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Sélection LacZ' : colonies bleues malgré la ligature de l'insert

Sélection LacZ' : colonies bleues malgré la ligature de l'insert


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Il a été suggéré que les bactéries transformées avec le vecteur pBlueScript, contenant un insert au milieu du gène lacZ', peuvent encore donner une couleur bleue sur X-gal, si l'insert est petit et ligaturé dans le cadre avec le gène lacZ' (source : mon cours, ResearchGate).

Je ne comprends pas comment il est possible que la traduction ne se termine pas au codon d'arrêt codé par l'insert. Est-ce quelque chose à voir avec une résiliation qui fuit ? De plus, même si une terminaison qui fuit était possible, cela signifierait qu'il y a TOUJOURS 1 chance sur 3 que l'insert soit dans le cadre.


La plupart des inserts perturbent l'expression de bêta-gal (en déplaçant le cadre de lecture et en introduisant des codons d'arrêt) et suppriment donc l'activité enzymatique requise pour cliver X-gal et produire la couleur bleue.

Votre source est d'accord avec vous - l'insertion d'un codon stop arrêtera la traduction (pas la transcription) et conservera la couleur blanche.


Beaucoup de colonies mais elles sont toutes bleues - Dois-je ajuster les ratios de ligature ? (Mai/03/2007 )

Le vecteur est pCR2.1 (ou s'appelle-t-il pCRDNA2.1 ? Il s'agit d'un vecteur TA simple avec sélection bleu/blanc sur l'ampicilline. je présumer les extrémités sont déphosphorylées.
Quand je me transforme, j'obtiens beaucoup de colonies mais elles sont presque toutes bleues. Un crible de colonies (M13 PCR) montre un produit trop petit, vecteur probablement vide, pour toutes les colonies blanches et bleues que je crible également.

Donc : efficacité de transformation décente, mais les vecteurs le sont. auto-ligaturant ?

Mes réactions de ligature sont généralement :
Tampon 2ul (5x)
0,5 ul de ligase T4
0.5ul vecteur
insert 2ul
5ul d'eau

Ligaturer 5 minutes à température ambiante, transformer 4ul

Alors, peut-être que mon rapport insert:vector n'est pas assez élevé ? L'insert est un produit PCR nettoyé d'un gel. S'agit-il simplement d'essayer différents ratios ?

Edit: je dois mentionner que c'est la première fois que j'utilise pCRDNA 2.1 - j'utilise normalement pGEM-T mais j'en ai manqué. Je ne sais pas quel âge a ce tube de pCRDNA 2.1. Jusqu'à présent, je n'aime pas beaucoup ce vecteur de clonage - il ne m'a causé que des ennuis

Je n'ai pas clone TA depuis plusieurs années, mais si j'ai raison, c'est un vecteur avec des extrémités collantes et si c'est vrai, alors j'ai la réponse. le problème est que la queue de l'insert poly A & 39s est lâche pendant le nettoyage du gel, il n'y a donc aucun moyen qu'une ligature puisse se produire. Vous n'avez pas besoin de nettoyer l'insert s'il n'y a qu'un seul produit PCR.

Juste pour être sûr, vous utilisez la polymérase Taq pour faire le bon produit PCR ? Pas de polymérase de relecture ici.

Savez-vous combien d'insert vous ajoutez ? Pourrait-il y avoir des problèmes avec la récupération du produit à partir du kit de nettoyage ?

Si votre réaction PCR est propre (une seule bande (votre produit) et exempte de bandes secondaires), il peut être judicieux de cloner directement votre produit PCR. Plus les produits PCR attendent, plus ils commenceront à perdre le porte-à-faux A.

Aussi, la ligase T4 en particulier et le tampon ligase sont-ils toujours en bon état ? La ligase T4 s'en va assez facilement et le tampon Ligase n'aime pas les cycles de gel-dégel. L'ATP dans le tampon s'éteint.

Comme il s'agit de clonage TA, le vecteur a un surplomb T, ce qui empêche la religature.

Une liste de choses sur le clonage TA
Le clonage TA repose sur la polymérase Taq ajoutant un A 3 & 39 supplémentaire au produit PCR.
Taq n'ajoute en moyenne qu'un seul A à 70 % des produits PCR qu'il fabrique.
La plupart des gens préfèrent utiliser un produit PCR frais (également recommandé par le protocole) car le surplomb A tombe après un certain temps.
Relecture des produits de la polymérase produits de PCR à extrémités franches.

Vous pouvez également tester certaines des colonies bleues pour un insert. Selon ce que vous clonez, l'expression de LacZa active peut se produire même avec une insertion.

C'est tellement vrai. Si l'insert est petit et par chance dans le cadre avec le gène lacZ. Après tout, l'extrémité N de la protéine LacZ n'est pas très importante, permettant ainsi l'insertion du site de clonage multiple dans le gène en premier lieu.

J'aurais aimé ne pas avoir à me purifier au gel. Malheureusement, je n'ai pas eu beaucoup de chance avec ma PCR ces dernières semaines et j'ai souvent plusieurs bandes (si vous reconnaissez mon nom d'utilisateur, je travaille toujours dessus. sacrément Assembly PCR - cela a si bien fonctionné les premières fois!)

Je filtre toujours toutes mes colonies blanches et quelques bleues pour faire bonne mesure. Lorsque j'utilisais une enzyme de relecture pour ma PCR d'assemblage et que je ligaturais dans pCRBLUNT, je devais cribler beaucoup de bleus car mon insert contient exactement 88 codons (donc LacZ est toujours dans le cadre). Avec un vecteur TA, ce n'est pas dans le cadre, mais je vérifie quand même.

En théorie oui! Mais en fait, je suis allé de l'avant et j'ai séquencé une de mes colonies que je pensais être positive et la séquence est revenue avec un vecteur TA religaturé parfait. Les T supplémentaires manquaient. Vraisemblablement, le vecteur était vieux et perdait ses Ts. C'était le pGEM-T dont je suis à court depuis. mais comme je l'ai dit, je ne sais pas quel âge a mon pCR2.1 alors peut-être que c'est encore pire ?

La ligase est assez récente et j'ai de minuscules aliquotes de tampon ligase (dans des tubes PCR) pour minimiser les congélations répétées. Dans tous les cas, il apparaît que la ligature fonctionne pour fermer le vecteur TA.

Il semble que mon produit PCR n'ait probablement pas de queue A. ça devrait quand même

Il y a un article où ils ont caractérisé cela (vous l'avez probablement vu). J'étais tout excité en pensant que j'avais trouvé mon problème, mais non, j'ai jeté un bref coup d'œil et mes amorces sont assez proches du consensus publié dans cet article, donc il devrait vraiment avoir une queue A.
Peut-être qu'il a perdu les queues A? Peut-être, mais j'ai essayé plusieurs tentatives de PCR et cela ne semble pas arranger les choses.

Quoi qu'il en soit, il semble que j'ai pensé aux mêmes choses que vous les gars. en y repensant maintenant, c'est probablement quelque chose à voir avec mes très mauvais résultats de PCR plutôt qu'avec les conditions de ligature. C'est un mauvais signe quand mes échantillons obtiennent une bande et qu'il n'y a rien dans le négatif mais rien dans le contrôle positif non plus!

Eh bien, merci pour votre contribution!

Lorsque vous utilisez un kit commercial, vous aurez généralement de bonnes chances de ligaturer. Vérifiez via invitrogen et faites-leur savoir.

Bien qu'il ne devrait pas s'auto-ligaturer. Mais d'une certaine manière, il est vraiment difficile de juger. Si le problème persiste, vous pouvez peut-être vérifier vos produits PCR. Séquencez-le ou quelque chose comme ça. Ouais. Je suis d'accord avec toi. Je soupçonne plutôt vos produits PCR. À votre santé.

si le vecteur est ancien ou a été mal stocké, il peut avoir perdu beaucoup de ses surplombs T. Sinon, puisque vous dites que vous devez purifier votre produit PCR sur gel, vous reste-t-il suffisamment d'ADN après la purification ? Ou essayez d'ajouter les surplombs A après le nettoyage ?

Je ne sais pas si j'aurai le temps de revoir cette ligature (thèse à rendre dans 2 semaines), mais d'autres personnes ont eu des problèmes avec la PCR donc c'est probablement la cause.

La prochaine fois que je ferai du clonage, je ferai de la PCR à extrémité collante!! Pas de digestions et pas de vecteurs TA!

Haha.. tout le meilleur pour votre thèse. Euh. Je dois dire que le clonage TA est facile à faire par rapport aux autres.


Dépistage bleu-blanc en laboratoire

Les scientifiques ont découvert que la suppression d'une section du lacZ (une mutation appelée lacZΔM15) crée une enzyme β-galactosidase non fonctionnelle. Fournir de l'ADN codant cette section d'acides aminés (appelée peptide-peptide) à une cellule bactérienne mutante lacZΔM15 en trans complète la mutation permettant une enzyme fonctionnelle. Ce processus est appelé -complémentation.

Le système décrit ci-dessus a été mis en pratique de la manière suivante. Les scientifiques ont conçu un site de clonage multiple (MCS) dans le peptide α (représenté par un coin orange sur la figure de gauche) et l'ont inséré dans un plasmide, créant un vecteur de clonage de complémentation α. Lorsqu'une réaction de clonage se déroule comme prévu et que votre ADN (rouge) est cloné dans ce MCS, le -peptide est interrompu comme indiqué dans la cellule A et ne complètera donc pas la mutation β-galactosidase de la cellule. Une réaction de clonage infructueuse laisse le -peptide intact et, par conséquent, la cellule aura une enzyme β-galactosidase fonctionnelle par complémentation (cellule B).

Comme indiqué sur la plaque représentative à droite, les colonies avec un plasmide contenant un insert ont une β-galactosidase non fonctionnelle et restent la belle couleur crème blanchâtre de la norme E. coli. D'un autre côté, la β-galactosidase intacte produit un pigment à partir de x-gal (inclus dans le milieu de la plaque de transformation), rendant la colonie bactérienne bleue. Notons que l'IPTG est également inclus dans le milieu pour assurer la transcription du lac opéron.


Sélection colorimétrique automatisée des colonies : dépistage des colonies bleu-blanc avec QPix 400 Series

Le criblage de transformants bactériens qui contiennent des plasmides recombinants avec des inserts de gènes clonés est une étape essentielle du clonage moléculaire. Une méthode de rapporteur colorimétrique appelée "criblage bleu-blanc" permet une identification pratique des colonies recombinantes et non recombinantes en fonction de la couleur. Bien que le dépistage bleu-blanc fournisse une identification visuelle des colonies transformées recombinantes, de nombreuses étapes manuelles du processus de sélection des colonies sont subjectives, lentes et sujettes aux erreurs.

La série de sélecteurs de colonies microbiennes QPix™ 400 de Molecular Devices offre une solution automatisée spécialement conçue pour un criblage colorimétrique bleu-blanc précis utilisant l'imagerie en lumière blanche et pour une surveillance efficace de l'efficacité de la transformation. La solution intègre un module de sélection bleu-blanc QPix™ Software 2.0, optique QPix™

Filtres Chroma et supports de plaque source réglables. Ce point culminant de l'application décrit les résultats d'une expérience de dépistage colorimétrique de colonie de preuve de concept utilisant le système QPix™ 420. La précision des colonies prélevées a été en outre vérifiée par séquençage d'ADN.

Principes du tramage bleu-blanc

Le mécanisme moléculaire du criblage des colonies bleu-blanc repose sur la LacZ gène rapporteur. Dans cette technique, des colonies non recombinantes avec une fonction LacZ gène codant pour la -galactosidase vire au bleu en présence de milieux de culture contenant X-gal. Ceci est en contraste avec la façon dont les colonies recombinantes avec un LacZ gène dû à une insertion réussie du gène devient blanc (Figure 1).

Figure 1. Clonage moléculaire. Représentation schématique d'une procédure de dépistage bleu-blanc typique. Le criblage bleu-blanc des colonies bactériennes implique le clonage du gène inséré dans un vecteur plasmidique avec une résistance aux antibiotiques et LacZ gène rapporteur. La ligature de l'insert dans le site de clonage multiple du vecteur inactive le LacZ gène. La transformation des compétences E. coli avec le mélange ligaturé en présence de X-gal dans les milieux de culture entraîne la formation de colonies bleues et blanches.

Utilisation du clonage moléculaire pour transfecter des colonies avec le gène d'intérêt

Pour créer une construction modèle, le gène du facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) humain a été cloné dans le site de clonage multiple (MCS) du vecteur plasmidique de clonage pUC57-Kan contenant une résistance à la kanamycine et LacZ gène (figure 2A). Chimiquement compétent E. coli (One Shot® TOP10, Life Technologies) ont été transformés avec le mélange vecteur ligaturé et gène (Human IGF). Les bactéries transformées ont ensuite été étalées sur des milieux LB contenant de la kanamycine, de l'IPTG et du X-gal et incubées pendant une nuit à 37°C. Les colonies contenant des vecteurs avec et sans le gène inséré ont été identifiées par la couleur blanche ou bleue, respectivement, avec le système QPix 420 (figure 2B).

Figure 2. Clonage d'IGF humain dans le vecteur plasmidique de clonage pUC57-Kan et criblage de colonies bleu-blanc. (UNE) L'insert de gène, l'IGF humain, a été ligaturé dans le MCS du vecteur de clonage plasmidique pUC57-Kan. (B) Des colonies bleues et blanches apparaissent sur les plaques de milieu LB contenant du X-gal à la suite de LacZ expression génique basée sur un rapporteur utilisée dans le criblage de colonies bleu-blanc.

Des supports de plaque source réglables contenant des plaques de Pétri contenant des colonies bactériennes ont été positionnés sur le lit d'imagerie avec un filtre QPix Chroma (figure 3A). Les pétriplaques ont été maintenues solidement par des loquets réglables sur les supports de plaque (figure 3B) et imagées à l'aide de lumière blanche (figure 3C).

Figure 3. Le criblage des colonies bleu-blanc utilisant les systèmes QPix utilise (UNE) Filtres optiques QPix Chroma pour une meilleure différenciation des couleurs et (B) supports de plaque source réglables pour une meilleure flexibilité des articles en plastique. Colonies imagées sous lumière blanche (C) sont ensuite analysés par le logiciel.

Sélection automatique des colonies bleues ou blanches

Les images en lumière blanche prises sur le système QPix 420 ont été analysées à l'aide du logiciel QPix 2.0, facile à utiliser. Les colonies bleues (figure 4A) ou blanches (figure 4B) ont été automatiquement identifiées et sélectionnées séparément à l'aide de la fonction de sélection automatique intégrée (figure 4C). L'utilisateur peut ajuster le seuil de l'histogramme et définir des critères de sélection de colonie, tels que la compacité, le rapport d'axe, le diamètre et la proximité manuellement pour optimiser la sélection. Les colonies bleues et blanches sélectionnées ont été prélevées de manière robotique à l'aide de la tête de prélèvement entièrement pneumatique à 96 broches du système QPix 420.

Figure 4. (A) Les exemples de colonies bleues sélectionnées avec Auto Select Blue sont indiqués par des flèches bleues. (B) Les exemples de colonies blanches sélectionnées avec Auto Select White sont indiqués par des flèches blanches. (C) La flexibilité du logiciel permet un réglage manuel du seuil d'intensité pour optimiser les résultats, par exemple pour sélectionner des colonies bleues alimentées.

Confirmation de la séquence d'ADN des colonies sélectionnées

L'exactitude de la sélection colorimétrique et du prélèvement des colonies bleues et blanches a été confirmée par séquençage de l'ADN pour vérifier la présence du gène inséré. L'amplification en cercle tournant a confirmé que 98 % des colonies blanches sélectionnées contenaient l'insert de gène cloné, l'IGF humain, dans le vecteur plasmidique de clonage pUC57-Kan. De plus, 100 % des colonies bleues sélectionnées contenaient un vecteur de clonage pUC57-Kan vide sans le gène inséré. Les résultats de cette expérience fournissent une confiance convaincante dans la confirmation de la différenciation des couleurs entre la sélection de colonies blanches et bleues à l'aide de la série QPix 400 de sélecteurs de colonies microbiennes.

Sommaire

Le criblage de colonies bleu-blanc est une méthode de détection colorimétrique qui permet une distinction pratique des colonies recombinantes transformées abritant l'insert de gène à la suite d'un clonage moléculaire. Molecular Devices propose une solution automatisée adaptée au criblage bleu-blanc sur la série QPix 400 de ramasseurs de colonies microbiennes robotiques. L'interface logicielle conviviale du logiciel QPix 2.0, ainsi que les filtres optiques, permettent une différenciation précise et robuste des couleurs en lumière blanche. Les accessoires tels que les porte-assiettes avec loquets réglables améliorent encore la compatibilité avec la vaisselle en plastique. La série QPix 400 fournit ainsi une alternative très efficace et fiable aux approches conventionnelles et manuelles basées sur la couleur pour le criblage des colonies.


2 DISCUSSION (35 %)

2.1. Si l'enzyme de restriction ne coupe que partiellement le vecteur et insère l'ADN, (1) comment le saurez-vous et (2) comment affectera-t-elle la ligature ? Expliquez vos réponses et reliez-les à vos résultats. (limite de 150 mots) (0,6 point)

Si le vecteur HindIII est partiellement coupé, il laissera 2 ensembles de fragments, des vecteurs complètement coupés ou intacts. L'insert, Lambda, produirait des sites de restriction coupés ou non coupés. Ceci affecterait à son tour la ligature car les brins complémentaires seraient plus difficiles à détecter ou ne seraient pas détectés du tout. L'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour vérifier à quel point le vecteur et les inserts ont été coupés en examinant les tailles de fragments attendues à partir d'images de gel (Ditta, Stanfield, Corbin &amp Helinski, 1980)

2.2. Comment allez-vous exclure que les cellules compétentes aient des contaminants résistants à l'ampicilline qui ont généré les colonies dans les ligatures 1-3 ? (limite de 60 mots) (0,6 point)

Pour qu'une molécule d'ADN puisse se développer et former des colonies, elle doit contenir des gènes résistants à l'ampiliciline. Un article Transformation bactérienne & sélection d'ampamp. (n.d.) a déclaré que l'ADN d'insertion linéaire, le vecteur coupé, les plasmides recombinants et les plasmides non recombinants étaient les mélanges de ligature qui devaient être sur plaque. La ligature 4 qui est le contrôle négatif est le seul plasmide qui ne formerait pas de colonies. Elle peut donc être exclue.

2.3. S'il n'y a pas de transformants des ligatures 1-3, quel pourrait être le problème ? Cela pourrait-il être un problème dans le processus de transformation ou de ligature, et comment le distingueriez-vous ? (limite de 60 mots) (0,6 point)

S'il n'y a pas de transformants des ligatures 1-3, cela pourrait être dû à une contamination croisée. Une contamination résistante à l'ampicilline éliminerait les erreurs possibles de la plaque de gélose. En dehors de l'électrophorèse sur gel, la piste 5, qui représente la colonie blanche 1, les plasmides coupés avec EcoRI formeraient des colonies si la transformation a eu lieu.

2.4. Comment le vecteur recircularisé et les plasmides recombinants produisent-ils des colonies de couleurs différentes dans cette expérience ? Expliquez votre réponse (limite de 100 mots) (0,6 point)

Dans les plasmides recombinants, les gènes LacZ sont la principale différence. En raison d'être résistant à l'ampicilline et contenant le gène lacZ, lors de l'insertion dans le gène LacZ, il serait inactif. Selon une recherche de Ditta, Stanfield, Corbin et Helinski (1980), cela perturbe la production de b-galactosidase qui formera à la place des colonies blanches. Comme pour le vecteur recircularisé, le gène lacZ n'est pas interrompu et est


Le clonage de plasmides permet l'isolement de fragments d'ADN à partir de mélanges complexes

Un fragment d'ADN de quelques paires de bases jusqu'à � kb peut être inséré dans un vecteur plasmidique. Lorsqu'un tel plasmide recombinant transforme un E. coli cellule, toutes les cellules descendantes résistantes aux antibiotiques qui proviennent de la cellule transformée initiale contiendront des plasmides avec la même séquence d'ADN insérée (Figure 7-3). L'ADN inséré est répliqué avec le reste de l'ADN plasmidique et se sépare en cellules filles à mesure que la colonie se développe. De cette manière, le fragment initial d'ADN est répliqué dans la colonie de cellules en un grand nombre de copies identiques. Puisque toutes les cellules d'une colonie proviennent d'une seule cellule parentale transformée, elles constituent un clone de cellules. Le fragment initial d'ADN inséré dans le plasmide parental est appelé ADN cloné, puisqu'il peut être isolé du clone de cellules.

Figure 7-3

Procédure générale de clonage d'un fragment d'ADN dans un vecteur plasmidique. Bien que non indiqué par la couleur, le plasmide contient une origine de réplication et un gène de résistance à l'ampicilline. Absorption de plasmides par E. coli les cellules sont stimulées par des concentrations élevées de CaCl (plus. )

Le clonage d'ADN permet d'isoler des fragments d'ADN avec une séquence nucléotidique particulière à partir d'un mélange complexe de fragments avec de nombreuses séquences différentes. À titre d'exemple simple, supposons que vous ayez une solution contenant quatre types différents de fragments d'ADN, chacun avec une séquence unique (Figure 7-4). Chaque type de fragment est inséré individuellement dans un vecteur plasmidique. Le mélange résultant de plasmides recombinants est incubé avec E. coli cellules dans des conditions qui facilitent la transformation, les cellules sont ensuite cultivées sur des plaques sélectives d'antibiotiques. Puisque chaque colonie qui se développe est issue d'une seule cellule qui a occupé un seul plasmide, toutes les cellules d'une colonie abritent le même type de plasmide caractérisé par le fragment d'ADN qui y est inséré. En conséquence, des copies des fragments d'ADN dans le mélange initial sont isolées les unes des autres dans les colonies bactériennes séparées. Le clonage d'ADN est donc une méthode puissante mais simple pour purifier un fragment d'ADN particulier à partir d'un mélange complexe de fragments et produire un grand nombre du fragment d'intérêt.

Figure 7-4

Isolement de fragments d'ADN à partir d'un mélange par clonage dans un vecteur plasmidique. Quatre fragments d'ADN distincts, représentés dans des couleurs différentes, sont insérés dans des vecteurs de clonage de plasmides, produisant un mélange de plasmides recombinants contenant chacun un seul fragment d'ADN. (Suite. )


Clonage Étape 2 : Le vecteur et la ligature Les plasmides sont des fragments circulaires extrachromosomiques d'ADN double brin trouvés dans certaines bactéries. Les plasmides utilisent l'énergie des cellules bactériennes et les voies métaboliques pour se répliquer. Pour qu'un plasmide soit utile en tant que vecteur, il doit être raisonnablement petit pour un transfert facile dans des cellules bactériennes et être capable de se répliquer en grand nombre.

Un plasmide doit être sélectionné avec un site de restriction identique aux sites de restriction dans l'ADN étranger. Si le plasmide et l'ADN étranger sont traités avec la même endonucléase de restriction, les « extrémités collantes », ou les extrémités avec des surplombs 5' ou 3', de l'ADN étranger se colleront ou se réhybrideront aux extrémités collantes des plasmides. Ainsi, le fragment d'ADN est inséré dans le vecteur plasmidique. Une deuxième enzyme, l'ADN ligase, répare les cassures des brins. L'ADN ligase est une enzyme nécessaire lors de la réplication de l'ADN pour réparer les ruptures de l'ADN et dans le cadre de notre mécanisme de réparation de l'ADN.

Comme mentionné précédemment dans le sous-ensemble de modules II-b, les amplicons PCR peuvent être clonés directement sans digérer les extrémités, mais générer souvent des «extrémités collantes» est plus efficace. De telles extrémités doivent être planifiées pour être incluses dans les amorces (voir la section PCR dans le séquençage des acides nucléiques).

Construction d'un vecteur de clonage recombinant - Centre de formation en biotechnologie de l'Université de Calgary


INTRODUCTION

Le clonage d'ADN a traditionnellement été effectué en digérant un plasmide source ou un fragment d'ADN et un vecteur receveur avec des enzymes de restriction, en extrayant les fragments digérés d'un gel et en ligaturant les fragments purifiés à l'aide d'ADN ligase (voir Protocoles actuels article Struhl, 1991). Cette approche convient pour ligaturer un ou deux fragments d'ADN dans un vecteur, mais ne fonctionne pas bien pour ligaturer plusieurs fragments dans un vecteur en une seule étape. Heureusement, de nouvelles méthodes de clonage sont disponibles qui permettent l'assemblage de plusieurs fragments dans un vecteur en une seule étape, y compris des méthodes de clonage basées sur l'homologie (par exemple, l'assemblage de Gibson) et des méthodes reposant sur des enzymes de restriction de type IIS, telles que le clonage Golden Gate (nommé dans référence au clonage de la passerelle, mais aussi comme jeu de mots avec le nom du pont). Golden Gate est réalisé en utilisant une réaction de restriction-ligation dans un thermocycleur. Les paramètres de configuration et d'exécution d'une réaction d'assemblage Golden Gate standard sont décrits dans le protocole de base 1 et décrits dans la figure 1. Le clonage Golden Gate nécessite que le vecteur et les inserts aient une structure spécifique concernant la présence ou l'absence de sites de restriction spécifiques. Une méthode de conversion d'un vecteur de clonage régulier en un vecteur de clonage compatible avec le Golden Gate est fournie dans le protocole de base 2. Un exemple d'adaptation d'un insert au clonage du Golden Gate est fourni dans le protocole de base 3, qui explique comment concevoir des amorces pour l'amplification et le clonage. d'un gène d'intérêt dans un vecteur Golden Gate.

La génération d'unités de transcription définies et l'assemblage ultérieur d'unités de transcription dans des constructions multigéniques à l'aide de méthodes de clonage traditionnelles n'est pas une tâche simple. Cela est dû non seulement à l'assemblage d'ADN lui-même, mais aussi à la difficulté de concevoir des stratégies de clonage pour de grandes constructions. Une raison de cette limitation est que les sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction utilisées à chaque étape de clonage sont généralement encore présents dans les constructions après ligature. Par conséquent, différentes enzymes de restriction doivent être utilisées pour chaque étape successive, ce qui rend la planification d'une stratégie de clonage extrêmement difficile voire impossible lorsque l'on travaille avec un grand nombre de gènes. Une solution à ce problème est apportée par la standardisation des pièces et de la stratégie d'assemblage, combinée à l'utilisation du clonage Golden Gate pour l'assemblage de l'ADN à chaque étape de clonage. Cette stratégie est employée par le système de clonage modulaire MoClo (Engler et al., 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner, & Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner, & Marillonnet, 2012). Le système MoClo est basé sur l'utilisation de pièces standard fabriquées par PCR, clonées dans un squelette de vecteur et séquencées. Les parties standard contiennent la séquence d'ADN d'un élément génétique de base, tel qu'un promoteur, une séquence codante ou un terminateur. Le protocole de base 4 fournit une méthode pour cloner des parties de produits PCR en une seule étape (Fig. 1), et un protocole alternatif fournit une méthode pour cloner de plus grandes parties en deux étapes successives. La structure standardisée des pièces leur permet d'être réutilisés dans de nombreuses constructions différentes sans avoir besoin d'amplification par PCR. Il permet également de standardiser la procédure d'assemblage. Les constructions multigéniques sont assemblées à partir de pièces de base en utilisant une série d'étapes d'assemblage en un seul pot. La stratégie de clonage et les différentes étapes de clonage utilisées avec le système MoClo sont décrites dans le protocole de base 5.

1 : EFFECTUER UNE RÉACTION DE CLONAGE GOLDEN GATE TYPIQUE

Le principe du clonage Golden Gate consiste à utiliser une enzyme de restriction de type IIS et une ligase dans une restriction-ligation pour assembler plusieurs fragments d'ADN dans un ordre linéaire défini dans un vecteur en une seule étape (Fig. 2A). Les enzymes de restriction de type IIS clivent l'ADN en dehors de leur séquence de site de reconnaissance d'ADN. Par exemple, le site de restriction de BsaI (GGTCTC N N1N2N3N4) se compose d'une séquence de site de reconnaissance d'ADN (GGTCTC) et d'un site de clivage d'ADN (↓) conduisant à un surplomb d'ADN simple brin de 4 nt (N1N2N3N4) après digestion. Pour convenir au clonage Golden Gate, tous les fragments d'ADN doivent être flanqués de sites de restriction pour une enzyme de restriction de type IIS, avec une orientation vers l'intérieur telle que les séquences du site de reconnaissance d'ADN soient clivées des fragments d'ADN au cours de l'étape de digestion (Fig. 2B) . Le vecteur de destination doit également contenir deux sites de restriction pour la même enzyme de type IIS, mais avec une orientation vers l'extérieur telle que les sites de reconnaissance d'ADN soient également clivés du vecteur par l'étape de digestion. Enfin, tous les surplombs monocaténaires de 4 nt (également appelés sites de fusion) aux extrémités des fragments d'ADN et du vecteur doivent être uniques et complémentaires pour permettre l'hybridation à l'extrémité du fragment suivant ou du vecteur. Étant donné que la molécule d'ADN recombinant circulaire attendue ne contient pas de sites de restriction pour l'enzyme utilisée, elle ne peut pas être re-digérée, ce qui permet d'effectuer la restriction et la ligature dans le même mélange réactionnel. Cela permet aux fragments d'ADN qui ont été ligaturés dans leur squelette plasmidique initial d'être soumis à plus de cycles de digestion et de ligature jusqu'à ce qu'ils soient finalement incorporés dans le produit recombinant souhaité (Fig. 2C). Ceci est utile pour le transfert d'un fragment d'un vecteur à l'autre, mais est de plus en plus important lorsque plusieurs fragments doivent être clonés en une seule étape. En effet, le nombre d'événements de ligature possibles augmente de façon exponentielle avec le nombre de plasmides dans le mélange de ligature, tandis que la chance d'obtenir un produit correctement ligaturé en une seule étape devient de plus en plus improbable (Fig. 2D). La restriction-ligation conduit à une efficacité de clonage élevée et permet de ligaturer jusqu'à 24 fragments en une seule réaction de clonage (Potapov et al., 2018).

Les fragments d'ADN utilisés peuvent être des fragments linéaires obtenus par PCR, mais peuvent également être des séquences clonées dans un plasmide circulaire. Ce protocole décrit comment effectuer une réaction de clonage Golden Gate lorsque les deux parties d'ADN et le vecteur de destination sont disponibles sous forme de plasmides.

Matériaux

  • ADN plasmidique purifié :
    • Vecteur de destination Golden Gate (voir Protocole de base 2 ou disponible auprès d'Addgene ou d'autres chercheurs)
    • Inserts (ADN plasmidique)
    • 10 U/µl BsaI (New England Biolabs, n° cat. R0535L)
    • 10 U/µl BpiI (Thermo Fisher Scientific, n° cat. ER1012)
    • 10 U/µl BsmBI (New England Biolabs, n° cat. R0580s)
    • Spectrophotomètre (par exemple, Nanodrop 1000, Peqlab)
    • Plaques PCR 0,2 ml (Thermo Fisher Scientific, réf. AB0600)
    • Joints adhésifs pour plaques PCR (Thermo Fisher Scientific, n° cat. AB0588)
    • Thermocycleur (par exemple, C1000 Touch, BioRad)
    • Microtubes à centrifuger de 1,5 ml
    • Incubateur bloc à 37° et 42°C (par exemple, Eppendorf ThermoMixer)
    • Incubateur 37°C et agitateur incubateur
    • Flacons ou tubes de culture
    • Logiciel d'analyse d'ADN (par exemple, Vector NTI, Thermo Fisher Scientific)

    REMARQUE: Enzymes de type IIS qui génèrent un surplomb de 3 nt lors du clivage, telles que LguI (Thermo Fisher Scientific, n° cat. ER1931), peut également être utilisé.

    Effectuer une restriction-ligature

    1. Mesurer la concentration d'ADN des plasmides d'insertion et de vecteur à l'aide d'un spectrophotomètre.

    2. Ajouter des quantités égales de chaque insert et vecteur au mélange réactionnel. Utilisez 20 fmol de chaque plasmide dans un volume réactionnel total de 15 ou 25 µl comme suit :

    • X1 µl d'ADN vecteur
    • X2 µl insert 1
    • X3 µl insert 2
    • X4 µl insert 3
    • 1,0 µl d'ADN ligase T4
    • 0,5 µl d'enzyme de type IIS
    • 1,5 µl de tampon de ligature 10×
    • H2O à 15 µl
    • X1 vecteur µl
    • X2 µl insert 1
    • X3 µl insert 2
    • … …
    • Xm µl d'insert m
    • 1,5 µl d'ADN ligase T4
    • 1,0 µl d'enzyme de type IIS
    • 2,5 µl de tampon de ligature 10×
    • H2O à 25 µl

    Le volume de chaque plasmide d'ADN est calculé par la formule : 20 (fmol) × taille (pb)/concentration (ng/µl)/1520. Si le volume calculé est trop faible pour un pipetage précis (<0.3 µl), le plasmide doit être dilué 10 fois dans de l'eau, et un volume 10 fois plus important doit être ajouté à partir de cette dilution.

    3. Incuber le mélange dans un thermocycleur dans les conditions suivantes :

    • 50 cycles : 37°C pendant 2 min, 16°C pendant 5 min
    • 50°C pendant 5 min
    • 80°C pendant 10 min
    • 16°C

    Lorsque Bsal est utilisé, l'étape de digestion finale de 5 minutes est effectuée à 50°C, car Bsal peut digérer à la fois à 37°C et à 50°C. En revanche, lorsque BpiI est utilisé, l'étape de digestion finale est toujours effectuée à 37°C, car c'est la température de digestion optimale pour cette enzyme.

    Transformer le produit en E. coli

    4. Ajouter le mélange de ligature complet (15 ou 25 µl) à 50 µl de compétent E. coli cellules et incuber sur de la glace pendant 30 min.

    5. Choc thermique à 42°C pendant 90 s. Laissez les cellules récupérer sur la glace pendant 2 min.

    6. Ajouter 500 µl de milieu LB ou SOC et agiter les cellules pendant 45 min à 37°C dans un ThermoMixer.

    7. Plaquer sur des plaques LB contenant l'antibiotique approprié et X-gal. Incuber une nuit à 37°C.

    Pour les réactions de clonage avec un à trois inserts, plaque 10-20 µl. Plaquer des volumes plus importants pour un nombre croissant d'inserts, car le nombre de colonies obtenues sera plus faible. Par exemple, plaquez 50 pi ou plus pour les constructions constituées de plus de trois fragments.

    Choisir des colonies et évaluer des clones

    8. Prélever des colonies individuelles et ensemencer 5 ml de milieu LB. Incuber une nuit à 37°C dans un incubateur shaker.

    Les vecteurs de clonage Golden Gate contiennent généralement un fragment LacZ pour le criblage bleu-blanc (un opéron de biosynthèse des caroténoïdes est parfois utilisé comme marqueur pour le criblage rouge-blanc). Les colonies blanches sont cueillies. Pour les réactions de clonage qui ne nécessitent pas de PCR pour la préparation des fragments, le prélèvement de deux colonies est généralement suffisant. Pour les réactions de clonage réalisées à partir de fragments amplifiés par PCR, plus de deux clones peuvent être nécessaires pour en trouver un qui ne contient aucune mutation induite par PCR.

    9. Préparer l'ADN à l'aide d'un kit miniprep, en éluant dans un volume de 50 l.

    10. Digérer 1 µl d'éluat dans une réaction de 10 µl en utilisant une enzyme appropriée (souvent Bsamoi ou BpiI lors de l'utilisation du système MoClo, voir le protocole de base 4) pour confirmer l'assemblage correct par empreinte ADN.

    11. Si l'amplification PCR a été utilisée pour préparer les fragments d'ADN, séquencer le plasmide.

    2 : ADAPTATION D'UN VECTEUR AU CLONAGE DE GOLDEN GATE

    Le clonage Golden Gate nécessite que les fragments d'ADN et le vecteur receveur soient conformes à des exigences spécifiques, telles que la présence de sites de restriction enzymatique de type IIS aux extrémités des fragments et du vecteur, et l'absence des mêmes sites de restriction dans les séquences internes des fragments et vecteur. Many vectors suitable for Golden Gate cloning are available from several research groups, and the number of vectors available will likely grow in the future. Nevertheless, converting a standard cloning vector into a Golden Gate cloning vector is sometimes required for a user's specific needs. There are many strategies to do that, including using Gibson DNA assembly or Golden Gate cloning.

    An example is provided here for converting the pET-28b (+) vector for use with Golden Gate cloning. In this example, a LacZ alpha fragment flanked by two BsaI sites is inserted in the vector, replacing the multicloning site (Fig. 3A). Les LacZ fragment will be used later for blue-white screening. Here, the two fusion sites flanking the LacZ fragment are AATG and GCTT, corresponding to the MoClo standard for cloning of coding sequences (see Basic Protocol 4). However, they can be any other sequences that a user might want, as long as they are different from each other and non-palindromic. Indeed, overhangs consisting of palindromic sequences can anneal to the same overhang of an additional copy of the same fragment in the other orientation, leading to stable ligation products that are nevertheless incorrect and resulting in a significant reduction of the cloning efficiency. In the example provided here, the ATG that is part of the first fusion site corresponds to a methionine start codon, which is cloned in-frame with a His tag present in the upstream vector sequences. The vector and the LacZ fragment are obtained by PCR, and assembly is performed using a second type IIS enzyme, BpiI. Since there are four BpiI sites in the vector, they are removed using primers designed to insert single-nucleotide mutations in the DNA recognition sequences.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Gene-specific primers from commercial vendor (e.g., Eurofins Genomics)
    • Plasmid template for amplification of LacZ cassette (e.g., pUC19, New England Biolabs, cat. no. N3041S)
    • Vector plasmid DNA (e.g., pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, cat. no. 69418)
    • High-fidelity PCR amplification kit (e.g., KOD Hot Start DNA Polymerase, Millipore Sigma, VWR, cat. no. 71086-3)
    • PCR fragment purification kit (e.g., NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, Macherey Nagel, cat. no. 740609.250)

    1. Design primers to amplify LacZ fragment.

    Primer locations and sequences for this example are shown in Figure 3. The first two primers, Pr1 and Pr2, are designed to amplify the LacZ fragment from pUC19. pUC19 is selected as a template because it has a different antibiotic resistance gene (Amp R ) from the recipient vector (Kan R ). This reduces the probability of obtaining incorrect constructs by carryover of the undigested template vector when screening clones after transformation. The amplified fragment contains a functional unit for the LacZ marker for blue-white screening. Primers Pr1 and Pr2 have BpiI restriction sites (gaagac in Fig. 3B) with 4-nt fusion sites corresponding to sequences AATG and GCTT, respectively. The fusion sites in the two primers are followed by BsaI restriction sites in opposite orientation (reverse complement of ggtctc = gagacc in Fig. 3B). Les BsaI sites will become part of the resulting vector and will be used for Golden Gate cloning once the vector is made.

    The pET-28b vector contains four BpiI restriction sites in internal sequences, which need to be removed by making single-nucleotide substitutions (a process called domestication). Eight primers are needed for this purpose (Pr3 and Pr6-14). Silent mutations are made for restriction sites located in coding sequences (in this case, the Lac I repressor, which has two BpiI sites). A final pair of primers (Pr4 and Pr5) is made to avoid having to amplify fragments larger than 2 kb this pair of primers is optional. Primers Pr3-14 all have a BpiI site with a fusion site selected to be compatible with the fusion site of the fragment to which it will be ligated.

    When ordering, it is sufficient to get the lowest amount possible (i.e., 0.01 µmol) with minimal purification (salt free).

    1. Set up one 50-μl PCR reaction with primer pair Pr1-2 using pUC19 as a template.
    2. Set up six 50-μl reactions with primers pairs Pr3-4 to Pr13-14 using pET-28b (+) as a template.

    3. Run 5 μl from each reaction on a gel to see if the PCR was successful.

    4. Purify the remaining 45 μl from each reaction using a column-based kit (i.e., Macherey Nagel NucleoSpin DNA Clean-up kit).

    This will separate the PCR product from any remaining DNA polymerase and dNTPs, as well as primer dimers that are produced at various levels in most PCR reactions.

    5. Quantify purified PCR products using a spectrometer such as a Nanodrop.

    6. Perform the Golden Gate cloning reaction (see Basic Protocol 1) using the enzyme BpiI. Transform the product into E. coli (see Basic Protocol 1) and select blue colonies.

    In this particular example, transformants should be plated on LB containing kanamycin and X-gal. Correct colonies should not be white, but blue.

    7. Prepare DNA using a miniprep kit.

    8. Digest 1 µl with BsaI in a 10-µl reaction.

    Two fragments of 5.3 kb and 506 bp are expected for this particular construct.

    Sequencing the entire plasmid with primers designed at various positions within the plasmid is desirable because PCR was used for amplification of the entire vector. However, since some regions required for replication or expression of the LacZ marker should be functional if the plasmid replicates and the colonies are blue, the entire plasmid may not need to be sequenced. At a minimum, all elements that will later be required for expression of the gene should be sequenced, including the region extending from the T7 promoter to the terminator. Sequencing of the region containing the two introduced BsaI sites is essential to make sure that the sequence of the two fusion sites is as expected.

    The cloning vector can now be used for Golden Gate cloning.

    3: ACCOMMODATING AN INSERT TO GOLDEN GATE CLONING

    This protocol explains how to design primers to accommodate a sequence of interest to Golden Gate cloning and then clone the amplified fragments in a Golden Gate destination vector. An example is given for cloning the coding sequence of an Arabidopsis thaliana isoflavone reductase amplified from an Arabidopsis cDNA template (Genbank accession NM_106183).

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from Arabidopsis)
    • Plasmid DNA of Golden Gate destination vector

    1. Design silent mutations in the open reading frame of the sequence of interest in silico using cloning software (e.g., Vector NTI).

    In this example, the coding sequence contains one BsaI site (Fig. 4A). It is removed in silico by a single-nucleotide substitution, resulting in a silent mutation (shown in red in Fig. 4B).

    2. Add to the coding sequence two flanking fusion sites for compatibility with the vector.

    In this case, add one A before the start codon to give AATG, and add GCTT after the stop codon.

    The added sequence is shown in red in Figure 4B, and fusion sites are shown in blue.

    3. Select a fusion site at the site of the mutation.

    Two PCR fragments will be amplified, one on each side of the mutation (I and FR in Fig. 4A), and then assembled via a fusion site that overlaps or is near the mutated nucleotide. The fusion site needs to be different from the other fusion sites (AATG and GCTT) and should not be palindromic. It should contain at least one G or C (more, if possible), as sites containing only As or Ts may work less well for DNA assembly (Potapov et al., 2018 ). When many fusion sites are needed, the Ligase Fidelity Viewer program (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) can be used to check the suitability of all sites. In the present example, a single sequence, GGAC, is selected (shown in yellow in Fig. 4B).

    4. Design primers starting at all fusion sites. Select two primers in opposite orientation for each mutated site (in this case, only one site). Make the primers long enough to give an appropriate melting temperature for PCR amplification.

    5. Add the sequence of the BsaI recognition site (tt ggtctc a) to the beginning of all primers.

    The final list of primers is shown in Figure 4C.

    6. Amplify the two PCR fragments using the appropriate primers pairs (Isof1-2 and Isof3-4 Fig. 4A) from the Arabidopsis cDNA template in a 50-µl reaction. Run 5 µl on a gel to check that the correct fragment was amplified. Purify the remaining 45 µl using a column-based kit according to manufacturer's instructions.

    7. Set up and perform the assembly reaction as described (see Basic Protocol 1).

    Because this example describes a simple cloning with only two fragments cloned into the vector, a simple incubation at 37°C for 2 hr, 50°C for 5 min, and 80°C for 10 min should be sufficient.

    8. Transform the ligation mix into competent E. coli, plate on LB containing kanamycin and X-gal, and screen the resulting colonies.

    Minipreps are digested with two enzymes with restriction sites flanking the insert, or with enzymes that have sites in the vector in insert. Because PCR was used for cloning, the cloned insert must be sequenced using primers for sequences in the vector flanking the insert.

    4: GENERATING SMALL STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL 0 VECTORS

    Assembly of DNA fragments from plasmids using Golden Gate cloning can be done quickly and efficiently. In contrast, assembly from PCR products requires more work, because PCR products often contain primer dimers formed by mis-annealing of primers during PCR amplification. Because primer dimers are flanked by the same type IIS restriction sites as the PCR products, they can be cloned, resulting in incorrect constructs and lowering the cloning efficiency (Fig. 5). Even if no primer dimers are made, the cloned constructs need to be sequenced to make sure that they do not contain PCR-induced mutations. Therefore, it makes a lot of sense to have a system where cloned and sequenced DNA parts can be reused in different constructs. For example, parts that contain regulatory sequences such as promoters and terminators can be reused in many different constructs.

    The modular cloning system MoClo was designed to facilitate the reuse of cloned parts in different constructs (Fig. 6). It is based on the use of basic parts that are put together using Golden Gate cloning. The basic parts are cloned as level 0 modules and assembled in level 1 cloning vectors to make transcription units. The level 1 constructs are then assembled to make level M and P multigene constructs. Basic parts contain the coding sequence of a basic genetic element flanked by two BsaI restriction sites in opposite orientation (Fig. 7). Cloning of the basic parts requires amplification from DNA or cDNA as a template. The amplified product is cloned in a recipient vector using Golden Gate cloning. The cloning steps consist of defining the part type, design primers containing BsaI restriction sites at the ends of the fragments, removing sites from internal sequences, and cloning the amplified fragments in a vector.

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from Arabidopsis)
    • Universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Addgene, plasmid #51833)

    1. Define the type of level 0 module (part).

    Parts can consist of promoters, coding sequences with or without a stop codon, C- or N-terminal fusion tags, and terminators (Fig. 7A). Each part is flanked by two BsaI sites in opposite orientation (Fig. 7B). The 4-bp sequences of the BsaI cleavage sites (fusion sites) are specific for each type of module and define which parts can be fused together. For example, a promoter module with TACT as the 3′ fusion site (Pro in Fig. 7A) can be fused only to an untranslated leader sequence with the same fusion site at the 5′ end (5UTR2 in Fig. 7A). For each part type, a specific cloning vector is available with compatible fusion sites. Alternatively, all part types can be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Figs. 7D and 8) as described in this protocol. Level 0 modules may also be composites of several basic parts. For example, constructs containing a complete transcription unit can be cloned directly as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT. Other types of genetic elements, such as a phage recombination site or a matrix attachment region, can also be cloned as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT.

    2. Introduce silent mutations in the gene sequence in silico.

    Basic parts should not contain restriction sites for the type IIS enzymes that are used with the MoClo system (BsaJE, BpiI, and optionally BsmBI). Restriction sites are removed by introducing single-nucleotide mutations, which is first performed in silico. Removal of internal sites in coding sequences can always be done with a silent mutation. Removal of sequences in promoter regions is more difficult, because sequences important for promoter function are not always known. Therefore, after domesticating promoter sequences, it will be necessary to validate experimentally in the host organism that the promoter still works as intended. Domestication of the Arabidopsis UGT78D2 gene (GenBank accession NM_121711) is presented here as an example. This gene contains one BsaI site, two BpiI sites, and one BsmBI site (Fig. 9A), which are removed by introducing four silent mutations (red in Fig. 10).

    3. Add the two standard fusion sites flanking the part.

    Because this module will be a coding sequence with a stop codon (CDS1), one A is added before the start codon to give AATG, and the sequence GCTT added after the stop codon (both fusion sites are highlighted in blue in Fig. 10).

    4. Add sequences for compatibility with the universal cloning vector.

    In this example, the part will be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121. Therefore, CTCA and CGAG are added at the beginning and end of the fragment to provide the necessary compatibility (highlighted in green in Fig. 10). These sequences will become part the BsaI restriction sites that will flank the final level 0 module.

    5. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (CTCA and CTCG for the universal cloning vector, or AATG and GCTT for the CDS1-specific cloning vector). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are highlighted in yellow in Figure 10.

    6. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard.

    For fusion sites at sites mutated to remove restriction sites, primers are designed in both orientations. The primers should be long enough to have an appropriate melting temperature. This can be calculated using any of the many programs available online or can be done manually.

    7. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    Parce que BpiI is used for assembly, the sequence tt gaagac aa is added to all primers. Primer sequences and locations are shown in Figure 9.

    8. PCR amplify the fragments.

    Amplify five fragments from Arabidopsis cDNA in separate 50-µl reactions using primer pairs Gtpr1-2 to Gtpr9-10 and a proofreading polymerase. Run 5 µl on a gel to check that each fragment was amplified as expected.

    9. Column purify the fragments.

    The amplified fragments need to be purified to remove remaining polymerase, primers, and dNTPs, and most of the primer dimers that are often present in the reaction. If a single fragment was amplified, using a DNA purification kit (e.g., Macherey Nagel DNA purification kit) is sufficient. Gel extraction of the PCR fragments of the correct size may be necessary if several DNA fragments were amplified.

    10. Set up cloning in the universal level 0 vector pAGM9121 as described (see Basic Protocol 1).

    11. Transform in E. coli and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not show the correct sequence.

    12. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BsaJE.

    13. Sequence the clones using the vector primers lev0seqf and lev0seqr (Fig. 9B).

    : GENERATING LARGE STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL –1 VECTORS

    While small parts (<1.2 kb) can be sequenced using standard primers located in flanking vector sequences, large parts cannot be sequenced entirely from vector primers. Additional sequencing primers have to be designed within the part to sequence its middle section. To facilitate sequencing without the need for custom sequencing primers for each part, an alternative strategy consists of cloning part fragments (sub-parts) that are no more than 1-1.2 kb long, sequencing the sub-parts using vector primers, and then assembling the sequenced sub-parts using a second assembly reaction to make the final level 0 module (Fig. 11). Sub-parts are cloned in a universal level –1 cloning vector (pAGM1311, Fig. 12).

    Additional Materials (also see Basic Protocol 4 )

    1. Define the part type, introduce silent mutations, add the standard fusion sites, and add sequences for compatibility with the universal cloning vector as described (see Basic Protocol 4, steps 1-4).

    2. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (in this case, ACAT and TTGT for the universal level –1 vector see step 5 below). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are the same as those in Basic Protocol 4 (highlighted in yellow in Fig. 10).

    3. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard, as described (see Basic Protocol 4, step 6).

    4. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    For cloning in level –1 vectors, BsaI is used for assembly, and thus the sequence tt ggtctc a is added to the 5′ end of all primers.

    5. Add sequences for compatibility with the universal level –1 cloning vector.

    The two fusion sites of the universal cloning vector are ACAT and TTGT, and they contain part of a BpiI restriction site that will flank the sub-part after cloning (Fig. 12). Therefore, the sequences ACAT and ACAA (reverse complement of TTGT) must be added to the two primers that delimit the group of PCR fragments that will be cloned together. These sequences are added immediately 3′ of the BsaI site and before the universal level 0 vector fusion site (CTCA or CTCG). In this example, the first three PCR products will be cloned together in the universal level –1 vector pAGM1311, and the fourth and fifth products will also be cloned together in pAGM1311. Primer sequences and locations for the first level –1 construct (Gtpr1′ to 6′) and second level –1 construct (Gtpr7′ to 10′) are shown in Figure 11.

    6. PCR amplify the fragments (see Basic Protocol 4, step 8) using the appropriate primer pairs (Gtpr1′-2′ to Gtpr9′-10′).

    7. Column purify the fragments (Basic Protocol 4, step 9).

    8. Set up two Golden Gate cloning reactions as described (see Basic Protocol 1) using the universal level –1 vector pAGM1311. Clone the first three products together in one reaction and the fourth and fifth products in the second reaction (level –1 modules in Fig. 11A).

    9. Transform in E. coli and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not provide the correct sequence.

    10. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BpiJE.

    11. Sequence clones using the vector primers Levm1seqF and Levm1seqR (Fig. 11B).

    12. Assemble level 0 modules from the level –1 sub-parts. Set up a Golden Gate cloning reaction to assemble the two selected level –1 clones in the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (see Basic Protocol 1).

    13. Transform in E. coli cellules.

    14. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BsaJE.

    Since PCR was not used to make these constructs, sequencing is not required.

    5: ASSEMBLING TRANSCRIPTION UNITS AND MULTIGENE CONSTRUCTS USING LEVEL 1, M, AND P MoClo VECTORS

    Assembly of multigene constructs using the MoClo system is done hierarchically (Fig. 6). The first step is assembly of level 0 parts in level 1 destination vectors to make constructs that usually contain a transcription unit. The second is assembly of multigene constructs which is done in alternating stages using level M and P vectors. Up to six transcription units can be assembled in a level M cloning vector to make a level M multigene construct. Then, up to six level M constructs can be further assembled into a level P vector to make a level P construct containing up to 36 transcription units. Level P constructs can themselves be further assembled into level M vectors to make even larger constructs. This process can be repeated indefinitely, until constructs become too large to be cloned as plasmids in E. coli. Level M and P assembly use Bsamoi et BpiI in an alternating fashion.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Level 0 parts
    • Level 1, M, and P destination vectors from MoClo Toolkit (Addgene, kit #1000000044)

    Assemble transcription units in level 1 vectors

    1. Select standard level 0 parts.

    The first step for planning the assembly of a multigene construct is to identify all basic parts required for each transcription unit. For example, to make a construct containing four transcription units, each composed of three parts—including a promoter with 5′-UTR (pro + 5U), a coding sequence (CDS1), and a 3′-UTR with terminator (3U + Ter)—a total of twelve parts is required.

    A list of all part types is shown in Figure 7. Parts that are not already available are cloned as described (see Basic Protocol 4). Some are already available for plants (MoClo Plant Parts Kit, Addgene, kit #1000000047), Chlamydomonas (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al., 2018 ), and cyanobacteria (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Select level 1 destination vectors.

    Fourteen level 1 vectors are available: seven for cloning a transcription unit in the forward orientation in seven different positions in the final construct, and seven for the reverse orientation (Fig. 13A). All contain two BsaI sites and the fusion sites GGAG and CGCT to provide compatibility with level 0 modules. They also contain two BpiI sites for excision of the assembled transcription unit in the next step of assembly. Les BpiI fusion sites are designed to provide compatibility from one vector to the next. In an example where four transcription units are cloned in the forward orientation, vectors for positions 1 to 4 for the forward orientation (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3, and pL1F-4) are selected.

    Les BpiI fusion site at the end of vector 7 (TGCC) is the same as the site at the beginning of vector 1, allowing one to clone more than seven genes in a multigene construct by reusing the same seven vectors indefinitely. Thus, an eighth transcription unit is cloned using vector 1, a ninth transcription unit is cloned using vector 2, and so on (Fig. 13C).

    In the example in Figure 13C, two transcription units are cloned in reverse orientation, and therefore vectors for cloning in the reverse orientation are selected. The choice of whether a transcription unit should be cloned in one orientation or the other is decided solely by the user needs.

    3. Assemble level 1 constructs.

    Constructs are assembled using four Golden Gate cloning reactions, each containing the three selected basic parts and level 1 vector. An example for cloning the first transcription unit is shown in Figure 14. The cloning reaction is performed as described (see Basic Protocol 1). Because level 1 vectors contain a LacZ fragment for blue-white screening, two white colonies are picked. As assembled transcription units are flanked by BpiI sites, miniprep DNA is checked by BpiI digestion.


    Designing primers for PCR based cloning:

    Leader Sequence: Extra base pairs on the 5' end of the primer assist with restriction enzyme digestion (usually 3-6bp)

    Restriction Site: Your chosen restriction site for cloning (usually 6-8bp)

    Do not cut within your insert

    Are in the desired location in your recipient plasmid (usually in the Multiple Cloning Site (MCS)), but do not cut elsewhere on the plasmid

    In our example, we will use EcoRI and NotI to ligate our cDNA into the recipient plasmid. Remember to insert your DNA in the correct orientation in the recipient plasmid by viewing the MCS and fusing the upstream restriction site to the forward primer and the downstream restriction site to the reverse primer.

    Next, we need to examine the DNA sequence that we want to amplify and design primers that will bind to and replicate it. The following image shows the ends of the ORF and how these are used for primer design:

    Because we are cloning an ORF, we want to clone from the start codon (ATG) to the stop codon (TGA, in this example). Assuming you are amplifying from plasmid DNA (rather than from genomic DNA or a cDNA library), roughly 18-21bp is usually sufficient to give specificity and to also be compatible with a standard PCR reaction. Therefore, our Forward Primer will use the sequence 5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3' for the region that binds the ORF and we will add the EcoRI restriction site (GAATTC) to the 5’ end of this primer, making our Forward Primer 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    Many restriction enzymes do not cut DNA efficiently at the end of a linear piece (see NEB for more information). Thus, we recommend that you add 3-6 bases upstream of your restriction site to improve cutting efficiency. You can generally add any 6 bases, but you should ensure that the bases do not result in the formation of a hairpin structure within your primer. In our case, we will add TAAGCA, resulting in a final Forward Primer sequence of 5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    For the Reverse Primer, the design is similar, but we need to use the reverse complement to get PCR amplification. We can start similarly, taking the final 18bases of the ORF, including the stop codon (5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3'), then adding NotI (GCGGCCGC) and then TAAGCA to improve restriction enzyme digestion. This gives us a sequence of 5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3' (30bp with 18bp of homology to the ORF). We now need to generate the reverse-complement of this sequence so that we can successfully amplify the ORF. You can generate the reverse-complement using existing software (a quick internet search will lead you to here and many others). If we put the sequence we chose for our reverse primer (5’-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3’) into this calculator we get a final Reverse Primer sequence of 5’-TGCTTAGCGGCCGCTCAGTACTTCGAGATATGCCA-3’.


    Introducing Recombinant Molecules into Eukaryotic Hosts

    The use of bacterial hosts for genetic engineering laid the foundation for recombinant DNA technology however, researchers have also had great interest in genetically engineering eukaryotic cells, particularly those of plants and animals. The introduction of recombinant DNA molecules into eukaryotic hosts is called transfection. Genetically engineered plants, called transgenic plants, are of significant interest for agricultural and pharmaceutical purposes. The first transgenic plant sold commercially was the Flavr Savr delayed-ripening tomato, which came to market in 1994. Genetically engineered livestock have also been successfully produced, resulting, for example, in pigs with increased nutritional value [1] and goats that secrete pharmaceutical products in their milk. [2]

    Electroporation

    Compared to bacterial cells, eukaryotic cells tend to be less amenable as hosts for recombinant DNA molecules. Because eukaryotes are typically neither competent to take up foreign DNA nor able to maintain plasmids, transfection of eukaryotic hosts is far more challenging and requires more intrusive techniques for success. One method used for transfecting cells in cell culture is called électroporation. A brief electric pulse induces the formation of transient pores in the phospholipid bilayers of cells through which the gene can be introduced. At the same time, the electric pulse generates a short-lived positive charge on one side of the cell’s interior and a negative charge on the opposite side the charge difference draws negatively charged DNA molecules into the cell (Figure 8).

    Figure 8. Electroporation is one laboratory technique used to introduce DNA into eukaryotic cells.

    Microinjection

    Figure 9. Microinjection is another technique for introducing DNA into eukaryotic cells. A microinjection needle containing recombinant DNA is able to penetrate both the cell membrane and nuclear envelope.

    An alternative method of transfection is called microinjection. Because eukaryotic cells are typically larger than those of prokaryotes, DNA fragments can sometimes be directly injected into the cytoplasm using a glass micropipette, as shown in Figure 9.

    Gene Guns

    Transfecting plant cells can be even more difficult than animal cells because of their thick cell walls. One approach involves treating plant cells with enzymes to remove their cell walls, producing protoplasts. Puis un gene gun is used to shoot gold or tungsten particles coated with recombinant DNA molecules into the plant protoplasts at high speeds. Recipient protoplast cells can then recover and be used to generate new transgenic plants (Figure 10).

    Figure 10. Heavy-metal particles coated with recombinant DNA are shot into plant protoplasts using a gene gun. The resulting transformed cells are allowed to recover and can be used to generate recombinant plants. (a) A schematic of a gene gun. (b) A photograph of a gene gun. (credit a, b: modification of work by JA O’Brien, SC Lummis)

    Shuttle Vectors

    Another method of transfecting plants involves vecteurs de navette, plasmids that can move between bacterial and eukaryotic cells. Les tumor-inducing (Tje) plasmids originating from the bacterium Agrobacterium tumefaciens are commonly used as shuttle vectors for incorporating genes into plants (Figure 11). In nature, the Tje plasmids of A. tumefaciens cause plants to develop tumors when they are transferred from bacterial cells to plant cells. Researchers have been able to manipulate these naturally occurring plasmids to remove their tumor-causing genes and insert desirable DNA fragments. The resulting recombinant Tje plasmids can be transferred into the plant genome through the natural transfer of Tje plasmids from the bacterium to the plant host. Once inside the plant host cell, the gene of interest recombines into the plant cell’s genome.

    Figure 11. Click for a larger image. Le Tje plasmid of Agrobacterium tumefaciens is a useful shuttle vector for the uptake of genes of interest into plant cells. The gene of interest is cloned into the Tje plasmid, which is then introduced into plant cells. The gene of interest then recombines into the plant cell’s genome, allowing for the production of transgenic plants.

    Viral Vectors

    Viral vectors can also be used to transfect eukaryotic cells. In fact, this method is often used in thérapie génique (see Gene Therapy) to introduce healthy genes into human patients suffering from diseases that result from genetic mutations. Viral genes can be deleted and replaced with the gene to be delivered to the patient [3] the virus then infects the host cell and delivers the foreign DNA into the genome of the targeted cell. Adenoviruses are often used for this purpose because they can be grown to high titer and can infect both nondividing and dividing host cells. However, use of viral vectors for gene therapy can pose some risks for patients, as discussed in Gene Therapy.

    Pensez-y

    • What are the methods used to introduce recombinant DNA vectors into animal cells?
    • Compare and contrast shuttle vectors and viral vectors.

    Concepts clés et résumé

    • Biotechology is the science of utilizing living systems to benefit humankind. In recent years, the ability to directly alter an organism’s genome through génétiqueingénierie has been made possible due to advances in recombinant DNA technology, which allows researchers to create recombinant DNA molecules with new combinations of genetic material.
    • Clonage moléculaire involves methods used to construct recombinant DNA and facilitate their replication in host organisms. These methods include the use of les enzymes de restriction (to cut both foreign DNA and plasmid vectors), ligature (to paste fragments of DNA together), and the introduction of recombinant DNA into a host organism (often bacteria).
    • Blue-white screening allows selection of bacterial transformants that contain recombinant plasmids using the phenotype of a gène rapporteur that is disabled by insertion of the DNA fragment.
    • Genomic libraries can be made by cloning genomic fragments from one organism into plasmid vectors or into bacteriophage.
    • cDNA libraries can be generated to represent the mRNA molecules expressed in a cell at a given point.
    • Transfection of eukaryotic hosts can be achieved through various methods using électroporation, gene guns, microinjection, vecteurs de navette, et viral vectors.

    Choix multiple

    Which of the following is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning?

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer d. DNA ligase is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning.[/hidden-answer]

    All of the following are processes used to introduce DNA molecules into bacterial cells sauf:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Transcription is ne pas used to introduce DNA molecules into bacterial cells.[/hidden-answer]

    The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called:

    1. a restriction enzyme
    2. ADN ligase
    3. transcriptase inverse
    4. ADN polymérase

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called reverse transcriptase.[/hidden-answer]

    In blue-white screening, what do blue colonies represent?

    1. cells that have not taken up the plasmid vector
    2. cells with recombinant plasmids containing a new insert
    3. cells containing empty plasmid vectors
    4. cells with a non-functional lacZ gène

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Blue colonies represent cells containing empty plasmid vectors.[/hidden-answer]

    Le Tje plasmid is used for introducing genes into:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer b. Le Tje plasmid is used for introducing genes into plant cells.[/hidden-answer]

    Vrai faux

    Recombination is a process not usually observed in nature.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]False[/hidden-answer]

    It is generally easier to introduce recombinant DNA into prokaryotic cells than into eukaryotic cells.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]True[/hidden-answer]

    Remplir les trous

    The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called ________.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called transfection.[/hidden-answer]

    Pensez-y

    1. Name three elements incorporated into a plasmid vector for efficient cloning.
    2. When would a scientist want to generate a cDNA library instead of a genomic library?
    3. What is one advantage of generating a genomic library using phages instead of plasmids?
    4. Is biotechnology always associated with genetic engineering? Expliquez votre réponse.
    5. Which is more efficient: blunt-end cloning or sticky-end cloning? Pourquoi?
    1. Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. "Generation of Cloned Transgenic Pigs Rich in Omega-3 Fatty Acids." Nature Biotechnology 24 non. 4 (2006): 435–436. &crarr
    2. Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo, and Vicente José de Figueirêdo Freitas. "Production of Recombinant Proteins in Milk of Transgenic and Non-Transgenic Goats." Brazilian Archives of Biology and Technology 54 non. 5 (2011): 927–938. &crarr
    3. William S.M. Wold and Karoly Toth. "Adenovirus Vectors for Gene Therapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy." Current Gene Therapy 13 non. 6 (2013): 421. &crarr


    Voir la vidéo: Mon expérience la ligature de trompes sous cœlioscopie. (Octobre 2022).