir discussion, et illustré dans un fichier supplémentaire (Fichier supplémentaire 2)), prédit que les segments axonaux de même longueur avec deux extrémités coupées auraient un début de fragmentation plus précoce que les segments de même longueur n'ayant qu'une seule extrémité coupée, en raison de deux voies d'épuisement/accumulation, au lieu d'une.

Ainsi, nous avons comparé l'ensemble de données de la double lésion (distale) (longueur moyenne = 187 ± 18 m, m = 13 axones, 10 souris) avec les données originales collectées pour les segments axonaux générés par une seule lésion à une distance connue de la terminaison terminale (Fig. 3a. Lésion unique, longueur moyenne = 310 ± 30 m, m = 18 axones, 8 souris). Les segments à double lésion ont montré un début de fragmentation significativement plus précoce par rapport aux axones à lésion unique (Fig. 3b, début de lésion unique = 134 ± 24 min début de lésion distale double = 34 ± 19 min p = 0,001), comme prédit par le modèle de dégénérescence axonale dépendant du seuil. Pour explorer davantage si la double lésion devait flanquer la terminaison distale pour générer cet effet, nous avons également comparé le temps d'apparition de la lésion unique aux segments de la double lésion (proximaux) situés à plus de 600 m de la terminaison (m = 8 axones, 7 souris). De même, cela a montré une tendance vers un temps d'apparition significativement plus précoce dans les segments axones doubles (proximaux) par rapport aux lésions simples (Fig. 3b, apparition de la lésion unique = 134 ± 24 min apparition de la double lésion proximale = 66 ± 33 min p = 0,0512). Cela prend en charge un modèle dépendant du seuil pour expliquer le début de la dégénérescence dans les axones corticaux sectionnés.

Pour étudier plus avant la cinétique de dégénérescence de roWD et WD, en utilisant un paradigme de lésion unique, nous avons comparé les taux de fragmentation des segments d'axone survivants une fois que le début de la fragmentation a été détecté. Étonnamment, le taux de fragmentation pour les segments axonaux transectés plus courts (< 600 m de la fin) était significativement plus lent que pour les segments axonaux sectionnés plus longs (Fig. 3c, < 600 m, 0,5 ± 0,1 m/min, m = 21 axones, 13 souris > 600 m, 1,6 ± 0,2 m/min, m = 14 axones, 14 souris p < 0,0001). Semblable au temps d'apparition, au sein de chaque groupe, il n'y avait pas de corrélation entre la longueur des segments axonaux déconnectés et le taux de fragmentation (Fig. 3d, e, < 600 μm, R 2 = 0.08, p > 0,05 > 600 m, R 2 = 0.07, p > 0,05), excluant à nouveau un mécanisme linéaire basé sur la longueur pour expliquer la cinétique de dégénérescence.

En utilisant une approche d'analyse d'image similaire, nous avons étudié le site de la première fragmentation observée le long des axones corticaux blessés. Sur 32 axones, 10 ont commencé à se fragmenter près du site de la lésion, 11 à partir de l'extrémité terminale la plus éloignée de la lésion, 5 sur toute la longueur en même temps, 3 à partir du milieu et 3 à partir des deux extrémités simultanément, avec différentes régions présentant des début (proche du site de la lésion, temps de début = 7,3 ± 2,4 h, m = 26 extrémité distale, délai d'apparition = 10,4 ± 2,9 h, m = 26, p > 0,05) et la vitesse de fragmentation (proche de la fin de la lésion, 0,19 ± 0,035 m/min, m = 16 extrémité distale, 0,19 ± 0,038 m/min, m = 16, p > 0,05). Curieusement, lorsque nous avons divisé les axones en deux groupes, plus courts ou plus longs que 600 m, malgré les faibles nombres, la fragmentation dans les axones plus courts subissant le roWD était significativement plus susceptible de commencer à l'extrémité distale de l'axone (40 % des axones lésés) par rapport aux axones plus longs. axones subissant une WD (10% des axones lésés test Chi carré, p < 0,001).

La WD corticale dépend de la densité du bouton mais pas de la complexité de l'axe axonal

La microchirurgie laser et l'imagerie in vivo des axones individuels de la matière grise ouvrent la voie à l'étude du rôle de l'arborisation axonale et de l'architecture synaptique dans la MW, ce qui n'a pas pu être évalué dans des travaux antérieurs sur les grandes fibres myélinisées de la moelle épinière, du nerf optique ou du SNP. Ainsi, nous avons demandé comment la densité des boutons le long des axones corticaux et la complexité de l'arborisation axonale affectent roWD et WD. Nous avons émis l'hypothèse que les axones avec une densité relativement élevée de contacts synaptiques peuvent prendre plus de temps à dégénérer que les axones avec une densité synaptique plus faible en raison de la complexité moléculaire au sein de l'axone et du temps supplémentaire nécessaire pour désassembler la machinerie synaptique [15], même si les axones avec un une plus grande densité de synapse aurait un fardeau énergétique plus important. La densité de boutons (plage de 0,0048 à 0,0957 boutons/μm) de 33 axones a été quantifiée sur la base de la morphologie (terminus boutons TB) dans le segment axonal distal avant la micro-lésion laser, avec toutes les protubérances entre 1 et 5 m s'étendant à partir de la ligne médiane de la tige axonale considérées comme des boutons. Ces structures axonales ont déjà été confirmées comme formant des synapses complètes [38, 44, 45].La densité des boutons était corrélée avec le début et le taux de fragmentation des mêmes segments (Fig. 4a, b). Pour les segments > 600 m subissant WD, la densité des boutons était significativement corrélée avec le début (R 2 = 0.30, p < 0.05 Fig. 4c) mais pas le taux de fragmentation (R 2 = 0.03, p > 0,05 Fig. 4e, m = 13 axones, 13 souris). Pour les segments < 600 μm subissant le roWD, la densité des boutons était également significativement corrélée avec le début (R 2 = 0.44 p < 0.01 Fig. 4d), mais pas avec le taux de fragmentation (R 2 = 0.08, p > 0,05 Fig. 4f, m = 20 axones, 12 souris). Ces données soutiennent l'hypothèse selon laquelle le début de la fragmentation dans les axones en dégénérescence dépend de la connectivité synaptique au sein du segment axonal, où une densité de boutons plus élevée entraîne un début ultérieur de fragmentation mais n'a aucune relation significative avec la cinétique de fragmentation une fois commencée.

Les boutons synaptiques retardent le début de la dégénérescence des axones corticaux. une, b Images représentatives des axones avec relativement faible (une) et élevé (b) densités de terminus boutons (TB). c, Il existe une corrélation significative entre la densité des boutons et le début de la fragmentation pour les segments subissant une WD (c, p < 0.05, m = 13 axones, 13 souris) et pour les axones plus courts subissant roWD (, p < 0.01, m = 20 axones, 12 souris). e, F Il n'y a pas de corrélation entre la densité des boutons et le taux de fragmentation pour les segments subissant une WD (e, p > 0.05) ou roWD (F, p > 0,05). Barre d'échelle 40 m (une, b)

L'étude de la cinétique dans les axones ramifiés et non ramifiés n'a montré aucune différence dans les délais d'apparition (non ramifiés > 600 μm, 24,7 ± 8,0 h, m = 5 axones, 5 souris ramifiées > 600 m, 24,3 ± 7,7 h, m = 5 axones, 5 souris, p > 0,05 non ramifié < 600 m, 1,80 ± 0,45 h, m = 15 axones, 8 souris ramifiées < 600 μm, 1,81 ± 0,74 h, m = 4 axones, 3 souris, p > 0,05) ou taux de fragmentation (non ramifié > 600 m, 1,81 ± 0,39 min ramifié > 600 μm, 1,92 ± 0,49 min, p > 0,05 non ramifié < 600 m, 0,44 ± 0,06 min ramifié < 600 μm, 0,54 ± 0,12 min, p > 0,05), suggérant que la complexité de l'arbre axonal ne joue pas un rôle majeur dans la cinétique de dégénérescence des axones corticaux.

AAD est moins important que roWD et WD dans les axones corticaux blessés in vivo

L'imagerie régulière fréquente immédiatement après la section a révélé peu de signes de fragmentation des axones corticaux survenant dans les 60 premières minutes après la lésion, soit proximale [39] soit distale par rapport au site de la lésion, comme illustré dans un fichier vidéo supplémentaire (voir le fichier supplémentaire 3), avec tous mais un segment axonal déconnecté (37 sur 38, 97 %) présentait un retard d'apparition de la fragmentation d'au moins 1 h (Fig. 5a). Fragmentation axonale importante (

200–300 m) des deux côtés de la lésion dans les quelques minutes suivant la lésion, cependant, a été rapporté dans les fibres myélinisées de la moelle épinière [20] et du nerf optique [18]. Cette différence pourrait être due aux différentes méthodes de lésion (laser versus axotomie mécanique), aux marqueurs utilisés (membrane axonale versus cytosolique) ou aux caractéristiques intrinsèques des différentes populations neuronales du système nerveux (cortex cérébral, moelle épinière, nerf optique).

L'AAD est négligeable dans les axones corticaux blessés in vivo. une Aucun signe d'AAD dans les 60 minutes suivant la blessure lorsque la longueur des segments distaux des axones corticaux est surveillée avec un marqueur membranaire (Thy1-L15). Notez la stabilité de la longueur dans tous les axones sauf un (ligne rouge), indiquant l'absence de fragmentation au cours des 60 premières minutes post-lésion (m = 16 axones, 7 souris). b Exemple de rétraction de l'axone sectionné loin du site de la lésion lorsqu'il est observé avec un marqueur GFP cytosolique (ligne GFP-M). A noter l'absence de fragmentation sur les 60 premières minutes post-lésion. Les pointes de flèche indiquent un axone intact. La terminaison Axon est sur le bord droit du cadre. Barre d'échelle = 10 m. c Quantification de la distance entre le site de la lésion et le moignon axonal distal dans les axones cytosoliques marqués à la GFP (ligne Thy1-GFPM) aux temps post-lésion indiqués (m = 10 axones, 7 souris)

Fichier supplémentaire 3. Canty et al. Fichier supplémentaire 3.mov. Film en accéléré de la dégénérescence axonale dans le cerveau d'une souris vivante. Ce film montre la dégénérescence d'un fragment d'axone distal au fil du temps dans le cortex cérébral de la souris, vue via une préparation de fenêtre crânienne. Les horodatages post-lésionnels sont indiqués sur chaque image.

Pour étudier ces possibilités, nous avons effectué des axotomies laser et une imagerie in vivo dans les voies dorsales ascendantes de la substance blanche de la moelle épinière (où l'AAD a été décrite pour la première fois [20]) et dans les axones corticaux en utilisant soit le cytosolique (ligne GFP-M [46] ) ou des marqueurs GFP axolemmaux (lignée L15 [47, 48]), exprimés sous le promoteur Thy 1.2. L'imagerie in vivo en accéléré d'axones rachidiens ascendants individuels (voir le fichier supplémentaire 4) a montré que, tandis que l'axoplasme (cytosol et composants du cytosquelette) se fragmentait en quelques minutes à proximité de la lésion de la moelle épinière (ligne GFP-M, début de dégénérescence axoplasmique = 29,6 ± 4 min plage 16–56 min, m = 9 axones, 5 souris) (Fichier supplémentaire 4a, c) conforme à l'AAD précédemment décrit [23], la membrane près du site de la lésion est restée intacte jusqu'à

4 h (ligne L15, début axolemmal = 139,9 ± 22 min plage 58-228 min, m = 9 axones, 5 souris p < 0,001 par rapport au début axoplasmique) (Fichier supplémentaire 4b, c). L'analyse de la position des deux pointes axonales sectionnées, proximale et distale du site de la lésion, a montré que la membrane axonale n'a subi presque aucune rétraction du site de la lésion dans les 60 premières minutes de chaque côté de la lésion (ligne L15, pointe proximale 8,2 ± 1,7 m gamme 4,1–11,3 m pointe distale 8,9 ± 3,0 m, gamme 2,7–15,7 m, m = 5 axones), par rapport aux axones marqués cytosoliques qui ont subi une rétraction significative des deux côtés du site de la lésion entre 30 et 60 min après la lésion (ligne GFP-M, extrémité proximale 85,0 ± 37,9 m plage 13,5-264,2 μm extrémité distale 82,4 ± 25,9 m, plage 22,1–185,4 m, m = 7 axones) (Fichier supplémentaire 4d).

Lorsque nous sommes revenus pour étudier la dynamique de la GFP cytosolique dans les axones corticaux à l'aide de la ligne GFP-M, l'axoplasme des segments distaux d'axones corticaux déconnectés semblait se rétracter lentement du site de la lésion au cours des 60 premières minutes après la lésion (Fig. 5b, c 11,1 ± 1,9 m gamme 3–21 m m = 10 axones) [23, 24]. Ceci est potentiellement dû à une fuite de GFP de l'extrémité coupée immédiatement après la lésion et se produit avant toute fragmentation franche de l'axone distal.

Fait intéressant, dans les axones corticaux, le taux de fragmentation de la GFP liée à la membrane était beaucoup plus lent que le taux de fragmentation de la GFP cytosolique (0,5 ± 0,1 m/min contre 3,4 ± 0,7 m/min, respectivement p < 0,05), et les deux étaient plus lents que les taux mesurés dans les études précédentes dans la moelle épinière [20] et le nerf phrénique [12], ce qui pourrait potentiellement s'expliquer par les intervalles d'échantillonnage plus longs utilisés dans nos protocoles d'imagerie chronique in vivo.

Ensemble, nous décrivons de nouvelles approches dans l'exploration de l'axone cortical WD in vivo. Nous identifions une longueur d'axone seuil en dessous de laquelle la phase de latence avant la fragmentation des axones corticaux (appelée ici « début ») est un ordre de grandeur plus tôt, et le taux de fragmentation est significativement plus lent que pour WD, dans un processus que nous appelons roWD. De plus, contrairement à l'AAD [18, 20], le roWD enlève l'intégralité de l'axone distal sectionné plutôt qu'une partie seulement adjacente au site de la lésion et ne se produit pas sur le segment axonal proximal (c'est-à-dire la partie encore connectée à la cellule body), révélant des différences spatio-temporelles de dégénérescence entre roWD et WD/AAD, résumées dans un fichier supplémentaire (voir fichier supplémentaire 5).

L'axone cortical WD est contrôlé par une voie locale NAD+-dépendante

Pour explorer le mécanisme de la roWD, nous avons étudié le NAD + voies de signalisation dépendantes, qui ont été impliquées à la fois dans la MW et l'AAD [20, 49, 50] et dans la modulation de la dégénérescence axonale dans plusieurs modèles animaux de maladies neurodégénératives [1]. Pour cela, nous avons utilisé la lignée de souris de dégénérescence wallérienne lente (Wld S ) surexprimant une version stable du NAD + synthétisant l'enzyme NMNAT1 consistant en une liaison supplémentaire de 18 acides aminés au facteur d'ubiquitination E4B, qui a pour effet de retarder la dégénérescence axonale [50, 51]. Les souris porteuses de la mutation Wld S ont retardé l'apparition de la MW dans le système nerveux périphérique et central [52, 53]. Des souris Wld S ont été croisées avec la lignée Thy1-L15 pour produire une descendance hétérozygote Wld S -Thy1-L15, et la cinétique de dégénérescence des axones corticaux a été déterminée en utilisant la méthodologie susmentionnée dans les axones distaux de < 600 μm de longueur dans Wld S -Thy1-L15 (m = 24 axones, 11 souris, Fig. 6a) et par rapport aux axones de type sauvage (WT) de longueur comparable (m = 21 axones, 13 souris, Fig. 6b). Les animaux Wld S -Thy-L15 ont montré un début de fragmentation significativement retardé (Fig. 6c, WT, 1,7 ± 0,4 h Wld S -Thy1-L15, 7,6 ± 3,7 h, p < 0,01), indiquant que le roWD est régulé par des voies dépendantes du NAD+. Il n'y avait pas de différence significative dans le taux de fragmentation, bien qu'il y ait eu une tendance à une fragmentation plus rapide dans les axones corticaux Wld S -Thy1-L15 (Fig. 6d WT, 0,5 ± 0,1 m/min Wld S -Thy1-L15, 1,7 ± 0,5 m /min, p = 0,0645). Fait intéressant, et contrairement aux axones WT, une fois que la fragmentation a commencé, elle l'a fait sur toute la longueur de l'axone simultanément.

Une voie locale NAD+-dépendante contrôle l'axone cortical WD. une, b Exemples représentatifs d'axones Wld S -Thy1-L15 et WT lésés de longueur distale comparable. c Les axones Wld S ont un temps de début de fragmentation significativement plus tard que les axones WT, Wld S , m = 24 axones, 11 souris WT m = 21 axones, 13 souris, ** p < 0.01. Les taux de fragmentation ne sont pas significativement différents dans les axones WT et Wld S, bien que les données suggèrent une tendance à une fragmentation plus rapide dans les axones Wld S. e Images représentatives d'un axone lésé en culture de coupe corticale traitée avec NAD + . F Le temps d'apparition de la fragmentation dans les axones lésés dans les cultures de tranches corticales est significativement plus précoce dans les axones < 600 μm (roWD, bleu, m = 9 axones, 5 tranches, 5 souris) que les axones > 600 m de longueur (WD, gris, m = 8 axones, 6 tranches, 2 souris), *** p < 0,001. gje Dégénérescence des axones lésés in vitro sans traitement (témoin, g), avec ajout de NAD + prélésion (h) et postlésion (je). La ligne pointillée bleue montre le point de temps de 24 h. j Les axones sont protégés par NAD + lorsqu'ils sont ajoutés avant ou après la lésion. Moyenne ± SEM. Mann Whitney U test. Barre d'échelle 70 m (une, b), 100 m (e)

Pour sonder davantage la régulation dépendante du NAD + dans la dégénérescence des axones corticaux, nous avons utilisé des cultures d'explants corticaux pour permettre la manipulation pharmacologique des niveaux de NAD + [54]. Dix-sept axones ont été lésés, d'une longueur moyenne de 613 ± 80 m, provenant de 6 animaux (intervalle de 0,12 à 5 mm) (Fig. 6e, f). Nous avons vérifié que le début de la fragmentation des axones corticaux lésés dans la culture en tranches était comparable au début des expériences in vivo avec un retard significatif dans les axones > 600 m (Fig. 6f, g début = 1,8 ± 0,18 h, 9 axones < 600 m début = 17,6 ± 2,48 h, 8 axones 600–1000 m p < 0.05). Les taux de fragmentation n'ont pas été calculés pour les expériences in vitro car les conditions d'imagerie à température ambiante ont confondu la cinétique de fragmentation [55]. Ensuite, nous avons testé si l'effet protecteur du NAD+ était dû à une action locale sur l'axone distal coupé ou à son rôle potentiel dans la modulation de l'expression des gènes dans le noyau [21, 26, 49]. Pour faire la distinction entre ces possibilités, nous avons d'abord appliqué 1 mM de NAD + à un groupe distinct de cultures en tranches 24 h avant les lésions, ce qui a entraîné un retard important dans l'apparition de la roWD (Fig. 6h, j longueur moyenne 521 ± 51 m, début = 23,9 ± 3,5 heures, m = 21 axones, 8 souris p < 0,01 par rapport à la longueur moyenne non traitée 613 ± 80 m, début = 9,2 ± 2,2 h, m = 17 axones, 6 souris). Tester le rôle du NAD indépendant de la transcription + effets dans les neurones endommagés [49], nous avons également appliqué le NAD + immédiatement après que l'axone a été coupé. Dans ce cas, NAD + a également pu retarder le début de la dégénérescence (Fig. 6i, j longueur = 613 ± 31 m, début = 30,9 ± 4,2 h, m = 23 axones, 10 souris p < 0.01). Ces données suggèrent que le NAD + l'action est locale, en accord avec de nombreux autres rapports de la littérature [50, 56, 57], plutôt que de nécessiter l'expression des gènes dans les neurones axotomisés comme cela a été montré pour la MW dans un précédent rapport en cultures neuronales dissociées [49].


Discussion

Grâce à l'étude de l'immunohistochimie GAT-1, nous avons pu quantifier la densité et la distribution des terminaux Ch dans différentes zones et couches du néocortex humain. Cette analyse a révélé à la fois des similitudes et des différences entre les zones cytoarchitectoniques distinctes et les couches corticales. Ainsi, nous avons constaté que la distribution des Ch-terminaux n'est pas homogène dans le cortex et nous considérons que ces différences sont probablement liées aux différents attributs fonctionnels de la région ou de la couche corticale examinée.

Variation de la densité des terminaux Ch entre les individus

Dans cette étude, nous avons constaté que la densité globale des terminaux Ch GAT-1-ir diminuait avec l'âge. En effet, il y avait une diminution de 15 % chez l'individu de 69 ans par rapport au tissu obtenu chez l'individu de 23 ans. Cependant, cette différence n'était pas statistiquement significative et parce que nous n'avons analysé qu'un individu de chaque âge, les différences pourraient simplement être dues à la variabilité interindividuelle. Ainsi, il est clair que d'autres études sur les tissus de plus de sujets seront nécessaires pour vérifier le déclin lié à l'âge de la densité des terminaux Ch GAT-1-ir dans le néocortex humain. Néanmoins, ces résultats sont cohérents avec le déclin lié à l'âge des terminaux Ch GAT-1-ir rapporté dans la couche III du cortex du singe (Cruz et al. 2003). Un tel déclin ne semble pas représenter une diminution du nombre de neurones en fonction de l'âge. Ni la densité neuronale (Pakkenberg et al. 2003) ni la densité des cellules somatiques PV-ir (y compris les cellules chandelier Bu et al. 2003) n'ont changé en fonction de l'âge dans le néocortex humain. Ainsi, la rétraction axonale liée à l'âge par les cellules chandeliers et/ou une diminution de l'expression ou de l'antigénicité de GAT-1 aux terminaux Ch avec l'âge pourraient bien expliquer les observations actuelles. Cependant, étant donné qu'il y a relativement peu de cellules chandeliers, la perte de certaines d'entre elles peut passer inaperçue lorsque l'ensemble de la population de neurones est pris en compte dans les études stéréologiques. Il sera nécessaire d'examiner les AIS des cellules pyramidales par microscopie électronique pour mieux définir les processus impliqués dans cette perte de terminaux marqués GAT-1.

Variation de la densité des terminaux Ch GAT-1-ir entre les zones

Il y avait des différences significatives dans la densité des terminaux Ch GAT-ir entre les zones distinctes du néocortex humain analysées, suggérant une spécialisation régionale des circuits inhibiteurs dans lesquels ils sont impliqués. Dans les 3 cerveaux analysés, les zones sensorielles primaires et secondaires (zones 17, 18, 3b et 1) présentaient la plus faible densité de terminaux Ch GAT-1-ir, les zones motrices (zone 4) et frontolatérales associatives 45 et 46 affichaient des valeurs intermédiaires, alors que les aires frontolatérales 9 et 10, les aires frontales orbitaires 11, 12, 13, 14 et 47, les aires temporales 20, 21, 22 et 38, et les aires cingulaires 24 et 32 ​​contenaient la moyenne la plus élevée densité des terminaux Ch GAT-1-ir. Bien que des études détaillées de la densité et de la distribution des terminaux Ch n'aient pas été réalisées auparavant dans le néocortex humain, ces résultats sont cohérents avec les observations selon lesquelles il existe généralement une densité plus élevée de terminaux Ch dans les zones d'association d'ordre élevé que dans les zones sensorielles primaires. chez le singe ( Lewis et al. 1989 Akil et Lewis 1992 Conde et al. 1996 Elston et Gonzalez-Albo 2003). De plus, les résultats sont cohérents avec ceux montrant que les cellules à double bouquet, un autre composant important des circuits corticaux GABAergiques, ne sont pas réparties de manière homogène dans tout le néocortex, mais qu'elles présentent également des différences assez spectaculaires dans leur densité entre les zones (Yáñez et al. 2005). Des études antérieures de microscopie électronique et de traçage des voies ( Fariñas et DeFelipe 1991), ainsi que l'analyse de matériel coloré au Golgi ( Lewis et Lund 1990) ont montré que les terminaux Ch sont présents dans le cortex visuel du chat et du singe. Cependant, il est difficile d'avoir une idée sur la distribution des Ch-terminaux dans les études au microscope électronique ou dans les études de Golgi en raison de l'incohérence de la méthode de Golgi et du relativement peu d'AIS examinés par microscopie électronique. Par conséquent, la rareté des terminaux Ch GAT-1-ir dans le cortex visuel primaire observé ici, comme dans d'autres zones sensorielles, est mieux comparée à d'autres zones corticales examinées en utilisant la même méthodologie. Il existe plusieurs explications possibles aux différences de densité des terminaux Ch GAT-1-ir entre les zones. Parce que toutes les cellules pyramidales ne sont pas nécessairement innervées par les terminaux Ch (par exemple, voir Fariñas et DeFelipe 1991), une plus petite proportion des cellules pyramidales dans les zones sensorielles pourraient être innervées par les terminaux Ch que dans les zones associatives. Alternativement, il peut y avoir moins de protéine GAT-1 dans les terminaux Ch dans les zones sensorielles, ce qui implique que de nombreux terminaux dans ces régions contiennent des quantités de protéines inférieures aux niveaux de détection pour les méthodes immunocytochimiques utilisées. De plus, il est possible qu'au moins certains Ch-terminaux dans les zones corticales sensorielles puissent utiliser d'autres types de transporteurs GABA.

Distribution laminaire des terminaux Ch GAT-ir dans le cortex cérébral

Les présents résultats indiquent également qu'il existe des différences dans la densité des terminaux Ch GAT-1-ir entre les couches corticales distinctes. La plus forte densité de terminaux Ch GAT-1-ir a été observée dans la couche II suivie des couches III, V, VI et IV. Des études antérieures ont montré qu'il existe des différences dans la densité des terminaisons synaptiques qui contactent l'AIS des cellules pyramidales situées dans différentes couches. Par exemple, dans le cortex temporal et sensori-moteur du singe et dans le cortex visuel du chat, l'AIS des neurones pyramidaux des couches II-III est plus densément innervé par les synapses des cellules lustre que celles des couches V et VI (Sloper et Powell 1979 DeFelipe et al. 1985 Fariñas et DeFelipe 1991 DeFelipe 1999).Étant donné que les cellules pyramidales situées dans différentes couches se projettent vers différents sites (Jones 1984 White 1989), les changements de densité des terminaux Ch GAT-1-ir observés entre les couches pourraient être liés à la distribution laminaire des populations de cellules pyramidales se projetant vers des zones particulières. des sites.

De plus, il a été montré dans le néocortex du rat que le GABA postsynaptiqueUNE les récepteurs à l'AIS des cellules pyramidales supragranulaires sont enrichis de la sous-unité α2, alors que dans les couches infragranulaires, la sous-unité α3 prédomine ( Fritschy et al. 1998). Ainsi, il est possible que les cellules lustres exercent leur activité à travers différents types de GABA postsynaptiqueUNE récepteurs en fonction de la couche corticale dans laquelle ils se trouvent. Enfin, une corrélation directe a été observée entre la densité des terminaux Ch GAT-1-ir et la densité neuronale dans les zones 4, 9, 17 et 24. Ce n'était pas le cas dans les zones 18 et 21 où il n'y avait pas de corrélation entre GAT -1-ir Ch-terminaux et densité neuronale. Par conséquent, il existe une hétérogénéité remarquable dans la densité et la distribution des terminaux Ch GAT-1-ir, suggérant que les cellules chandelier contribuent différemment aux circuits corticaux (anatomiquement et physiologiquement) selon la zone ou la couche corticale dans laquelle elles se trouvent.


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