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3.3H : Analyse de diffraction des rayons X - Biologie

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Objectifs d'apprentissage

  • Résumer les méthodes utilisées pour l'analyse par diffraction des rayons X et les contributions qu'elles ont apportées à la science

La diffraction des rayons X (XRD) est un outil pour caractériser l'arrangement des atomes dans les cristaux et les distances entre les faces cristallines. La technique révèle des informations détaillées sur la composition chimique, la cristallographie et la microstructure de tous les types de matériaux naturels et manufacturés, ce qui est essentiel pour comprendre les propriétés du matériau étudié.

Étant donné que de nombreux matériaux peuvent former des cristaux, tels que des sels, des métaux, des minéraux, des semi-conducteurs, ainsi que diverses molécules inorganiques, organiques et biologiques, la cristallographie aux rayons X a été fondamentale dans le développement de nombreux domaines scientifiques. La méthode a déterminé la taille des atomes, les longueurs et les types de liaisons chimiques, ainsi que les différences à l'échelle atomique entre divers matériaux, en particulier les minéraux et les alliages. La méthode a également révélé la structure et la fonction de nombreuses molécules biologiques, notamment des vitamines, des médicaments, des protéines et des acides nucléiques tels que l'ADN.

Les échantillons sont généralement analysés sous forme cristalline. La diffraction des rayons X est causée par une interférence constructive des ondes de rayons X qui se réfléchissent sur les plans cristallins internes. Un mince film ou couche de poudre est fixé sur le trajet des rayons X monochromatiques. Un détecteur mesure les rayons X de l'échantillon sur une plage d'angles. La poudre est constituée de minuscules cristaux orientés au hasard. À certains angles du capteur, les populations de cristaux ont l'angle correct pour que l'équation de Bragg soit satisfaite pour l'un des plans cristallins, ce qui entraîne un pic de rayons X.

Le graphique de sortie affiche l'intensité des rayons X sur 2 thêta, l'angle du détecteur. Les données générées avec cette technique nécessitent une analyse mathématique approfondie qui est maintenant facilitée par les algorithmes informatiques disponibles. L'analyse consiste à indexer, fusionner et mettre en phase les variations de densité électronique. Elle commence par l'identification de molécules à l'aide de la base de données du centre international de diffraction (ICDD). Il s'agit d'une organisation dédiée à la collecte, l'édition, la publication et la distribution des données de diffraction des poudres pour l'identification des matériaux cristallins. Une analyse plus approfondie implique un raffinement de la structure et une phase quantitative à l'aide du système d'analyse de structure générale (GSAS), qui conduit finalement à l'identification de la phase amorphe ou cristalline d'une matière et aide à construire son modèle atomique tridimensionnel.

Points clés

  • La diffraction des rayons X utilise des faisceaux de rayons X ciblés pour frapper la matière cristallisée et génère un motif de diffraction.
  • Les données collectées à l'aide de cette méthode sont soumises à un processus analytique systématique qui utilise des modèles mathématiques et des algorithmes informatiques pour obtenir le modèle atomique 3D final d'une matière.
  • L'analyse par diffraction des rayons X identifie la composition et les liaisons chimiques entre les atomes d'échantillons cristallins, liquides, pulvérulents ou amorphes.

Mots clés

  • L'équation de Bragg: Donne les angles de diffusion cohérente et incohérente d'un réseau cristallin.
  • cristallographie: La science expérimentale de la détermination de l'arrangement des atomes dans les solides.

Diffraction des rayons X : équipement et méthodes | Minéraux d'argile | Sol

Dans cet article, nous discuterons de: - 1. Principe de la diffraction des rayons X 2. Équipement de diffraction des rayons X 3. Analyse 4. Méthodes 5. Avantages.

Principe de diffraction des rayons X :

Lorsqu'un faisceau de rayons X monochromatique de longueur d'onde A est projeté sur un matériau cristallin sous un angle , la diffraction n'est renforcée que le long de directions spécifiques, comme le montre la figure 3.19 définie par la loi de Bragg [Eq. (3.1)].

Équipement de diffraction des rayons X :

Le spectromètre XRD est illustré à la figure 3.20. Les rayons X générés par le tube à rayons X frappent le cristal échantillon à travers les collimateurs à un angle, . Les rayons X diffractés sous un angle 2 sont enregistrés par un détecteur en nombre de coups par seconde, qui est proportionnel à l'intensité des rayons X diffractés. Un moteur fait tourner l'échantillon pour faire varier l'angle d'incidence des rayons X en continu, et les coups par seconde sont enregistrés pour tous les angles de .

Le motif XRD est tracé avec l'angle 2 sur l'axe des x et compte par seconde sur l'axe des y. L'espacement interatomique (d) est calculé en utilisant la loi de Bragg’s [Eq. (3.1)] en substituant l'angle 2 correspondant aux différents pics du motif XRD. On obtient donc -

où n est l'ordre de réflexion, d est l'espacement entre les plans M1N1et M2N2, et est l'angle d'incidence des rayons X.

Les valeurs d ainsi obtenues sont les caractéristiques de différents minéraux argileux. Chaque pic peut donner au moins trois espacements d correspondant au premier (n = 1), deuxième (n = 2) et troisième (n = 3) ordre de diffraction en utilisant l'équation. (3.1).

Analyse de diffraction des rayons X :

Voici la procédure simple utilisée en diffraction des rayons X :

2. Déterminez les espacements d en utilisant la loi de Bragg’s.

3. Obtenir des intensités intégrées.

4. Comparez les données avec les normes connues dans le fichier JCPDS, qui sont pour des orientations aléatoires. Il existe plus de 50000 cartes JCPDS (Joint Committee on Powder Diffraction Standards qui est remplacé par International Center for Diffraction Data, ICDF) de matériaux inorganiques et JCPDS représente les diagrammes de diffraction de 50000 inorganiques et 25000 organiques monocomposant, phases cristallines.

5. Un modèle XRD typique est analysé pour (a) la position du pic, (b) l'intensité du pic et (c) la largeur du pic. La largeur du pic est la largeur du pic à la moitié de l'intensité maximale. Les zones sous le pic sont liées à la quantité de chaque phase présente dans l'échantillon.

Méthodes de diffraction des rayons X :

Voici les différentes méthodes utilisées basées sur le principe de la diffraction des rayons X :

La rotation d'un cristal parfait dans un faisceau de rayons X est une méthode pour déterminer le spectre des rayons X à l'aide de la loi de Bragg. En faisant tourner un monocristal avec un détecteur fixe ou en utilisant un détecteur sensible à la position avec un cristal fixe, nous pouvons effectuer des expériences de spectroscopie aux rayons X similaires à la façon dont un réseau de diffraction peut être utilisé dans un spectromètre IR ou UV.

Avec un faisceau incident polychromatique, de nombreux plans répondront à la condition de Bragg et tracer le motif 2D sur un film photographique révélera les plans d'une zone.

3. Méthode du cristal rotatif :

Pour un faisceau monochromatique et un monocristal, faites pivoter le cristal pendant l'expérience de diffraction pour aligner les plans de Bragg.

Faisceau monochromatique, échantillon polycristallin. Habituellement fait avec un film plat dans un arrangement de trous d'épingle.

5. Méthode du diffractomètre :

Similaire à la méthode de la poudre, mais utilise un scanner pas à pas et un faisceau linéaire.

Avantages de diffraction des rayons X :

La diffraction des rayons X est une méthode non destructive et rapide d'identification des minéraux. La préparation des échantillons est simple. Le calcul de l'espacement d est précis. Le procédé peut également être appliqué in situ pour les matériaux monocristallins, polycristallins et amorphes. Des normes sont disponibles pour des milliers de systèmes de matériaux.


Instrumentation de diffraction des rayons X sur poudre (XRD) - Comment ça marche ?

La géométrie d'un diffractomètre à rayons X est telle que l'échantillon tourne dans le trajet du faisceau de rayons X collimaté à un angle θ tandis que le détecteur de rayons X est monté sur un bras pour collecter les rayons X diffractés et tourne à un angle de 2 θ . L'instrument utilisé pour maintenir l'angle et faire pivoter l'échantillon est appelé un goniomètre. Pour les modèles de poudre typiques, les données sont collectées à 2 θ à partir de

5 ° à 70 ° , angles préréglés dans la radiographie.


Analyse améliorée de la diffraction des rayons X de la cellulose à l'aide de la modélisation de la série de Fourier

Cet article aborde deux problèmes fondamentaux dans la méthode de déconvolution des pics de l'analyse des données XRD de la cellulose : il n'existe pas de modèle standard pour la cellulose amorphe et les fonctions de pic communes telles que les fonctions de Gauss, Lorentz et Voigt ne correspondent pas bien au profil amorphe. Il examine d'abord les effets du broyage à billes sur trois types de cellulose et les résultats montrent que le broyage à billes transforme tous les échantillons en une phase hautement amorphe présentant des profils de diffraction des rayons X (DRX) sur poudre presque identiques. Il est supposé que l'ordre à courte distance dans une unité de glucose et entre les unités adjacentes survit au broyage à billes et génère les profils XRD amorphes caractéristiques. Ceci concorde bien avec les mesures d'espacement d de la cellulose I et l'analyse XRD des oligosaccharides. Le profil XRD amorphe est modélisé à l'aide d'une équation de série de Fourier où les coefficients sont déterminés à l'aide de la méthode des moindres carrés non linéaires. Une nouvelle méthode de déconvolution des pics est ensuite proposée pour analyser les données XRD de la cellulose avec la fonction de modèle de Fourier amorphe en conjonction avec des fonctions de Voigt standard représentant les pics cristallins. L'impact de la méthode de soustraction de fond a également été évalué. L'analyse de plusieurs échantillons de cellulose a ensuite été effectuée et comparée aux méthodes conventionnelles de déconvolution des pics avec des fonctions d'ajustement de pic communes et une approche de soustraction de fond. Les résultats suggèrent que les méthodes de déconvolution de pic antérieures surestiment la cristallinité de la cellulose.

Résumé graphique

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La biologie structurale intègre des techniques et des principes de biologie moléculaire, de biochimie et de biophysique comme moyen d'élucider la structure moléculaire et la dynamique des molécules biologiquement pertinentes. Les récents progrès de l'instrumentation ont donné un nouvel élan à la biologie structurelle, car des molécules biologiques complexes peuvent désormais être analysées avec une facilité et une efficacité sans précédent. La structure tridimensionnelle des protéines et des complexes protéiques fournit de grandes informations sur les lois des activités de la vie et le mécanisme des maladies, permettant ainsi la conception rationnelle de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques. Il existe trois principales techniques de recherche pour la biologie structurale : la diffraction des rayons X sur monocristal (SC-XRD), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la cryomicroscopie électronique (Cryo-EM). Cependant, il n'y a pas de méthode « tout usage » puisque les trois offrent des avantages uniques ainsi que des limites.

Fig. 1. Trois principales techniques de recherche pour la biologie structurale. Selon les statistiques de PDB (https://www.rcsb.org/), plus de 120 000 structures protéiques résolues par SC-XRD, représentant près de 90 % du total. Et il existe environ 12 000 structures protéiques obtenues par RMN. Bien que le nombre total de structures protéiques résolues par Cryo-EM ne soit pas comparable à celui des deux premières techniques, la croissance explosive des structures de cette technique est remarquable ces dernières années.

La cristallographie aux rayons X utilise les rayons X pour déterminer la position et la disposition des atomes dans un cristal. La méthode la plus classique de cristallographie aux rayons X est la diffraction des rayons X sur un monocristal, dans laquelle les atomes du cristal amènent le faisceau de rayons X incident à produire des faisceaux diffusés. Lorsque les faisceaux diffusés atterrissent sur le détecteur, ces faisceaux produisent un motif de diffraction de speckle. Au fur et à mesure que le cristal tourne progressivement, l'angle et l'intensité de ces faisceaux diffractés peuvent être mesurés, puis une image tridimensionnelle de la densité électronique à l'intérieur du cristal est générée. Sur la base de cette densité électronique, la position moyenne des atomes dans le cristal, les liaisons chimiques, les barrières cristallines et diverses informations peuvent être déterminées. Pour un monocristal avec une pureté, une homogénéité et une régularité suffisantes, les données de diffraction des rayons X peuvent déterminer l'angle et la longueur de la liaison chimique moyenne à quelques dixièmes de degré et à quelques millièmes d'angström, respectivement.

Fig.2. La physique et les principes mathématiques de la cristallographie aux rayons X pour résoudre une structure

La technique de diffraction des rayons X sur monocristal a été proposée et développée en 1912, et elle est devenue l'outil le plus important et le plus utile pour déterminer la structure des protéines, puisque la structure des protéines de la myoglobine a été déterminée pour la première fois en 1958. De nos jours, plus de 140 000 structures de protéines ont ont été déposés dans une banque de données de protéines (https://www.rcsb.org/), dont près de 90 % sont résolus à l'aide de la technique de diffraction des rayons X sur monocristal, suggérant ses avantages dans l'étude de la structure des cristaux de macromolécules biologiques.

Le processus de la technique de diffraction des rayons X sur monocristal peut être grossièrement divisé en quatre étapes. La première étape consiste à obtenir des monocristaux de haute qualité de la protéine cible, appelée cristallisation de la protéine. Lorsque la solution de la protéine solubilisée atteint la sursaturation, elle favorise l'agrégation et la nucléation des protéines. En fin de compte, les molécules de protéines individuelles s'organisent en une série répétée de cellules unitaires en adoptant une orientation uniforme. Les cristaux qualifiés doivent être de taille suffisante (normalement plus de 50 m dans toutes les dimensions) et de qualité (structure régulière, pas de fissures ou de macles). L'obtention de monocristaux de haute qualité est l'étape limitante pour résoudre une structure avec cette méthode.

Après avoir obtenu un monocristal, une expérience de diffraction est nécessaire. Le cristal est immobilisé dans un faisceau de rayons X intense, produisant un diagramme de diffraction, qui est enregistré en tant que données de diffraction (angle et intensité des rayons X diffractés). Au fur et à mesure que le cristal tourne progressivement, les réflexions précédentes disparaissent et de nouvelles réflexions apparaissent. L'intensité de diffraction à chaque tache est enregistrée à partir de chaque direction du cristal.

Par la suite, les données de diffraction obtenues à partir du motif de diffraction sont combinées avec diverses méthodes d'analyse structurelle et d'ajustement des données pour analyser la distribution de la densité électronique dans l'espace tridimensionnel à l'intérieur de la cellule unitaire.

Dans la dernière étape, basée sur la carte de densité électronique, un modèle d'arrangement atomique dans le cristal peut être produit et affiné.

Fig.3. Le processus de la technique de diffraction des rayons X sur monocristal

Cette méthode peut donner une résolution atomique élevée et n'est pas limitée par le poids moléculaire de l'échantillon. Il convient aux protéines hydrosolubles, aux protéines membranaires ainsi qu'aux complexes macromoléculaires. Lorsqu'il est manipulé correctement, il devient un outil puissant pour fournir des données structurelles fiables de macromolécules biologiques et déterminer la position et la structure du centre actif, et aide à comprendre comment la protéine reconnaît et se lie aux molécules de ligand au niveau atomique.

Cependant, la méthode de diffraction des rayons X sur monocristal présente également plusieurs inconvénients. Tout d'abord, l'échantillon doit être cristallisable, mais la cristallisation de macromolécules biologiques avec un poids moléculaire élevé peut être difficile, en particulier, les protéines membranaires sont plus difficiles à cristalliser en raison de leur grande taille et de leur faible solubilisation. Deuxièmement, un monocristal organisé doit être obtenu pour permettre une diffraction appropriée. Enfin, la structure tridimensionnelle obtenue de l'échantillon biologique ne représente qu'une forme statique de la molécule testée (une des nombreuses possibilités), plutôt qu'une forme dynamique.

La deuxième méthode est la résonance magnétique nucléaire (RMN). Les noyaux sont des particules chargées à rotation rapide, similaires aux électrons externes. Les rapports gyromagnétiques des différents noyaux atomiques sont différents et ont donc des fréquences de résonance différentes. Le mouvement du noyau n'est pas isolé - il interagit avec les atomes environnants à la fois intra- et inter-moléculaire. Par conséquent, grâce à la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, des informations structurelles d'une molécule donnée peuvent être obtenues. En prenant la protéine comme exemple, sa structure secondaire, telle que l'hélice , la feuille , la tour, la circulaire et la boucle, reflète la disposition différente des atomes de la chaîne principale des molécules de protéine en trois dimensions. L'espacement des noyaux atomiques dans différents domaines secondaires, l'interaction entre les noyaux et les caractéristiques dynamiques des segments polypeptidiques reflètent tous directement la structure tridimensionnelle des protéines. Ces caractéristiques nucléaires contribuent toutes aux comportements spectroscopiques de l'échantillon analysé, fournissant ainsi des signaux RMN caractéristiques. L'interprétation de ces signaux par des méthodes assistées par ordinateur conduit au déchiffrement de la structure tridimensionnelle.

Fig.4. Spin nucléaire

Depuis la première observation de signaux RMN à l'état condensé en 1946, la technologie RMN a connu un développement rapide depuis plus de 70 ans, et son application s'est étendue du domaine de la physique tel que la détermination du moment magnétique nucléaire à la chimie, la médecine, la science des matériaux, sciences de la vie et bien d'autres. Notamment, dans les années 1980, la technologie RMN a été appliquée de manière créative à l'analyse structurelle des protéines, favorisant ainsi l'application de la RMN dans le domaine biologique. Bien que la quantité de données de structure tridimensionnelle des protéines obtenues par la technologie RMN ne soit pas comparable à celle de la diffraction des rayons X sur monocristal, les avantages uniques de la technologie RMN ont été largement remarqués : la RMN est capable de fournir des informations sur une base cinétique, de telle sorte que le mouvement interne des protéines sur plusieurs échelles de temps et leur mécanisme de liaison aux ligands peuvent donc être résolus.

Une expérience RMN comporte quatre étapes principales : la préparation de l'échantillon, l'acquisition des données, le traitement spectral et l'analyse structurelle. L'analyse RMN est effectuée sur des échantillons aqueux de protéines de haute pureté, haute stabilité et haute concentration. Un volume d'échantillon allant de 300 à 600 μL avec une plage de concentration de 0,1 à 3 mM. L'utilisation d'isotopes stables 15N, 13C et 2H pour le marquage des protéines peut augmenter efficacement l'intensité et la résolution du signal. Le marquage sélectif de certains acides aminés ou groupes chimiques de protéines peut réduire considérablement le chevauchement des signaux. Des expériences de RMN multidimensionnelles sont utilisées pour acquérir des informations sur la protéine. Le traitement spectral est ensuite effectué pour déterminer les atomes de la protéine correspondant à chaque pic spectral sur différents spectres RMN. Enfin, une série d'informations structurées spatialement telles que les constantes de couplage NOE et J sont utilisées pour calculer la structure spatiale à l'aide de méthodes de distance géométrique ou de dynamique moléculaire.

Fig.5. Le processus de la technologie de résonance magnétique nucléaire

La caractéristique la plus importante de la méthode RMN est que la structure tridimensionnelle des macromolécules à l'état naturel peut être mesurée directement en solution, et la RMN peut fournir des informations uniques sur la dynamique et les interactions intermoléculaires. La résolution de la structure tridimensionnelle macromoléculaire peut être aussi faible que sous le nanomètre.

Cependant, le spectre RMN des biomolécules de grande masse moléculaire est très compliqué et difficile à interpréter, limitant ainsi l'application de la RMN dans l'analyse de grosses biomolécules. De plus, cette technique nécessite des quantités relativement importantes d'échantillons purs (de l'ordre de plusieurs mg) pour obtenir un rapport signal/bruit raisonnable.

La troisième approche est la technique de cryomicroscopie électronique (Cryo-EM), qui comprend trois méthodes différentes : l'analyse de particules uniques, la tomographie électronique et la cristallographie électronique. Le mécanisme essentiel de Cryo-EM est la diffusion d'électrons. Le principe de base est décrit comme suit. Les échantillons sont préparés par cryoconservation avant analyse. Les électrons cohérents sont utilisés comme source lumineuse pour mesurer l'échantillon. Une fois que le faisceau d'électrons a traversé l'échantillon et la couche de glace à proximité, le système de lentilles convertit le signal diffusé en une image agrandie enregistrée sur le détecteur. Et un traitement du signal est effectué pour obtenir la structure tridimensionnelle de l'échantillon.

La technologie de reconstruction tridimensionnelle par microscopie électronique a été découverte pour la première fois en 1968. La structure tridimensionnelle de la queue du phage T4 a été reconstruite par des micrographies électroniques. Et puis le concept général et les méthodes de reconstruction tridimensionnelle de la microscopie électronique ont été proposés. Pour réduire les dommages causés par les rayonnements, la microscopie électronique cryogénique a été créée en 1974. Après plus de 30 ans de développement, Cryo-EM est devenu un outil puissant pour étudier la structure des macromolécules biologiques. Ces dernières années, la technologie Cryo-EM a fait des progrès révolutionnaires, en particulier dans l'analyse de particules uniques. Depuis 2013, avec les progrès considérables du détecteur d'électrons et du traitement d'images, l'analyse de particules uniques Cryo-EM a progressé si rapidement que la résolution de Cryo-EM est désormais comparable à la diffraction des rayons X sur un seul cristal. À l'heure actuelle, Cryo-EM devient un outil puissant pour déterminer la structure à haute résolution des macromolécules biologiques.

Avant d'utiliser le Cryo-EM pour observer l'échantillon, une coloration négative EM peut être utilisée pour un dépistage rapide d'un échantillon homogène. La technique d'analyse de particules uniques Cryo-EM commence par la vitrification de l'échantillon. Au cours de ce processus, la solution de protéines est instantanément refroidie, de sorte que les molécules d'eau ne cristallisent pas, formant un solide amorphe. L'échantillon congelé est ensuite criblé et les données sont collectées dans le système. Une série d'images en deux dimensions peut être prise pendant cette période. Ensuite, sur la base de nombreuses images bidimensionnelles acquises, l'alignement et la classification des particules sont effectués. Au final, les données sont traitées par un logiciel de reconstruction pour générer un modèle structurel tridimensionnel.

Fig.6. Le processus de la technique d'analyse de particules uniques Cryo-EM

Comparé à la diffraction des rayons X sur monocristal, le traitement de congélation rapide de l'échantillon maintient son état plus proche de l'état natif. De plus, cette méthode ne nécessite qu'une petite quantité d'échantillon (environ 0,1 mg), est plus tolérante sur la pureté de l'échantillon et n'a pas besoin que la protéine se cristallise.

Le principal défaut de cette technique est que les particules sont détectées dans des orientations inconnues. Des niveaux élevés de bruit, dus à l'utilisation de doses d'électrons limitées pour minimiser les dommages causés par les rayonnements, en particulier à haute résolution, ont tendance à compliquer la détermination de ces orientations, ce qui est particulièrement préoccupant pour les particules plus petites. Par conséquent, la détermination de la structure des macromolécules biologiques par Cryo-EM s'est limitée à de grands complexes ou à des modèles à faible résolution au cours des dernières années.

Fig.7. Microscopie cryoélectronique

En résumé, chaque technologie a ses propres avantages dans certaines applications, de sorte qu'une méthode peut être largement utilisée dans certains cas mais rarement dans d'autres. Ainsi, la compréhension de la nature de l'analyse est la clé du choix de la méthode. Non seulement la sélection inappropriée de la méthode produira des résultats compromis, mais elle peut également entraîner des retards importants du projet et entraîner des pertes financières. Pour plus d'informations, veuillez consulter le tableau 1.


Cristallisation et analyse par diffraction des rayons X de SpaE, une protéine basale du pilus du Lactobacillus rhamnosus GG adapté à l'intestin

SpaE est la sous-unité basale de piline prédite dans le pilus SpaFED dépendant de la sortase du Lactobacillus rhamnosus GG adapté à l'intestin et commensal. Jusqu'à présent, la caractérisation structurelle des pilines basales d'ancrage à la paroi cellulaire est restée difficile et s'est limitée à quelques exemples de genres et d'espèces pathogènes. Pour mieux comprendre la structure des mécanismes moléculaires impliqués dans l'ancrage et l'assemblage des pili dépendant de la sortase dans des bactéries moins nocives, L. rhamnosus GG SpaE pour la cristallisation a été produit par expression recombinante dans Escherichia coli. Bien que plusieurs tentatives de cristallisation de la protéine SpaE aient échoué, des cristaux trigonaux diffractés à une résolution de 3,1 Â ont finalement été produits en utilisant du PEG 3350 comme précipitant et des concentrations élevées de protéines. Une optimisation supplémentaire avec une combinaison d'additifs a conduit à la génération de cristaux SpaE sous une forme orthorhombique qui diffractaient à une résolution plus élevée de 1,5 . Pour accélérer la détermination de la structure par phasage SAD, des cristaux SpaE substitués par du sélénium (orthorhombiques) ont été cultivés et des données de diffraction des rayons X ont été recueillies à une résolution de 1,8 Å.

Mots clés: Lactobacillus rhamnosus GG SpaE adhésion piline basale interaction hôte-microbe probiotiques pili dépendant de la sortase.

Les figures

Représentations schématiques du gène…

Représentations schématiques de l'organisation des gènes du L. rhamnosus GG spaFED opéron…

Purification et analyse SDS–PAGE de…

Purification et analyse SDS–PAGE de la SpaE. ( une ) La purification en deux étapes de…

Le spectre du dichroïsme circulaire dans l'UV lointain de…

Le spectre de dichroïsme circulaire UV lointain de SpaE.

SpaE cristallisé par la vapeur-diffusion…

SpaE cristallisé par la méthode de diffusion de vapeur. ( une ) Cristaux trigonaux cultivés dans…

Diagrammes de diffraction des rayons X de SpaE…

Diagrammes de diffraction des rayons X des cristaux SpaE. ( une ) Diagramme de diffraction collecté à partir de…


Aperçu

Empyrean est la seule plate-forme qui fait tout, offrant la meilleure qualité de données sur tous les types d'échantillons. Il couvre le plus grand ensemble d'applications de diffraction, de diffusion et d'imagerie des rayons X dans un seul instrument. De plus, Empyrean répond non seulement aux attentes élevées des scientifiques et des experts XRD d'aujourd'hui, mais continuera à le faire à mesure que les thèmes de recherche évoluent. Empyrean est idéal pour l'enseignement, grâce aux grandes portes qui s'ouvrent complètement, permettant l'accès au système à plusieurs personnes mais en même temps, il est parfait pour effectuer des mesures dans des environnements R&D exigeants dans plusieurs industries.


Biologie structurale utilisant des électrons et des rayons X

Biologie structurale utilisant des électrons et des rayons X discute de la diffraction et des méthodes basées sur l'image utilisées pour la détermination de macromolécules biologiques complexes. Le livre se concentre sur la théorie de la transformée de Fourier, qui est une fonction mathématique calculée pour transformer les signaux entre le domaine temporel et fréquentiel. Composé de cinq parties, le livre examine le développement de la résonance magnétique nucléaire (RMN), qui permet le calcul des images d'une certaine protéine. Les parties 1 à 4 fournissent les informations de base et les applications des transformées de Fourier, ainsi que les différentes méthodes utilisées pour le traitement d'images par cristallographie aux rayons X et l'analyse de micrographies électroniques. La partie 5 se concentre entièrement sur l'aspect mathématique des transformées de Fourier. En outre, le livre examine des analyses structurelles détaillées de la symétrie d'un spécimen (c'est-à-dire des cristaux, des hélices, des virus polyédriques et des particules asymétriques).

Ce livre est destiné au biologiste ou au biochimiste qui s'intéresse aux différentes méthodes et techniques de calcul d'images de protéines par résonance magnétique nucléaire (RMN). Il convient également aux lecteurs sans formation en chimie physique ou en mathématiques.

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3.3H : Analyse de diffraction des rayons X - Biologie

Ce document fournit une introduction aux bases de la diffraction des rayons X (XRD), destinée principalement aux scientifiques et aux ingénieurs qui ne sont pas des experts dans le domaine mais qui sont intéressés par l'utilisation de la XRD comme outil. Après avoir décrit ce que l'on peut apprendre de la XRD et comment les instruments XRD typiques sont construits, nous approfondissons la description de l'analyse des données des détecteurs à rayons X à "zone" ou "à deux dimensions".

Les experts dans le domaine peuvent identifier des exceptions à certaines déclarations faites dans ce document, mais un effort a été fait pour trouver le bon équilibre entre simplicité et précision.

Pour une présentation plus approfondie des mêmes sujets, Paul Heiney a produit une série de vidéos didactiques sur les techniques de diffusion des rayons X.

La diffraction des rayons X (XRD) est une technique non destructive pour analyser la structure des matériaux, principalement au niveau atomique ou moléculaire. Il fonctionne mieux pour les matériaux cristallins ou partiellement cristallins (c'est-à-dire qui ont un ordre structurel périodique), mais est également utilisé pour étudier les matériaux non cristallins.

XRD repose sur le fait que les rayons X sont une forme de lumière, avec des longueurs d'onde de l'ordre du nanomètre. Lorsque les rayons X se diffusent à partir d'une substance ayant une structure à cette échelle de longueur, des interférences peuvent se produire, ce qui entraîne un schéma d'intensités plus élevées et plus faibles. Ceci est qualitativement similaire aux motifs colorés produits par les bulles de savon, dans lesquels différentes couleurs sont vues dans différentes directions.

La DRX est assez différente de la radiographie aux rayons X ou de la tomographie. La tomographie repose sur le fait que les rayons X sont absorbés plus fortement par certains matériaux que d'autres - par exemple, les os ou les tumeurs absorbent plus que les muscles ou la graisse. Par conséquent, l'image transmise fournit une image directe de la structure à l'intérieur du corps ou de l'objet (généralement une échelle de longueur d'un millimètre ou plus), ce qui en fait un outil précieux pour les médecins. (La tomographie aux rayons X est également largement utilisée dans d'autres domaines tels que la science des matériaux et la métallurgie.) En revanche, le XRD produit un motif de diffraction, qui ne ressemble pas superficiellement à la structure sous-jacente, et fournit des informations sur la structure interne sur des échelles de longueur de 0,1 à 100 nm.

Dans sa forme la plus simplifiée, une mesure générique de diffusion des rayons X est présentée ci-dessous.
Un faisceau de rayons X est dirigé vers un échantillon, et l'intensité diffusée est mesurée en fonction de la direction sortante. Par convention, l'angle entre les directions du faisceau entrant et sortant est appelé 2&thêta. Pour l'échantillon le plus simple possible, constitué de feuilles de charge séparées par une distance , une interférence constructive (plus grande intensité diffusée) est observée lorsque La loi de Bragg est satisfait: m &lambda = 2 péché &theta ici m est un nombre entier (1, 2, 3, . ), &lambda est la longueur d'onde du faisceau de rayons X, et &theta est la moitié de l'angle de diffusion 2 &theta indiqué ci-dessus.

Les matériaux réels sont bien sûr plus compliqués, mais le résultat général est qu'il existe une relation entre les distances interparticulaires au sein de l'échantillon et les angles auxquels l'intensité diffusée est la plus élevée, avec des distances plus grandes correspond à plus petite angles de diffusion 2&thêta.

Les mesures monocristallines fournissent généralement plus d'informations que les autres techniques XRD, mais elles sont aussi les plus difficiles. La croissance de monocristaux de haute qualité est au mieux difficile et souvent impossible, et de nombreuses mesures doivent être effectuées à différentes orientations d'échantillon pour obtenir les informations nécessaires à une détermination cristallographique complète.

Un motif de diffraction de poudre à partir de béhénate d'argent (un cristal organique en couches) est illustré à droite. avec un tracé de ligne correspondant.

  1. Comme alternative à la diffraction monocristalline. It is much easier to produce a powder sample than a single crystal. Although valuable information is lost during the "powder averaging" process that turns sharp spots into rings, crystal structures can still be solved with this technique as long as they are relatively small and there is not excessive overlap between the peaks. The method of Rietveld refinement is often used to determine the crystal structure that is most likely to have given rise to the observed pattern. As with single crystal diffraction, the shapes and widths of individual peaks can sometimes be analyzed to determine details of crystallite sizes, as well as microscopic strains and defects.
  2. For phase identification, most often used in mineralogy. Often a mineral or clay sample will consist of a mixture of different crystal phases. The "fingerprint" of a powder diffraction pattern can then be compared to a data base of known patterns to determine which phase or phases are present.

A famous example of this technique was the 1953 determination of the structure of DNA. In that case, growing true single crystals proved to be challenging (and analyzing the data from single crystals was also an unsolved problem at the time), but the additional orientation of the diffraction pattern due to the fiber geometry was enough to deduce the helical form of the DNA molecule.

Fiber diffraction is often used when studying long-chain molecules such as DNA, or columnar structures such as discotic liquid crystals.

In a typical GID measurement, &alphaje is held fixed and the intensity is measured as a function of 2&theta. The resultant intensity profile can be analyzed to establish the two-dimensional crystal structure within the plane of the film.

Historically, this technique was primarily used to study relatively large "objects" dispersed in a medium, such proteins dissolved in an aqueous medium, colloidal particles, micelles, or voids in porous media.

  • Production of X-rays : There are a variety of methods for producing a beam of x-rays.
    • X-ray Tube. This is the simplest and oldest approach, and is still occasionally used. A beam of electrons strikes a metallic target and X-rays are emitted. The intensity of the X-ray beam is limited by the heat released into the target by the electron beam.
    • Rotating anode X-ray Generator. This variant of the traditional X-ray tube, which became widely available in the 1970's, addresses the heat loading problem by replacing the fixed target with a rotating cylinder, water-cooled on the inside. Considerably more X-ray intensity is thereby made possible, but there are both literal and figurative costs: the engineering requirements are considerably more stringent, and rotating-anode generators are subject to breakdowns and require frequent maintenance.
    • Microfocus Tube. The most recent solution to the heat loading problem takes a different tack: the electron beam is focused down to a tiny spot (typically 50 &mum or less in diameter), so that the total heat load on the anode is quite small. Microsource tubes started to become available around 2000, and are gradually replacing rotating anode generators.
    • Synchrotron. A synchrotron X-ray source uses a totally different mechanism from the tube sources described above: the radiation emitted from a relativistic beam of electrons (or positrons) accelerated by a magnetic field. The resulting beam is generally many orders of magnitude more intense than that produced by the tabletop sources described above. However, such a beam can be produced only at a large centralized facility, obliging most users to travel substantial distances and plan their usage well in advance. For this reason, tube/rotating anode/microfocus sources, which can be operated at the user's home institution, are best suited for relatively routine measurements, while synchrotron sources are required for experiments requiring extremely high intensity or other specialized conditions. Major synchrotron sources include the Advanced Photon Source and the National Synchrotron Light Source in the US, the European Synchrotron Radiation Facility in France, the Diamond Light Source in Britain, and the Photon Factory in Japan, among others.
    • Slits or pinholes. These form a part of almost every instrument, and act by geometrically restricting the beam. To be effective, they must be constructed from a heavy element such as tungsten. Care must be taken to minimize diffuse ("parasitic") scattering from the edges of the slits which can contribute to the background signal.
    • Crystal monochromator. The most common method for producing a "monochromatic" beam (containing only a narrow spread of wavelengths &lambda) is to insert a high quality single crystal of a material such as silicon or germanium into the beam and separate out only those components of the beam that satisfy Bragg's Law. Conversely, for a beam that is already largely monochromatic, this Bragg reflection from a crystal can be used as a means of collimation. The degree of collimation and spectral selection depend on the perfection of the crystal and also the characteristics of the incoming beam.
    • X-ray Mirror. X-ray mirrors rely on the same effect referred to in our discussion of X-ray reflectivity, namely that a beam which strikes a flat surface at a very low angle can be strongly reflected. X-ray mirrors are typically made of a metal such as gold and are gently curved so as to produce a beam that is focused along a vertical and/or horizontal axis. They also affect the spectral characteristics since shorter wavelengths are reflected much less effectively than long wavelengths.
    • Multilayer Optics. This approach, which is incorporated in many units currently on the market (especially those optimized for small-angle scattering) combines the benefits of a crystal monochromator and an X-ray mirror. A multilayer coating on a curved substrate results in a monochromatic, collimated beam, most often either parallel or slightly convergent focus. The optical unit must be closely coupled with the source, but when done properly this can result in a beam that is simultaneously more intense and better collimated than achievable with previous technologies.
    • Film: For most of the 20th century photographic plates or films, generally coupled with some kind of X-ray fluorescent screen, were the dominant method for measuring diffraction patterns. A collimated beam struck the sample, and then the plate was placed behind the sample. This method was easy to deploy, but it was difficult to convert the images to quantitative plots. Photographic plates are still often used in medical X-ray radiography.
    • Scintillation Detector. Starting around the 1970's, film was largely replaced by solid state detectors, especially scintillation detectors that produced an electronic readout of the scattered intensity that could be directly read by a computer. Because scintillation detectors generally measure the scattered intensity at only one angle at a time, some type of collimation is necessary between the sample and the detector, often similar to that found between the source and the detector. Systems employing "point detector" are thus intrinsically somewhat slow, because only one angle is measured at a time, but are usually an improvement over photographic film due to their high sensitivity and easy readout in digital form.
    • 2D Detector. Two-dimensional, or "area" detectors came into increasing use around 1990. A number of different technologies are available, but all of them function essentially as "electronic film": like photographic film, they record the intensity across an entire surface, but the resultant image is directly transmitted to the data-taking computer as an array of intensities. In most cases, the intensity report for each pixel is an integer quantity, and is equal or at least proportional to the number of X-ray photons that struck that pixel in a certain amount of time.
      Area detectors combine many of the advantages of scintillation detectors and film. They are highly sensitive, and can be read out rapidly, but measure the diffraction at many angles simultaneously. The volume of data produced is thus greatly increased a single data frame from an area detector generally occupies at least 1Mb of disk space, and often 10 Mb or more.

    The first step in a diffraction experiment using an area detector is to position the sample in the X-ray beam such that diffracted rays strike the detector and then to expose the sample for a fixed amount of time. The resulting area of intensities (usually photon counts) for each pixel on the detector is then read by the computer, and displayed as a false-color image.

    For quantitative analysis, the (x,y) pixel coordinates must be converted to more useful units. The sketch to the right shows a common way of labeling the angles. A portion of the incident beam generally passes through the sample undeflected--this is called the "primary beam". It is usually necessary to have some kind of beamstop to block this beam from directly striking the detector, but the position where it aurait hit is well defined. Then, relative to the beam center position, other diffracted rays will be deflected by a scattering angle 2&theta at an azimuthal angle &chi as shown to the right.

    Instead of the scattering angle 2&theta, the amount by which the scattered beam has been deflected is often described by the momentum transfer Q:
    Q = (4 &pi / &lambda ) sin &theta

    • Single Crystal: For single crystal measurements, the pattern on the detector will consist of a large number of sharp spots. The analysis software must determine the position (2&theta, &chi) of each spot and the total (integrated) intensity within that spot. This measurement is then repeated for many different sample orientations. Detailed analysis (beyond the scope of this article) can then invert this information to determine the atomic positions within the sample.
    • Powder diffraction For powder diffraction the pattern on the detector will consist of a set of concentric sharp rings. In this case the intensity is independent of &chi. For further analysis, the 2D image is reduced to an x-y plot consisting of the intensity per pixel as a function of 2&theta, or Q averaged over all values of &chi. Producing a plot of this sort (with the option for export to other applications) is one of the central capabilities of Datasqueeze. The next task is to produce a list of scattering angles and intensities for each peak (overlapping peaks can be a problem). A commonly used approach is to perform a least-squares fit to the pattern, modeling each peak as a Gaussian or similar function together with a smooth background.
    • Solution SAXS For small angle scattering from particles embedded in a liquid or solid matrix, the scattered intensity is again independent of &chi, and again the 2D image is reduced to an x-y plot consisting of the intensity per pixel as a function of 2&theta, or Q averaged over all values of &chi. In this case a smooth pattern without sharp peaks is generally observed, but least-squares fits can be used to compare the observed pattern to the functional forms predicted for the size and shape of the individual particles. For example, the intensity predicted for scattering from uniform solid spheres of radius R is the square of the "Rayleigh Function":
      I = (const) | P(Q) | 2
      P(Q) = ( sin ( q R) - Q R cos(Q R) ) / (Q R ) 3
      Datasqueeze incorporates a wide selection of functions used for fitting SAXS data.

    The image to the top right shows the typical geometry for an area detector-based apparatus. We need to accurately map the (x,y) coordinates of a detector pixel to (2&theta,&chi).

    The first parameter that must be established is the exact position on the detector where the primary beam hits (or, would hit if it were not blocked by the beamstop). You might think that visual examination of that region of the measured image would be good enough--for example, one could choose a pixel in the middle of the shadow provided by the beamstop. However, it turns out that this is not good enough for accurate measurements one needs to know the beam center position to within a fraction of one pixel size.

    To interpret a radial distance from the beam center to a particular pixel, we also need a scale factor: the relationship between the width of one pixel and the scattering angle 2&theta. We can get a good approximate idea of this factor if we know the distance between the sample and the detector and the dimensions of each pixel (or, equivalently, the sample:detector position and the dimensions of the entire detector).

    Another issue to consider is the issue that the detector face may not be exactly perpendicular to the primary beam, but be rotated away by some small angle &beta as shown on the figure to the top right. This will have the effect of converting circular Bragg rings into ellipses on the detector.

    One of the best solutions to the accurate determination of these parameters, which is employed by the Datasqueeze calibration wizard, is to use the Bragg rings of a known calibration standard. By using the fact that these rings doit be centered on the primary beam position, doit be circular, and doit appear at known values of 2&theta, it is possible to establish all of the calibration parameters to high accuracy.


    Hendrickson

    Our laboratory studies macromolecular structure with an aim toward in-depth understanding of biological activity. Diffraction analysis is our primary research tool, but we also employ theory and other physical and biochemical methods of analysis. The program emphasizes three broad themes: structural biology of specific systems, methodology development, and biophysical principles of conformation, dynamics and assembly.

    Most of the macromolecules that we have under study relate to one or more of a few main biological subjects: cell surface interactions and signal transduction, immune response interactions, cellular responses to stress, genetic replication and transcription, carbohydrate recognition, and oxygen transport. Others have been chosen as subject for methodology development or for the analysis of general structural principles. Specific crystalline molecules that we are presently studying include the CD4 T-cell co-receptors, T-cell receptors, MHC molecules, superantigens, stem cell factor, fibroblast growth factor, insulin receptor, lymphocyte kinase, HIV envelope glycoprotein, FHIT, myelin Po, N- cadherin, ribonuclease H, carbamyl phosphate synthetase, UmuD, DnaK, streptavidin, and hemocyanin.

    The emphasis in methodology development is on crystallographic phase determination, structure refinement, computational methods, and synchrotron radiation research. Our research in phase determination centers on anomalous scattering -- particularly, on methods for exploiting multiwavelength measurements of anomalous diffraction. Our effort to enhance procedures for stereochemically restrained refinement focuses on an improved treatment of the dynamic characteristics of molecules. A Crystallographic Workbench is being developed for integrated computing. And, with Howard Hughes support, we are developing synchrotron beamlines for macromolecular diffraction studies.

    Throughout our work we seek to gain insight into general principles as well as an understanding of specific processes. This is facilitated by methods that allow us to gain structural information in the greatest possible detail and accuracy. General properties that we are addressing include protein dynamics, conformational heterogeneity, metal binding in proteins, determinants of binding strength and specificity, assembly of protein interfaces, molecular symmetry, and bound water structure.



Commentaires:

  1. Urtzi

    Les propriétés se révèlent, ce que

  2. Fridolph

    De façon intéressante :)

  3. Jabir

    Parlons-en, j'ai quelque chose à dire sur ce sujet.

  4. Kazirr

    Aussi que sans toi on ferait de très bonne phrase



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