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Pourquoi les oxLDL s'accumulent pour former des cellules spumeuses ?

Pourquoi les oxLDL s'accumulent pour former des cellules spumeuses ?


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Dans l'athérosclérose, pourquoi les macrophages stockent tout le cholestérol des oxLDL à l'intérieur et se transforment en cellules spumeuses, et pas seulement le dégradent et retournent dans le sang ? (il y a une certaine quantité qui quitte la plaque, mais beaucoup plus restent (J Clin Invest. 2011 mai;121(5):2025-36. doi: 10.1172/JCI43802. Publication en ligne du 18 avril 2011.))

On lit beaucoup sur l'athérosclérose, mais aucune explication sur la raison pour laquelle les macrophages y restent et forment une plaque, laissant ou au moins casser le cholestérol.


En bref, le taux d'expression des protéines d'élimination du cholestérol intracellulaire comme ABCA1 dans les macrophages et les molécules en cascade de cytokines dans les lymphocytes T à côté d'autres cytokines anti-inflammatoires a un rôle important dans la SA et pourquoi les oxLDL s'accumulent dans l'intima.

Lorsqu'il y a un niveau élevé d'oxLDL, le taux de mécanisme d'élimination doit augmenter pour éliminer le cholestérol supplémentaire des macrophages et ensuite vers le foie. Et cela (augmentant le taux de mécanisme inverse) pourrait être fait par des inhibiteurs ou des régulateurs (lorsque la voie naturelle ne pouvait pas exercer suffisamment d'excrétion). => médicaments comme TONSHINONE

Il existe une énorme quantité d'informations sur la façon dont la régulation des molécules d'adhésion, des molécules de costimulation, des molécules présentatrices d'antigène et des molécules anti-inflammatoires ou inflammatoires pourrait avoir un effet sur l'accumulation d'oxLDL dans les macrophages et les lymphocytes T qui causent des dommages induits par le prooxyde d'hydrogène.

Ainsi, l'accumulation de molécules oxLDL dans les macrophages a une raison génétique et pourquoi l'être humain a évolué de cette manière est une question pour les généticiens, mais comment cela se produit pourrait être expliqué en traçant les molécules d'adhésion et de signalisation.

C'est l'un des textes sur l'accumulation d'oxLDL et l'AS.

Les macrophages absorbent un grand nombre de lipoprotéines de basse densité oxydées (oxLDL) sous l'intima et deviennent alors des cellules spumeuses, ce qui est l'un des premiers signes de lésions athéroscléreuses.

Le transporteur de cassette de liaison à l'ATP A1 (ABCA1) est une protéine membranaire intégrale qui transporte les lipides des cellules vers le foie, avec finalement une excrétion lipidique par la bile. Ce transport inverse inhibe la formation de lipides.

Ce texte montre comment la régulation de la cascade de cytokines et des cytokines pro-inflammatoires pourrait avoir un impact sur la création ou l'élimination des cellules spumeuses.

Ils ont expérimenté que la Tanshinone IIA (une molécule extraite de la racine de Salvia miltiorrhiza) augmentait significativement l'expression d'ABCA1 dans les cellules spumeuses dérivées des macrophages, augmentait la sortie de cholestérol intracellulaire et inhibait la formation de cellules spumeuses induites par l'oxLDL.

De plus, le récepteur X du foie (LXR) et le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) qui sont membres de la superfamille des récepteurs nucléaires peuvent augmenter l'expression d'ABCA1 par voie de couplage. Tan IIA a inhibé la formation de cellules spumeuses. Le mécanisme pourrait être que Tan IIA a augmenté l'expression de PPARa, LXRa et ABCA1, a facilité l'inversion du transport du cholestérol et a finalement favorisé l'efflux de cholestérol.

Les lymphocytes T dans les plaques sont principalement des lymphocytes T CD4+ qui appartiennent au sous-type Th1. La plupart des lymphocytes T CD4+ sont actifs et peuvent induire une « cascade de cytokines » ainsi que sécréter des cytokines pro-inflammatoires, l'interféron gamma (IFN-y), l'IL-12 et d'autres cytokines, entraînant éventuellement une inflammation. Des expériences ont montré que la tanshinone inhibait de manière significative la production d'IL-12 et d'IFN-y dérivés de Th1 de manière dose-dépendante. Les lymphocytes T jouent un rôle dans la formation de la SA, principalement à cause des cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les T helper de type (Th) 1 ou Th2. Par conséquent, la Tanshinone peut inhiber la formation de SA et stabiliser les plaques en réduisant la sécrétion de Th1 ou Th2. De plus, les lymphocytes T sont activés pour exprimer le CD40L, et l'expression du facteur tissulaire et des métalloprotéinases matricielles (MMP) est alors favorisée par l'interaction entre CD40L et CD40. TanIIA pourrait améliorer l'activité de la superoxyde dismutase (SOD), diminuer le niveau de malondialdéhyde (MDA) et réduire à la fois l'expression de CD40 et l'activité de MMP-2.

Donc, normalement, les macrophages pourraient excréter du cholestérol, mais le problème survient lorsque votre alimentation contient un niveau élevé de cholestérol et que l'oxLDL augmente dans votre sang.

Médecine complémentaire et alternative fondée sur des preuves, volume 2014 (2014), numéro d'article 267976, 6 pages http://dx.doi.org/10.1155/2014/267976


L'accumulation de cholestérol libre et de lipoprotéines de basse densité oxydées est associée à une inflammation portale et à une fibrose dans la stéatose hépatique non alcoolique

Les macrophages engloutissent les LDL oxydées (oxLDL) entraînant une accumulation de cholestérol cellulaire et la formation de cellules spumeuses, qui est une caractéristique de l'athérosclérose. De plus, des études récentes ont montré que l'accumulation de cholestérol libre dans les macrophages conduisant à l'activation de l'inflammasome NLRP3 et à la production d'interleukine-1β (IL-1β) a été liée à l'inflammation associée à l'athérosclérose. Cependant, il n'est pas clair si l'accumulation de cholestérol est associée à une inflammation hépatique et à une fibrose du foie. Dans cette étude, nous avons étudié l'association du cholestérol libre et de l'accumulation d'oxLDL dans la veine porte avec l'inflammation, l'athérosclérose et la fibrose dans la stéatose hépatique non alcoolique humaine (NAFLD).

Méthodes

Des coupes en série dérivées d'échantillons chirurgicaux de NAFLD ont été colorées avec de la filipine et des anticorps contre IL-1β, CD68, -smooth muscle actin (α-SMA), oxLDL et lectin-like oxLDL receptor-1 (LOX-1).

Résultats

Nous montrons que le cholestérol libre était colocalisé avec les oxLDL dans la paroi de la veine porte, et qui était associé à un rétrécissement de la lumière, à la formation de plaques, à la déformation de l'endothélium et à l'inflammation de la veine porte. L'inflammation a été mise en évidence par la colocalisation des cellules de Kupffer et de l'IL-1β et l'expression de LOX-1. Notamment, la plaque rompue était étroitement associée à l'inflammation de la veine porte. De plus, l'accumulation de cholestérol libre et d'oxLDL dans la fibrose périportale et sinusoïdale, qui était associée à l'activation régionale des cellules étoilées et à la fibrose en grillage.

Conclusion

Ces résultats révèlent une association directe entre l'accumulation de cholestérol, l'inflammation veineuse portale et la fibrose dans la NAFLD.


Introduction

75 % de tous les décès d'origine cardiovasculaire aux États-Unis sont liés à l'athérosclérose [1], une maladie progressive des artères de moyenne à grande taille caractérisée par la formation et la calcification de plaques d'athérome dans les parois des vaisseaux artériels. L'athérosclérose est reconnue comme une maladie inflammatoire chronique qui commence par le dysfonctionnement ou l'activation de l'endothélium artériel. L'expression accrue de molécules d'adhésion à la surface des cellules endothéliales activées conduit à un grand nombre de monocytes attachés à l'endothélium. Ces cellules adhérentes finissent par transmigrer à travers l'endothélium et s'accumulent dans la couche intimale de la paroi artérielle, où elles se différencient en macrophages et, en présence de certains facteurs, en cellules spumeuses [2]. Les cellules spumeuses sont le composant principal d'une traînée graisseuse [3].

Plusieurs éléments de preuve indiquent que les lipoprotéines de basse densité (LDL) et surtout sa forme oxydée (oxLDL) jouent un rôle clé dans la dysfonction endothéliale et l'athérogenèse [4, 5]. Les LDL peuvent être oxydées par les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses ou les macrophages [6]. OxLDL se lie à son récepteur de type lectine LOX-1 dans les cellules endothéliales [7, 8] et déclenche la voie de signalisation CD40/CD40L [9], qui à son tour conduit à la synthèse de chimiokines [10, 11] et de molécules d'adhésion cellulaire [ 12, 13] impliqués dans l'adhésion des monocytes à l'endothélium. Les monocytes et les macrophages captant l'oxLDL via des récepteurs scavenger [14] libèrent le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) [15]. L'absorption d'oxLDL par les macrophages transforme ces cellules en cellules spumeuses [2].

Les mastocytes, qui jouent un rôle crucial dans l'allergie en libérant de l'histamine lors de leur dégranulation [16], ont été retrouvés en nombre accru à proximité des lésions athéroscléreuses [17]. Au stade le plus précoce de l'athérosclérose, ils sont préférentiellement localisés dans la couche adventitielle de la paroi artérielle, mais ils migrent plus près des macrophages intimaux aux stades ultérieurs, où ils aident à convertir les macrophages en cellules spumeuses [18] et, avec les macrophages, dégradent les cellules extracellulaires. protéines matricielles dans les régions de l'épaule de la plaque athéroscléreuse [19]. Cette dernière activité rend la plaque instable ou vulnérable, provoquant éventuellement des événements thromboemboliques entraînant souvent une crise cardiaque ou un accident vasculaire cérébral. L'histamine libérée par les mastocytes dégranulés est le principal médiateur de l'inflammation allergique, mais elle peut également augmenter la perméabilité de la paroi vasculaire pour les LDL et favoriser la formation de lésions athéroscléreuses [20]. L'histamine provoque la prolifération des cellules musculaires lisses et leur migration vers la lésion [21]. L'activation systémique des mastocytes augmente la progression de la plaque et, dans l'athérosclérose avancée, conduit à l'hémorragie intraplaque due à la libération d'histamine [22].

Les particules de LDL ont un diamètre de 21 à 27 nm [23], c'est-à-dire qu'elles sont suffisamment petites pour être transportées à travers la paroi artérielle. D'après des mesures in vivo [24], ils s'accumulent à la fois dans les couches intimales et adventitielles de la paroi. Lorsqu'ils sont oxydés, ils entrent en contact et activent les macrophages intimaux, qui libèrent alors du TNF-α [15]. Plus tard, certaines des particules d'oxLDL se déplacent vers l'adventice, où elles interagissent avec les mastocytes adventices. Les connaissances actuelles sont que les mastocytes peuvent être activés par les complexes immuns oxLDL-IgG [25]. Cependant, les oxLDL peuvent sensibiliser les mastocytes même sans se complexer avec les molécules d'IgG [26]. Nous émettons l'hypothèse que le LDL, oxydé dans la paroi artérielle, co-active les macrophages et les mastocytes, ce qui à son tour conduit à la libération de TNF-α et d'histamine qui ont un effet séquentiel et synergique sur la dysfonction endothéliale et l'adhésion des monocytes. Il est important de dire que, dans le scénario décrit ci-dessus, les cellules endothéliales vasculaires sont d'abord exposées au TNF-α des macrophages intimaux activés, puis à l'histamine des mastocytes adventitiels activés. Nous testons l'hypothèse dans des expériences d'adhésion en flux statiques et microfluidiques et par des tests d'immunoabsorption enzymatique (ELISA) et de cytométrie en flux.


Résultats

Les cellules spumeuses dérivées de macrophages expriment CD146

Pour déterminer si le CD146 macrophage est impliqué dans le développement de l'athérosclérose, nous avons d'abord testé son expression sur les cellules spumeuses des macrophages dans les plaques athéroscléreuses de l'artère carotide de souris ApoE −/− nourries avec un régime alimentaire occidental, un modèle animal pour l'athérosclérose. Les macrophages humains ont été colorés avec des anticorps contre CD146 et CD68 (un marqueur pour les macrophages humains). L'expression de CD146 a été observée sur des cellules spumeuses de macrophages marquées par CD68 dans des plaques d'athérosclérose de patients (figure 1A). Conformément à ce résultat, les souris ApoE -/- qui avaient été nourries avec un régime occidental pendant 18 semaines, ont affiché un motif de coloration similaire de CD146 et Mac-3 (un marqueur pour les macrophages murins) dans leurs plaques aortiques (figure 1B). Ces données indiquent que l'expression de CD146 sur les cellules spumeuses des macrophages est une caractéristique commune de l'athérome murin et humain.

CD146 est régulé positivement dans les cellules spumeuses des macrophages. (UNE) Artère carotide humaine (m = 3) coloration des lésions athérosclérotiques pour CD146 (rouge) et CD68 (vert) et leur co-localisation (fusion jaune voir flèches). (B) Plaques athéroscléreuses de souris ApoE −/− (m = 5) qui a été nourri avec un régime occidental (WD) pendant 18 semaines de coloration pour CD146 (rouge) et Mac-3 (vert) et leur co-localisation (fusion jaune voir flèches). Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleu). Les lignes pointillées indiquent les limites de la lésion. Les barres d'échelle dans UNE et B sont de 50 µm. (C, RÉ) Analyse cytométrique en flux (C) ou western blot (RÉ) de l'expression de CD146 dans des macrophages péritonéaux CD11b + F4/80 + isolés de souris C57BL/6J de type sauvage nourries avec une alimentation normale (chow) ou des souris ApoE −/− (m = 5) nourris avec un régime normal ou un WD. En bas, quantification de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) de CD146 dans chaque groupe (m = 5). Expression du CD146 dans (en bas) est présenté par rapport à celui de GAPDH (contrôle de chargement). (E) Analyse par cytométrie de flux de l'expression de CD146 dans les macrophages péritonéaux F4/80 + et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) qui ont été traités avec ou sans oxLDL (50 g/ml) pendant 24 h. Panneau du bas : quantification du MFI du CD146 dans chaque groupe (m = 5). (F) Analyse par cytométrie de flux de l'expression de CD146 dans des BMDM F4/80 + traités par LDL, acétylation LDL (AcLDL) ou oxLDL (50 µg/ml) pendant 24 h. Panneau du bas : quantification du MFI du CD146 dans chaque groupe (m = 5). (G, H) Analyse par PCR en temps réel du niveau d'ARNm de Cd146 (G) ou analyse western blot du niveau de protéine CD146 (H) dans les macrophages péritonéaux et les BMDM traités par oxLDL (50 g/ml) pendant 24 h en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de NF-κB BAY11-7082 (20 M) (m = 3). (JE) Cd146 activité rapporteur promoteur-luciférase dans les cellules HEK293 traitées avec l'oxLDL (50 g/ml) en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de NF-κB, présentée par rapport à l'activité luciférase dans les cellules non stimulées, fixée à 1. (J) Dosage à double luciférase des sites de liaison putatifs de NF-κB dans le Cd146 promoteur. L'activité luciférase de ces constructions a été mesurée et normalisée à celle de la construction de type sauvage non stimulée (pGL3-WT) (m = 5). (K) Dosage ChIP de la liaison de p65 à Cd146 promoteur à l'aide d'un anticorps anti-p65 ou d'un contrôle isotypique, suivi d'une amplification par PCR des fragments d'ADN génomique recouvrant les sites de liaison -621 et -420. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. (L) Quantification du niveau relatif de produit PCR par rapport à celui d'intrant. Test ANOVA bidirectionnel, * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0,001. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Pour déterminer si l'expression de CD146 sur les macrophages est régulée par les lipoprotéines, nous avons d'abord isolé les macrophages péritonéaux (F4/80 + CD11b + ) de souris C57BL/6J de type sauvage (WT) et de souris ApoE −/− qui ont été nourries soit de manière régulière. chow ou un régime occidental, ce dernier est un modèle bien établi de in vivo formation de cellules spumeuses. Comme détecté par cytométrie en flux (figure 1C) et immunoblot (figure 1D), CD146 a été exprimé à un niveau plus élevé sur les macrophages des souris Western-diet-ApoE -/- que celui des souris chow diet-ApoE -/- et souris normales, ce qui impliquait que l'expression de CD146 pourrait être liée à l'accumulation de lipides dans les macrophages. Pour évaluer davantage cette observation, nous avons utilisé un composant principal du cholestérol, notamment le LDL, l'oxLDL ou le LDL acétylé (AcLDL) pour traiter les macrophages péritonéaux ou les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) de souris C57BL/6J, et avons examiné l'expression de CD146 par cytométrie en flux. . Nous avons constaté que seuls les oxLDL, mais pas les LDL ou les AcLDL, régulaient à la hausse l'expression de CD146 sur les macrophages péritonéaux (figure 1E) et les BMDM (figure 1F). Ces données suggèrent que l'expression de CD146 sur les macrophages pourrait être régulée par les oxLDL, un contributeur important à l'athérosclérose.

La liaison de l'oxLDL à son récepteur CD36 active le facteur de transcription NF-κB, tandis que le Cd146 promoteur contient deux sites de liaison NF-κB (Informations supplémentaires, Figure S1) nous avons donc testé si NF-κB contribue à la régulation positive de CD146 induite par oxLDL. Notamment, la régulation à la hausse de Cd146 L'ARNm (figure 1G) et la protéine (figure 1H) par oxLDL ont été nettement inhibés par l'inhibiteur de NF-κB BAY11-7082. Pour déterminer le mécanisme de la régulation positive de CD146 médiée par NF-κB, nous avons utilisé un Cd146 dosage promoteur-rapporteur de luciférase. Nous avons trouvé que Cd146 l'activité du promoteur a été fortement renforcée par l'oxLDL et diminuée par l'inhibiteur de NF-κB (figure 1I). De plus, des mutations des deux sites putatifs ont aboli l'activité luciférase (figure 1J). Afin d'examiner plus en détail si NF-κB se lie directement à ces sites putatifs, nous avons effectué un test ChIP en se concentrant sur la sous-unité p65 de NF-κB. Un anticorps spécifique de p65 a enrichi le Cd146 région promotrice de manière dépendante de l'oxLDL (Figure 1K et 1L). Collectivement, ces résultats indiquent que l'absorption des lipides oxydés des macrophages entraîne une régulation positive de CD146, qui est médiée par l'activation de NF-κB.

CD146 est requis pour l'activation des macrophages induite par l'oxLDL

Pour explorer le rôle du CD146 macrophage au cours du développement de l'athérosclérose, nous avons ensuite étudié si le CD146 est impliqué dans l'activation des macrophages induite par les oxLDL. Nous avons d'abord généré des souris knock-out CD146 spécifiques aux macrophages (CD146 M-KO) par le système Cre/LoxP (informations supplémentaires, figure S2). Ensuite, nous avons utilisé oxLDL comme stimulateur pour évaluer la fonction de CD146 dans les cascades de signalisation induites par oxLDL dans l'activation des macrophages, y compris NF-κB, Src et JNK 32,33. Les études biochimiques ont montré que l'oxLDL induisait la signalisation IκBα/NF-κB, Src et JNK dans les BMDM. Il est important de noter que les signaux induits par l'oxLDL ont été bloqués dans les BMDM CD146 M-KO (figure 2A-2D et informations supplémentaires, figure S3), ou par l'anticorps monoclonal anti-CD146 AA98 dans les BMDM CD146 WT (figure 2E-2H), indiquant que oxLDL active les macrophages d'une manière dépendante du CD146.

CD146 est requis pour l'activation des macrophages induite par les oxLDL. (UNE-H) Analyse par western blot de IκBα, phosphorylée (p-) et NF-κB total p65, Src et JNK dans des BMDM stimulées par oxLDL (50 g/ml) isolées de souris CD146 WT ou CD146 M-KO (UNE-RÉ) ou BMDM avec ou sans prétraitement avec anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (E-H). GAPDH a été utilisé comme témoin de charge. Le panneau supérieur indiquait la quantification de l'expression de CD146. (JE, J) Analyse PCR quantitative en temps réel (RT) des niveaux d'ARNm des facteurs inflammatoires Mcp-1, Mmp-9, Tnf-α, Si-γ et Il1-β dans les BMDM traités par oxLDL (50 µg/ml) pendant 24 h. (JE) Les BMDM ont été isolés de souris CD146 WT ou CD146 M-KO et stimulés comme indiqué. (J) Les BDMD CD146 WT ont été stimulés comme indiqué en présence de mIgG témoin ou d'anti-CD146 AA98 (50 µg/ml). Test ANOVA bidirectionnel, * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0,001. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Étant donné que l'activation des macrophages induite par l'oxLDL dépend principalement de CD36, nous avons ensuite déterminé si CD36 est impliqué dans le processus de CD146 sur l'activation de NF-κB en réponse à oxLDL. Nous avons observé une altération de l'activation de NF-κB dans les BMDM déficientes en CD36 et les BMDM déficientes en CD146 après stimulation avec oxLDL (Informations supplémentaires, figure S4A). De plus, la précipitation de CD146 et de CD36 n'a eu aucun effet supplémentaire sur l'activation de NF-κB par rapport à la précipitation de CD36 dans les cellules RAW264.7 (Informations supplémentaires, figure S4B).Ces résultats suggèrent que l'impact de CD146 sur l'activation de NF-κB en réponse à oxLDL est dépendant de CD36.

Pour tester si l'influence de CD146 sur l'activation de NF-κB dépend spécifiquement de l'oxLDL, nous avons répété les expériences avec le lipopolysaccharide (LPS) et le TNF-α, qui peuvent également activer NF-κB. Nous avons constaté que ni la déficience en CD146 ni l'AA98 n'avaient d'effet sur l'activation de NF-κB en réponse au LPS ou au TNF-α (Informations supplémentaires, Figure S5), suggérant que la voie NF-κB dépendante de CD146 est spécifiquement sensible à l'oxLDL.

Pour déterminer si le CD146 est requis pour la transcription induite par l'oxLDL des facteurs en aval, y compris les cytokines, les chimiokines et les métalloprotéinases matricielles, nous avons effectué une PCR quantitative en temps réel pour mesurer les niveaux d'expression d'un panel de facteurs inflammatoires en réponse à l'oxLDL. Après traitement des macrophages avec oxLDL, augmentation des niveaux d'ARNm de Mcp-1, Mmp-9, Tnf-α, Si-γ et Il1-β dans les macrophages ont été observés (Figure 2I et 2J). Il est important de noter que les macrophages isolés de souris CD146 M-KO (figure 2I) ou de souris CD146 WT prétraitées avec anti-CD146 AA98 (figure 2J) n'ont pas réussi à réguler positivement ces gènes inflammatoires lors du traitement par oxLDL, suggérant un rôle critique de CD146 dans oxLDL- induit l'activation des macrophages.

CD146 favorise l'absorption des oxLDL

Étant donné que l'expression de CD146 sur les cellules spumeuses est impliquée dans l'activation induite par les oxLDL, nous avons ensuite évalué l'implication possible de CD146 dans l'absorption des oxLDL par les macrophages. La coloration au rouge d'huile O a montré que le blocage de CD146 avec AA98 ou avec un knockdown génétique dans les macrophages altère l'absorption des oxLDL (figure 3A), indiquant que CD146 contribue à l'absorption des oxLDL par les macrophages. Ensuite, nous avons utilisé la microscopie confocale et la cytométrie en flux pour confirmer le rôle du CD146 dans l'absorption des lipides. Des oxLDL marquées au Dil ont été utilisées pour tracer l'absorption des oxLDL. Avant la détection, les cellules ont été lavées avec un tampon acide glacé pour éviter une contamination potentielle de la surface cellulaire avec des oxLDL « collantes ». Nous avons constaté que l'absorption des oxLDL par les macrophages était significativement altérée dans les macrophages des souris CD146 M-KO ou des souris CD146 WT prétraitées avec un anti-CD146 AA98 (Figure 3B-3D). De plus, la mesure de la teneur en cholestérol intracellulaire des macrophages a confirmé le rôle facilitateur du CD146 dans l'absorption des oxLDL (figure 3E). Tous ces résultats indiquent que le CD146 participe à l'absorption des oxLDL et à la formation des cellules spumeuses.

CD146 favorise la formation de cellules spumeuses. (UNE) La captation lipidique a été mesurée par coloration Oil red O de CD146 WT ou CD146 M-KO BMDM stimulés par des oxLDL (50 µg/ml) pendant 24 h avec ou sans prétraitement par anti-CD146 AA98 (50 µg/ml). La barre d'échelle est de 100 µm. Le panneau inférieur montre la quantification de la teneur en O rouge d'huile au moyen du logiciel Image-Pro Plus. (B-RÉ) Des BMDM de souris CD146 WT ou CD146 M-KO ou des BMDM avec ou sans prétraitement à l'AA98 (50 µg/ml) ont été incubés avec du Dil-oxLDL (50 µg/ml). Dil-oxLDL a été détecté par microscopie confocale (B) ou cytométrie en flux (C, RÉ). Panneau de droite : quantification du MFI de Dil-oxLDL. (E) Un dosage quantitatif des lipides biochimiques a été utilisé pour mesurer les lipides cellulaires totaux (avec ANOVA bidirectionnelle ** P < 0.01, *** P < 0,001). Les données représentent trois expériences indépendantes.

Néanmoins, la réduction de l'absorption des oxLDL par le ciblage de CD146 n'est pas due à une régulation négative de CD36 ou à une liaison altérée des oxLDL aux macrophages car ni l'engagement de AA98 ni la déficience de CD146 n'ont eu d'effet sur l'expression de CD36 (Informations supplémentaires, Figure S6A-S6C) ou sur la liaison des oxLDL aux macrophages (Informations supplémentaires, Figure S6D, S6E).

CD146 interagit avec CD36 pour faciliter son internalisation

Étant donné que le CD36 est le principal récepteur pour l'absorption des oxLDL et par la suite la formation et l'activation des cellules spumeuses, également sur la base de la découverte que CD146 et CD36 activent les signaux NF-κB, Src et JNK dans les macrophages 28,34, nous avons émis l'hypothèse que CD146 pourrait interagir avec CD36 pour médier l'absorption des oxLDL. Pour tester cela, nous avons d'abord effectué des expériences de co-immunoprécipitation (co-IP) pour tester si une interaction existe entre CD146 et CD36 dans les BMDM. Les résultats ont montré que CD36 et CD146 étaient immunoprécipités soit par l'anticorps anti-CD146 soit par l'anticorps anti-CD36, mais pas par les IgG de contrôle (figure 4A), suggérant que ces deux molécules sont associées dans les macrophages. Cette interaction a été confirmée par un in vitro essai de tirage vers le bas, dans lequel une interaction physique directe entre CD146 et CD36 a été détectée (figure 4B). Cependant, CD146 n'interagit pas directement avec les oxLDL, comme le montre le test immuno-enzymatique (Informations supplémentaires, figure S7). En outre, nous avons constaté que l'interaction entre CD146 et CD36 dans les macrophages était renforcée par les oxLDL d'une manière dépendante du temps (figure 4C) et était bloquée par l'anti-CD146 AA98 (figure 4D). Parce que AA98 reconnaît spécifiquement un épitope conformationnel au pont disulfure C452-C499 dans CD146 D4-5 35, nous nous attendions à ce que le CD146 D4-5 puisse se lier à CD36. En effet, CD146 D4-5 s'est facilement lié au CD36 (figure 4E), et cette interaction pourrait être bloquée par l'anti-CD146 AA98 (figure 4F).

CD146 interagit avec CD36. (UNE) Dosage Co-IP de CD36 et CD146 dans des BMDM. CD146 et CD36 provenant de lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un mAb anti-CD146 et anti-CD36, respectivement. (B) Interaction directe entre CD36 et CD146. CD146-ECD a d'abord été incubé avec CD36-ECD. CD146-ECD a été tiré vers le bas par anti-CD146 ME-9F1, puis précipité par des billes de protéine G. Les protéines liées ont ensuite été analysées par western blot. (C) Le test Co-IP a montré que l'interaction CD36 et CD146 était renforcée en présence d'oxLDL dans les BMDM. Analyse par immunotransfert de protéines précipitées par CD146 à partir de BMDM traités avec de l'oxLDL (50 g/ml) pour les temps indiqués. Panneau de droite : quantification du niveau de CD36 par rapport au CD146. (RÉ) Le test Co-IP a montré que l'interaction CD36 et CD146 était diminuée par l'anticorps anti-CD146 AA98. Panneau de droite : quantification du niveau de CD36 par rapport au CD146. (E) Interaction directe de CD36/CD146 ou CD36/CD146 D4-5 . CD36-ECD a d'abord été incubé avec CD146-ECD et CD146 D4-5, respectivement. CD36-ECD a été tiré vers le bas par un anticorps anti-CD36, puis précipité par des billes de protéine G. (F) AA98 a bloqué l'interaction CD36 et CD146. His-CD146-ECD ou His-CD146 D4-5 a d'abord été incubé avec des lysats cellulaires BMDM en présence de mIgG ou AA98 (50 µg/ml). Les protéines CD36 liées à His-CD146-ECD ou His-CD146 D4-5 ont été détectées par immunoblot avec un anticorps anti-CD36. * P < 0.05, ** P < 0.01. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Parce que l'internalisation de CD36 est une étape cruciale pour l'activation du signal en aval dans les macrophages 23,36,37, nous avons émis l'hypothèse que CD146 peut faciliter l'internalisation de CD36 après stimulation avec oxLDL. L'immunotransfert (Figure 5A et 5B) et l'analyse FACS (Figure 5C et 5D) des fractions membranaires plasmiques des macrophages ont montré que l'internalisation des membranes CD36 et CD146 était inhibée dans les macrophages CD146 M-KO par rapport aux macrophages CD146 WT (Figure 5A et 5C ), soulignant l'altération de l'internalisation du CD36 par le blocage du CD146. Des résultats similaires ont été obtenus avec des macrophages WT traités par AA98 (Figure 5B et 5D).

CD146 facilite l'internalisation de CD36. Western blot (UNE, B) et analyse FACS (C, RÉ) de CD146 et CD36 membranaires dans des BMDM stimulés par oxLDL isolés de souris CD146 WT ou CD146 M-KO (UNE, C) ou BMDM avec ou sans prétraitement avec anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (B, RÉ). Les fractions membranaires ont été soumises à un immunotransfert avec les anticorps indiqués. SP (pompe à sodium) a servi de contrôle de charge pour les fractions membranaires. Panneau de droite : quantification des niveaux de CD36 ou CD146 par rapport à SP (UNE, B). Panneau du bas : quantification du MFI du CD36 ou du CD146 (C, RÉ). (E, F) Western blots de CD146 et CD36 dans des fractions endosomales de BMDM isolées de souris CD146 WT ou CD146 M-KO (E) ou BMDM avec ou sans prétraitement avec anti-CD146 AA98 (50 g/ml) (F). Les fractions endosomales ont été immunoblottées avec les anticorps indiqués. Panneau de droite : quantification de CD36 ou CD146. (G, H) Des BMDM de souris CD146 WT ou CD146 M-KO ou des BMDM avec ou sans prétraitement à l'AA98 (50 µg/ml) ont été marqués avec un anticorps réticulant CD36. Ensuite, les cellules ont été incubées à 37°C pour réticuler le CD36. Les cellules ont ensuite été lavées avec un tampon de lavage acide froid pour épuiser le CD36 de surface. La microscopie confocale a été utilisée pour détecter et quantifier l'internalisation de CD36. Panneau du bas : quantification du MFI du CD36. * P < 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0,001. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Parce que la liaison des oxLDL conduit à l'internalisation du complexe CD36-lipoprotéine dans des structures de type endosome 38,39, nous avons ensuite testé si CD146 est nécessaire pour la translocation endosomique de CD36 après stimulation avec oxLDL. Nous avons isolé des fractions endosomales (Informations supplémentaires, Figure S8) et analysé l'expression de CD36 et CD146 par immunoblot. Nous avons constaté que la translocation induite par l'oxLDL de CD36 et CD146 aux fractions endosomales était inhibée dans les macrophages CD146 M-KO et les macrophages WT traités par AA98 (Figure 5E et 5F). Pour confirmer ce résultat, nous avons examiné leur localisation subcellulaire dans les BMDM par microscopie confocale. Une localisation intracellulaire minimale de CD36 et CD146 a été observée dans les cellules au repos, mais après traitement avec oxLDL, CD36 et CD146 se sont déplacés vers les vésicules de type endosome. En revanche, ce processus a été inhibé dans les macrophages CD146 M-KO et les macrophages WT traités à l'AA98 (Informations supplémentaires, Figure S9).

Pour confirmer la fonction de CD146 dans l'internalisation de CD36, nous avons effectué un test de réticulation de CD36. Nous avons constaté que lors de la liaison à un anticorps de réticulation CD36, l'internalisation de CD36 était significativement supprimée dans les macrophages déficients en CD146 et dans les macrophages CD146 WT traités avec AA98 (Figure 5G et 5H). Collectivement, ces résultats suggèrent que CD146 est impliqué dans l'absorption des lipides en interagissant avec CD36 et en facilitant l'internalisation du complexe récepteur-ligand.

CD146 contribue à la rétention des macrophages dans l'athérome

L'expression de facteurs de rétention et d'émigration contribue à la rétention des macrophages dans les plaques 7 . Étant donné que CD146 favorise l'activation de NF-κB induite par l'oxLDL et que NF-κB contrôle l'expression d'un panel de gènes migrateurs macrophagiques, nous avons ensuite déterminé si CD146 est requis pour l'expression des facteurs de rétention des macrophages (CD36, nétrine-1 et Sema3E) et facteur d'émigration (CCR7) en réponse à l'oxLDL. Nous avons constaté que la régulation à la hausse induite par l'oxLDL des facteurs de rétention des macrophages et la régulation à la baisse de CCR7 étaient inhibées par un inhibiteur de NF-κB (Informations supplémentaires, figure S10), indiquant que NF-κB contrôle l'expression des gènes liés à la migration des macrophages. En outre, nous avons observé une diminution de l'expression de CD36, de la nétrine-1 et de Sema3E et une augmentation de l'expression de CCR7 dans les macrophages CD146 M-KO et CD36 KO et dans les macrophages WT traités par AA98 (Figure 6), suggérant que CD146 peut avoir un rôle important dans rétention des macrophages dans les plaques en régulant partiellement l'expression des facteurs liés à la migration.

Le CD146 contrôle l'expression des facteurs migratoires des macrophages en réponse à l'oxLDL. (UNE, B) Analyse PCR quantitative en temps réel (RT) des niveaux d'ARNm des facteurs migratoires des macrophages CD36, Nétrine-1, Sema 3E et Ccr7 dans des BMDM qui ont été incubés avec de l'oxLDL (50 µg/ml) pendant 24 h. (UNE) Les BMDM ont été isolés de souris WT, CD146 M-KO ou CD36 KO et stimulés comme indiqué (B) Les BDMD WT ont été stimulées comme indiqué en présence de mIgG témoin ou d'anti-CD146 AA98 (50 g/ml). (C, RÉ) Analyse par transfert Western des facteurs migratoires des macrophages CD36, Netrin-1 et CCR7 dans les BMDM qui ont été traités comme indiqué. GAPDH a été utilisé comme témoin de charge. (C) Les BMDM ont été isolés de souris WT, CD146 M-KO ou CD36 KO et stimulés comme indiqué (RÉ) Les BDMD WT ont été stimulées comme indiqué en présence de mIgG témoin ou d'anti-CD146 AA98 (50 g/ml). Panneau de droite : quantification du niveau d'expression protéique par rapport à GAPDH. * P < 0.05, ** P < 0.01. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Des études antérieures ont montré que l'engloutissement anormal des lipides conduit à la rétention des macrophages dans l'athérome 18 . Nous avons ensuite exploré si CD146 contribue à la rétention des macrophages sous hyperlipidémie en utilisant le système de chambre transwell Boyden. Nous avons observé que l'oxLDL bloquait la migration des macrophages induite par le ligand 19 de la chimiokine (motif C-C) (CCL19) et CCL21 (Figure 7A-7D), qui sont les ligands du récepteur de la chimiokine CCR7 et facilitent l'émigration des macrophages des plaques athéroscléreuses. Cependant, le déficit en CD146, le déficit en CD36 (Figure 7A et 7B) et l'anticorps anti-CD146 AA98 (Figure 7C et 7D) ont restauré la rétention des macrophages induite par les oxLDL, démontrant que CD146 est essentiel pour la rétention des macrophages induite par les oxLDL.

CD146 facilite la rétention des cellules spumeuses des macrophages. (UNE, B) Migration de BMDMs isolés de souris WT, CD146 M-KO ou CD36 KO vers CCL19 (UNE) ou CCL21 (500 ng/ml) (B) pendant l'oxLDL (50 g/ml) la stimulation a été mesurée dans une chambre Transwell Boyden (m = 5). Le nombre de cellules migrées a été compté. (C, RÉ) Test de migration des BMDM vers le CCL19 (C) ou CCL21 (500 ng/ml) (RÉ) pendant la stimulation oxLDL (50 g/ml) avec ou sans anti-CD146 AA98 (50 g/ml) en utilisant une chambre Transwell Boyden (m = 5) (test ANOVA bidirectionnel). (E) Photomicrographie représentative d'une section lésionnelle de souris ApoE -/- au départ où des cellules YG-bille + dérivées de monocytes ont été observées. Rouge : cellules Mac-3 + bleu : noyaux colorés au DAPI vert : billes YG (la lame élastique interne est également verte en raison de l'autofluorescence). Les flèches indiquent les cellules contenant des billes fluorescentes dans la section de la lésion. lu, lumière de l'aorte. La barre d'échelle est de 100 µm. (F, G) In vivo analyse du recrutement de macrophages marqués par billes (en vert) et de la rétention dans les plaques athéroscléreuses de souris CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/− (F), ou souris ApoE −/− traitées par AA98 ou mIgG (G) à l'aide d'un système de suivi des monocytes. Les résultats sont présentés sous forme de billes par zone à 10 jours (ligne de base, cinq souris par groupe) et 14 jours (huit souris par groupe) après l'injection de billes. Au moins 20 sections par souris ont été analysées. Test ANOVA bidirectionnel. * P < 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0,001. Les données représentent trois expériences indépendantes.

Pour approfondir le rôle du CD146 dans la rétention des macrophages chargés de lipides dans les plaques d'athérosclérose, nous avons effectué des expériences de suivi des macrophages chez des souris chimériques de moelle osseuse CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/−. En bref, 10 jours après l'injection des microsphères (définies ici comme ligne de base, correspondant au moment où le recrutement optimal des monocytes marqués dans la plaque athéroscléreuse et l'élimination des monocytes marqués du sang périphérique, Informations supplémentaires, Figure S11) et 14 jours après injection, les nombres de macrophages marqués dans les plaques ont été mesurés (figure 7E). Nous avons constaté que le nombre de macrophages dans les plaques CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/− était similaire à la ligne de base (Figure 7F), suggérant que la migration des macrophages dans les plaques n'était pas affectée après le déficit en CD146. Cependant, le nombre de macrophages marqués par des billes dans les plaques CD146 M-KO →ApoE −/− a diminué de 60 % au jour 14, en revanche, les plaques CD146 WT →ApoE −/− présentaient un nombre similaire de billes au départ et au jour 14 ( Figure 7F), suggérant que moins de macrophages étaient retenus dans les lésions en l'absence de CD146. Ces données indiquent que CD146 est requis pour la rétention des macrophages dans les plaques athéroscléreuses. Pour confirmer cela, nous avons ensuite effectué une expérience de suivi des macrophages chez des souris ApoE-/- qui ont été administrées avec anti-CD146 ou mIgG. Nous avons constaté que dans le groupe traité par mIgG, le nombre de macrophages marqués par des billes au jour 10 et au jour 14 était similaire, suggérant que la plupart des macrophages étaient retenus dans les lésions. En revanche, les souris traitées avec l'anti-CD146 AA98 avaient moins de macrophages (diminution ∼ 50 %) dans les plaques au jour 14 par rapport à celui de la ligne de base (figure 7G). Ces données indiquent que l'expression de CD146 sur les macrophages inhibe leur émigration hors des plaques, sans affecter leur infiltration.

La suppression ciblée de CD146 dans les macrophages atténue l'athérosclérose

Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons émis l'hypothèse que la suppression de CD146 dans les macrophages pourrait atténuer le développement de l'athérosclérose déjà établie en inhibant la rétention des macrophages dans les plaques. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré des souris avec ou sans CD146 macrophage en transférant les cellules de moelle osseuse CD146 WT ou CD146 M-KO dans des souris ApoE -/- irradiées létalement et nourries avec un régime occidental pendant 12 semaines. L'analyse du plasma n'a révélé aucune différence dans le profil lipidique entre les deux groupes. Les poids corporels dans les deux groupes étaient également inchangés (Informations supplémentaires, Figure S12). Malgré des profils de cholestérol similaires, l'analyse de l'aorte en face et la quantification de la charge lésionnelle par analyse transversale de l'aorte ont révélé que les souris CD146 M-KO →ApoE −/− présentaient une zone de lésion athéroscléreuse inférieure à celle de CD146 WT →ApoE -/- souris (Figure 8A-8E).

La suppression ciblée de CD146 dans les macrophages conduit à une charge d'athérosclérose plus faible et à des plaques moins complexes. (UNE) Images représentatives de l'athérosclérose dans l'aorte en face de souris CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/−. L'aorte a été colorée avec de l'huile rouge O. (B) Images représentatives de la coloration au rouge huile O de lésions isolées de souris CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/−. (C) Coloration H&E de lésions athéroscléreuses isolées de souris CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/− (m = 8). Les lignes pointillées indiquent les limites de la lésion. La barre d'échelle est de 100 µm. (RÉ) Zone de lésion des plaques athéroscléreuses des racines aortiques des souris CD146 WT →ApoE −/− et CD146 M-KO →ApoE −/−, présentée pour chaque génotype à travers les 400 m de la racine aortique (m = 8). (E) Quantification de la zone de lésion des plaques aortiques isolées de chaque génotype (m = 8). (F) La distribution des plaques précoces, modérées et avancées en fonction du stade histologique des lésions athéroscléreuses (m = 8). (G) Quantification du nombre de macrophages Mac-3 + dans les plaques aortiques (m = 8, au moins 10 sections par souris). (H) Quantification des zones centrales nécrotiques des plaques aortiques (m = 8, au moins 20 sections par souris). (JE) Coloration Masson Trichrome (collagène) des plaques aortiques (gauche). Panneau de droite : quantification de la coloration (m = 8, au moins 10 sections par souris). La barre d'échelle est de 100 µm. Test ANOVA unidirectionnel, *P < 0.05, ** P < 0.01.

Pour suivre l'évolution de l'athérosclérose, les lésions ont été regroupées dans les trois catégories suivantes, comme décrit précédemment 40 : lésions avec stries graisseuses précoces, lésions modérées avec une coiffe collagénique et lésions avancées avec atteinte de la média et augmentation de la zone nécrotique. Notre analyse a montré que les plaques CD146 WT →ApoE −/− ont subi une progression de plaque plus sévère, alors que les souris CD146 M-KO →ApoE −/− avaient des plaques beaucoup moins avancées (Figure 8F), indiquant que le CD146 macrophage favorise la progression des lésions athéroscléreuses. à des stades plus avancés. De plus, la coloration de Mac-3 a confirmé beaucoup moins de macrophages dans les plaques de souris CD146 M-KO →ApoE-/- (Figure 8G). La charge abondante de cellules spumeuses macrophages a contribué à l'instabilité de la plaque athéroscléreuse. L'analyse de la morphologie des plaques a montré que les souris CD146 M-KO →ApoE-/- contenaient un noyau nécrotique plus petit (figure 8H). De plus, la teneur en collagène des plaques était significativement plus élevée chez les souris CD146 M-KO →ApoE-/- (Figure 8I). Ensemble, ces résultats suggèrent que l'expression de CD146 dans les macrophages lésionnels facilite la formation de plaques d'athérosclérose et augmente la complexité de la peste en améliorant la rétention des macrophages, suggérant que CD146 macrophage peut servir de cible thérapeutique potentielle.

Le ciblage du CD146 inhibe l'athérosclérose

Étant donné que le CD146 contribue à l'absorption des oxLDL et à la rétention des cellules spumeuses des macrophages, et que le ciblage du CD146 macrophage avec l'anticorps AA98 (qui reconnaît le CD146 murin, informations supplémentaires, figure S13) a inhibé l'absorption des lipides et favorisé l'émigration des macrophages, le CD146 macrophage peut servir d'agent thérapeutique potentiel. cible de l'athérosclérose. Nous avons ensuite examiné les effets préventifs et thérapeutiques de l'AA98 dans le traitement de l'athérosclérose. Tout d'abord, nous avons nourri des souris ApoE -/- avec un régime occidental pendant 18 semaines et les avons traitées simultanément avec de l'AA98 ou des IgG de contrôle. Les souris ont ensuite été sacrifiées et le développement des lésions athéroscléreuses a été quantifié en effectuant une analyse histologique de sections consécutives (figure 9A). Fait intéressant, par rapport aux souris témoins traitées au mIgG, la taille de la plaque chez les souris traitées à l'AA98 était significativement réduite (figure 9B et 9C). L'analyse de caractérisation histologique des plaques a révélé que les souris traitées à l'AA98 présentaient moins de lésions avancées (15 %) et de stade plus précoce (65 %) que le groupe témoin (figure 9D). La coloration Mac-3 a montré que moins de macrophages ont été observés dans les lésions des souris traitées par AA98 que celles des souris traitées par mIgG (figure 9E). De plus, nous avons observé un noyau nécrotique plus petit (figure 9F) et une teneur en collagène plus élevée (figure 9G) dans les plaques des souris traitées par AA98. Cependant, le taux sérique de triglycérides, cholestérol, HDL, LDL, FFA et oxLDL, ainsi que le poids corporel étaient similaires entre les deux groupes (Informations supplémentaires, Figure S14A et S14B), suggérant que le ciblage du CD146 avec un anticorps inhibait le développement de l'athérosclérose. sans affecter le cholestérol sérique.

CD146 comme cible pour le traitement de l'athérosclérose. (UNE-G) Le ciblage préventif du CD146 avec des anticorps réduit l'athérosclérose. Des souris ApoE-/- ont reçu une injection préventive de mIgG ou d'AA98 lorsqu'elles ont commencé un régime occidental (huit souris par groupe). Toutes les quantifications ont été réalisées en utilisant au moins 15 coupes par souris. (UNE) Schéma posologique d'intervention d'une thérapie ciblée sur CD146 à l'aide d'anti-CD146 AA98 ou d'IgG de contrôle dans l'athérosclérose induite par un régime riche en graisses (HFD). (B) Zone de lésion des plaques des racines aortiques de chaque groupe de souris, présentée pour chaque groupe à travers les 400 m de la racine aortique (m = 8). (C) Quantification de l'aire de lésion de plaques aortiques isolées de souris ApoE-/-. (RÉ) La distribution des plaques précoces, modérées et avancées en fonction du stade histologique des lésions athéroscléreuses. (E) Quantification des plaques aortiques immunocolorées pour les macrophages à l'aide du marqueur macrophage Mac-3. (F) Quantification des zones centrales nécrotiques des plaques aortiques. (G) Quantification de la coloration trichrome de Masson (collagène) des plaques aortiques. (H-N) Le ciblage thérapeutique du CD146 avec des anticorps réduit l'athérosclérose (cinq souris par groupe). Toutes les quantifications ont été réalisées en utilisant au moins 15 coupes par souris. (H) Schéma posologique d'intervention d'une thérapie ciblée sur CD146 à l'aide d'anti-CD146 AA98 ou d'IgG de contrôle dans l'athérosclérose induite par HFD. Des souris ApoE-/- ont été nourries avec un HFD pendant 12 semaines avant un traitement par anticorps pendant 6 semaines supplémentaires, moment auquel les souris ont été sacrifiées. (JE) Zone de lésion des plaques d'athérosclérose des racines aortiques de chaque groupe de souris, présentée pour chaque groupe à travers les 400 m de la racine aortique (m = 5). (J) Quantification de l'aire de lésion de plaques aortiques isolées de souris ApoE-/-. (K) La distribution des plaques précoces, modérées et avancées en fonction du stade histologique des lésions athéroscléreuses. (L) Quantification des plaques aortiques immunocolorées pour les macrophages à l'aide du marqueur macrophage Mac-3. (M) Quantification des zones centrales nécrotiques des plaques aortiques. (N) Quantification de la coloration Masson Trichrome (collagène) des plaques aortiques. La barre d'échelle est de 100 µm. Test ANOVA unidirectionnel, * P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0,001.

Pour tester si le CD146 pouvait servir de cible thérapeutique pour les plaques d'athérosclérose établies, nous avons traité des souris ApoE −/− qui avaient été nourries avec un régime riche en cholestérol pendant 12 semaines (avec des plaques apparentes comme le montre la figure 9J) avec l'un ou l'autre des anticorps anti-CD146. AA98 ou un anticorps témoin pendant 6 semaines supplémentaires (figure 9H). Par rapport au groupe témoin, nous avons observé une taille de plaque plus petite (figure 9I et 9J) ainsi qu'une complexité de plaque beaucoup moins importante (figure 9K), une accumulation de macrophages moindre (figure 9L), un noyau nécrotique plus petit (figure 9M) et une teneur en collagène plus élevée (figure 9N) dans les plaques des souris traitées par AA98. Cependant, les profils lipidiques et le poids corporel n'ont pas été modifiés entre les deux groupes (Informations supplémentaires, Figure S14C et S14D). Ensemble, ces résultats suggèrent que le ciblage de CD146 pourrait être une stratégie thérapeutique réalisable pour inhiber le développement de l'athérosclérose en favorisant l'émigration des macrophages de la plaque.


Entrée et sortie : recrutement de monocytes vers, rétention et sortie de la paroi artérielle

Les DC et les macrophages résident déjà dans les aortes des souris C57BL/6 avant le développement de l'athérosclérose (9, 10). Les CD sont observées dans l'intima des régions prédisposées à l'athérosclérose de l'aorte C57BL/6, et des macrophages abondants se trouvent dans l'adventice aortique (10). Des expériences élégantes utilisant le transfert de moelle osseuse entre des souris porteuses de variantes alléliques de l'antigène leucocytaire commun CD45 ont démontré que les cellules dérivées de monocytes dans les plaques d'athérosclérose sont d'origine médullaire (11). Les mécanismes de recrutement des monocytes dans les aortes non enflammées ne sont pas bien définis. On en sait plus sur l'orientation des monocytes vers les aortes au cours de l'athérogenèse (12). Le roulement des monocytes sur l'endothélium enflammé se produit d'une manière dépendante de la P-sélectine, et l'absence de P-sélectine entraîne une diminution des stries graisseuses avec une réduction concomitante des macrophages émigrés dans les plaques (13). La sélectine E chevauche la sélectine P pour soutenir le roulement. Suivi d'un roulement sur l'endothélium aortique enflammé, les monocytes utilisent la molécule d'adhésion cellulaire vasculaire (VCAM)-1 pour un roulement lent et une adhésion étroite (13). Vcam1 D4/D4 Ldlr Les souris −/− n'exprimant que 8 % de VCAM-1 normal ont montré une diminution de la formation de lésions précoces (14). Il existe des preuves que β2 les intégrines et la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM)-1 pourraient être impliquées dans le soutien du recrutement des monocytes dans les aortes, mais cela n'a pas été trouvé dans toutes les études (13).

Le réseau de récepteurs chimiokines/chimiokines est essentiel pour la direction de la migration des leucocytes dans des conditions homéostatiques et inflammatoires (figure 2). De nombreux rapports ont décrit le rôle important des chimiokines CXCL1, CCL2, MIF (facteur d'inhibition de la migration des macrophages), CXCL16 et CX3CL1 et de leurs récepteurs CXCR2, CCR2, CXCR2 et CXCR4, CXCR6 et CX3CR1 dans la régulation du recrutement des leucocytes pendant l'athérosclérose ( 15).

Recrutement de monocytes sur la paroi vasculaire sujette à l'athérosclérose. Les monocytes utilisent un réseau chevauchant de molécules d'adhésion et de récepteurs de chimiokines pour pénétrer dans la paroi artérielle. La P-sélectine prend en charge le roulement et les interactions monocytes-plaquettes. Monocytes α4β1 l'intégrine interagissant avec VCAM-1 endothéliale réduit la vitesse de roulement et conduit à une adhérence ferme. Les chimiokines immobilisées en surface, notamment CXCL1, CXCL2, CXCL4, CCL5 et d'autres, peuvent activer les monocytes au fur et à mesure de leur passage, ce qui augmente l'adhérence de α4β1 l'intégrine par la signalisation de l'intérieur vers l'extérieur et le regroupement des récepteurs. Les monocytes élevés Ly6C utilisent CCR2, CX3CR1 et CCR5 pour migrer vers les aortes, tandis que les monocytes faibles Ly6C utilisent CCR5. La L-sélectine, interagissant avec un ligand inconnu, et CXCR6, interagissant probablement avec CXCL16, sont partiellement responsables du recrutement lymphocytaire, probablement à partir des vasa vasorum et sous les lésions des veinules endothéliales hautes.

Polarisation des macrophages

Les macrophages M1 et M2 se trouvent dans les lésions athérosclérotiques. Les macrophages M1 sont le résultat de l'activation classique par le lipopolysaccharide en présence d'IFN-γ, ce qui conduit à la production de niveaux élevés d'IL-12, IL-23, IL-6, IL-1 et TNF-α . Les macrophages M2 activés alternativement se différencient en présence d'IL-4, d'IL-13, d'IL-1 ou de vitamine D3 et ont tendance à produire de grandes quantités d'IL-10 et à exprimer des récepteurs piégeurs, des récepteurs de mannose et de l'arginase (20).


Métabolisme des lipides INTESTINAUX et assemblage des chylomicrons

Absorption intestinale des lipides

Grâce à l'absorption des lipides alimentaires, l'intestin est un régulateur clé des lipides stockés et circulants. Ce sont principalement les entérocytes de l'intestin grêle qui régulent activement la libération des lipides alimentaires dans la circulation (503-505). Les principaux lipides issus de l'alimentation sont les triglycérides, les phospholipides et les esters de cholestéryle. Dans la lumière intestinale, les lipides ingérés sont émulsifiés par les sels biliaires pour favoriser leur hydrolyse par les lipases (Figure 9) (506-509). Les triglycérides constituent le plus grand pourcentage des lipides intestinaux. La lipolyse des triglycérides libère des acides gras libres (acides gras non estérifiés) et des monoacylglycérides (Figure 9). Ceux-ci sont absorbés sur la surface luminale des entérocytes à la fois par diffusion libre et activement par transport à médiation protéique dans le cytosol des entérocytes (Figure 9) (508-510). Les principaux transporteurs identifiés à ce jour sont le CD36 (maintenant connu sous le nom de SR-B2 (511)) et plusieurs protéines de liaison et de transport des acides gras (512-514).

Graphique 9.

Métabolisme intestinal des triglycérides et du cholestérol. Dans la lumière intestinale, les triglycérides alimentaires (TG) et le cholestérol sont émulsifiés par des sels biliaires qui améliorent leur absorption. Les lipases dans la lumière intestinale digèrent les triglycérides en acides gras libres (FFA) et en monoacylglycérides (MAG). Ceux-ci sont absorbés dans l'entérocyte où ils sont utilisés dans la synthèse de TG, de phospholipide et d'ester de cholestéryle (CE). Une grande partie de la TG synthétisée dans les entérocytes est conditionnée, avec les phospholipides, le cholestérol et les protéines, dans des chylomicrons, qui sont sécrétés à la surface basolatérale de l'entérocyte et pénètrent dans le système lymphatique. L'assemblage des chylomicrons commence dans le réticulum endoplasmique. Lors de la synthèse de l'apolipoprotéine B48 (apoB48), la protéine acquiert des phospholipides de la membrane du réticulum endoplasmique ainsi que du cholestérol et des TG pour former un chylomicron primordial. L'acquisition continue de TG et de CE et de protéines échangeables plus petites (par exemple, l'apolipoprotéine A-IV et l'apolipoprotéine C-III) dans le réticulum endoplasmique agrandit la particule pour former un préchylomicron. Les préchylomcirons sont transportés vers l'appareil de Golgi dans des vésicules COPII spécialisées. Dans l'appareil de Golgi, le préchylomicron se transforme en chylomicron. Le processus de maturation comprend la glycosylation de l'apoB48, l'acquisition de protéines supplémentaires (par exemple, l'apolipoprotéine A-I) et de lipides. Les vésicules de sécrétion formées à partir du Golgi transportent les chylomicrons matures vers la surface basolatérale de l'entérocyte. La fusion de la membrane des vésicules sécrétoires avec la membrane plasmique libère le chylomicron dans l'espace extracellulaire où il est absorbé dans les lactés près de l'entérocyte et, ainsi, pénètre dans la circulation lymphatique. Le cholestérol alimentaire dans la lumière intestinale est absorbé dans l'entérocyte par un processus impliquant la protéine 1 de type Niemann-Pick C1 (NPC1L1). Le cholestérol des entérocytes et le CE peuvent être incorporés dans les chylomicrons et sécrétés avec la TG. De plus, le cholestérol des entérocytes peut être directement excrété dans la lumière intestinale à l'aide des transporteurs de cassettes hétérodimères liant l'ATP G5 et G8 (ABCG5/G8). Le cholestérol des entérocytes peut également être transporté et incorporé dans la membrane basolatérale pour s'écouler dans la circulation.

Assemblage et sécrétion des chylomicrons

Dans l'entérocyte, les acides gras libres et les monoacylglycérides sont utilisés pour synthétiser des triglycérides, des phospholipides et des esters de cholestérol (Figure 9) (508 509 513 515-517). La majorité des triglycérides formés dans les entérocytes sont reconditionnés dans de grandes lipoprotéines flottantes, appelées chylomicrons, et sécrétés par la surface basolatérale de la cellule (Figure 9). Ces particules jouent un rôle central dans le transport des triglycérides et des vitamines liposolubles vers le reste du corps (518).

L'assemblage de la particule de chylomicrons à partir de précurseurs est un processus complexe. Chaque particule contient une seule copie de l'apolipoprotéine B48 et l'assemblage commence par la synthèse de cette protéine dans le réticulum endoplasmique rugueux. L'apolipoprotéine B48 est une forme tronquée de l'apolipoprotéine B100 qui est formée par édition post-transcriptionnelle (519 520). Au fur et à mesure que l'apolipoprotéine B48 est synthétisée et transloquée à travers la membrane du réticulum endoplasmique, elle devient lipidée pour former un chylomicron primordial dense et riche en phospholipides dans la lumière du réticulum endoplasmique (Figure 9). Le chylomicron primordial contient de l'apolipoprotéine B48, des phospholipides, du cholestérol et des quantités mineures d'ester de cholestéryle et de triglycéride (513 521 522). Le processus d'assemblage nécessite une protéine de transfert des triglycérides microsomale (523). En l'absence de lipides suffisants, ou si la fonction microsomale de la protéine de transfert des triglycérides est altérée, l'apolipoprotéine B48 est ubiquitinée et ciblée pour la dégradation du protéasome (524). L'importance de cette étape d'initiation de l'assemblage est observée chez les patients présentant un défaut du gène MTP conduisant à la maladie récessive rare abetalipoprotéinémie. Les personnes atteintes d'abêtalipoprotéinémie ont des taux d'apoB ou de cholestérol total presque indétectables dans leur plasma en raison de l'incapacité d'assembler les lipoprotéines contenant l'apoB dans leurs entérocytes ou leurs hépatocytes. Parmi les séquelles subies par ces patients figurent une accumulation de triglycérides dans leurs intestins et leur foie et une carence en vitamines liposolubles dans leur plasma (525 526). S'ils ne sont pas traités, ces patients développent de graves problèmes neurologiques principalement liés à une carence en vitamines E et A.

Après la formation, la particule primordiale initiale se dilate par l'acquisition de triglycérides et d'esters de cholestéryle supplémentaires (Figure 9). Le lipide supplémentaire est acquis par fusion avec des particules ne contenant pas d'apolipoprotéine B48 qui sont riches en triglycérides et en ester de cholestéryle. L'origine exacte de ces particules lipidiques et leur composition précise sont actuellement activement débattues (504 505 513 527 528), mais la fusion du chylomicron primordial avec les particules sans apolipoprotéine B48 se produit dans le réticulum endoplasmique (513). La particule résultante est un préchylomicron (Figure 9). En plus de l'apolipoprotéine B48, la surface du préchylomicron peut contenir plusieurs copies d'autres petites apoprotéines échangeables, notamment l'apolipoprotéine A-IV et l'apolipoprotéine C-III. Les apoprotéines échangeables sont des protéines solubles qui n'adhèrent pas aussi étroitement à la surface des particules et peuvent donc être échangées entre les particules lipidiques.

Les préchylomicrons sont transportés hors du réticulum endoplasmique et livrés à l'appareil de Golgi pour un traitement ultérieur (Figure 9). Le transport se fait dans des vésicules spécialisées qui peuvent s'adapter à leur grande taille. Les vésicules uniques contiennent un certain nombre de protéines spécifiques nécessaires au processus de transport et d'amarrage. Vesicle-associated membrane protein-7, coatomer protein II et Sar1b, un petit composant GTPase de la machinerie d'assemblage des vésicules coatomer protein II (Figure 9) font partie des protéines spécialisées sur les vésicules de transport des lipides (505 529-531). La maturation de la particule dans l'appareil de Golgi comprend une glycosylation supplémentaire de l'apolipoprotéine B48 et l'ajout d'apolipoprotéine A-I à la surface (505,532,533). Après traitement, le chylomicron mature est emballé dans des vésicules sécrétoires dérivées de Golgi et transporté vers la surface basolatérale et exocytosé dans la lymphe (Figure 9) (527 534 535).

L'assemblage des chylomicrons dans les entérocytes est un processus complexe nécessitant un certain nombre d'étapes coordonnées et de facteurs spécifiques pour fonctionner à l'unisson. Un échec dans l'un d'entre eux peut conduire à des états pathologiques liés aux lipides. Par exemple, des mutations du gène SAR1B conduisent à la rétention de préchylomicrons dans les structures membranaires des entérocytes (529). La maladie est marquée dans l'enfance par une diminution du taux de cholestérol sanguin, une accumulation de lipides dans les entérocytes, une malabsorption chronique des graisses avec stéatorrhée et des carences en vitamines liposolubles et en acides gras essentiels.

Cholestérol Chylomicron

Bien que les chylomicrons soient riches en triglycérides, ils transportent également des quantités substantielles de cholestérol (536,537). Le cholestérol contenu dans les chylomicrons provient du pool général du cholestérol des entérocytes. Les entérocytes acquièrent le cholestérol par absorption à la surface luminale, acquisition à partir de lipoprotéines à la surface latérale basale et par synthèse de novo au sein de l'entérocyte. La protéine Niemann-Pick C1-Like 1 est un composant clé de la machinerie d'acquisition luminale (Figure 9) (538), tandis que le récepteur des lipoprotéines de basse densité semble être un médiateur majeur de l'acquisition du cholestérol à la surface basolatérale (539 540). L'incorporation de cholestérol dans les chylomicrons contribue aux taux circulants de cholestérol, et l'augmentation de la synthèse intestinale des chylomicrons due à l'augmentation des lipides alimentaires contribue au risque cardiovasculaire et à l'athérosclérose, bien que par des mécanismes complexes (516 541 542).

Métabolisme des lipides intestinaux non chylomicrons

Les entérocytes peuvent également réguler les lipides circulants par d'autres moyens que la sécrétion des chylomicrons. En présence d'un excès d'acides gras ou de cholestérol, l'entérocyte peut stocker un excès de lipides sous leurs formes estérifiées (respectivement triglycérides et esters de cholestérol) dans des gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (543-545).Les lipides neutres des gouttelettes peuvent ensuite être mobilisés par hydrolyse selon les besoins de la cellule. Les acides gras libres libérés des gouttelettes de stockage peuvent être incorporés dans la voie de production des chylomicrons pour faire partie des chylomicrons sécrétés.

Enfin, l'intestin régule également les taux de cholestérol circulant en absorbant l'excès de cholestérol circulant et en l'excrétant dans la lumière intestinale pour être éliminé dans les selles. Ce processus est connu sous le nom d'excrétion trans-intestinale du cholestérol. Il agit en complément de la sécrétion biliaire hépatique et peut représenter jusqu'à 30 % de l'excrétion de stérol neutre (546). L'excrétion trans-intestinale du cholestérol se produit à la surface luminale des entérocytes par un processus qui utilise principalement la paire de transporteurs de cassettes de liaison à l'ATP ABCG5/G8 (figure 9) mais peut également utiliser d'autres voies (547).

Sommaire

Il est clair que le traitement des lipides intestinaux est un contributeur clé aux niveaux circulants de triglycérides et de cholestérol. Les facteurs alimentaires, génétiques et métaboliques qui perturbent le processus du métabolisme lipidique des entérocytes peuvent potentiellement altérer l'homéostasie lipidique et provoquer des états pathologiques.


Enquêter sur l'athérosclérose avec des lipoprotéines de basse densité modifiées

Les altérations du métabolisme des lipides sont connues pour être le défaut à la racine de l'athérosclérose. L'athérosclérose est une forme d'artériosclérose dans laquelle l'épaississement et la perte d'élasticité des parois des artères sont causés par l'accumulation de plaques graisseuses - composées principalement de cholestérol et d'autres lipides dans les vaisseaux sanguins - qui inhibent ou bloquent le flux sanguin. Le mécanisme exact de l'athérogenèse fait encore l'objet de nombreux débats, mais des niveaux élevés de lipoprotéines de basse densité (LDL) sont considérés comme un facteur de risque d'athérosclérose, et des niveaux élevés de lipoprotéines de haute densité (HDL) semblent offrir une certaine protection.

En tant que l'un des principaux complexes lipides-protéines dans le sang, les LDL sont responsables du transport et de l'administration des lipides, y compris le cholestérol, les triglycérides et les phospholipides, dans tout le corps via une endocytose médiée par des récepteurs. Les LDL modifiées ne se lient plus au récepteur LDL et sont généralement éliminées par les récepteurs «scavenger» sur les macrophages et les cellules endothéliales. Des conjugués fluorescents de LDL (natifs et modifiés) peuvent être utilisés pour étudier ces voies en utilisant la microscopie à fluorescence, l'analyse à haut contenu et la cytométrie en flux. Thermo Fisher Scientific propose des LDL non modifiées et leurs conjugués fluorescents pour l'étude de l'endocytose médiée par les récepteurs LDL et d'autres aspects du métabolisme des lipides. Ici, nous nous concentrons sur deux ensembles de LDL modifiées et marquées par fluorescence - les LDL oxydées et les LDL acétylées - pour étudier les voies endocytiques médiées par les récepteurs charognards.

Les LDL oxydés imitent les processus naturels

L'oxydation du LDL est un processus naturel dans le corps, que l'on pense être causé par la présence de radicaux libres. Les cellules endothéliales puis les macrophages sont mis en action pour débarrasser l'organisme des LDL oxydées (OxLDL) qui déclenchent des réponses inflammatoires et immunogènes. Les sondes OxLDL non marquées et fluorescentes sont donc des outils importants pour l'étude de l'endocytose médiée par les récepteurs charognards par les macrophages et les cellules endothéliales (Figure 1), ainsi que la formation de cellules spumeuses dérivées de macrophages, une caractéristique de l'athérogenèse précoce [1].

Notre sonde OxLDL non marquée est générée en oxydant les lipides de surface de LDL natives ou non modifiées à l'aide d'une incubation au sulfate de cuivre. Au cours de cette incubation, l'oxydation est surveillée en continu par mesure de la densité optique à 234 nm [2,3]. L'incubation est terminée approximativement à mi-parcours pendant la phase de peroxydation lipidique (Figure 2A). Ce niveau d'oxydation représente des valeurs de TBAR (réactif à l'acide thiobarbiturique) d'environ 25 à 35 nmol/mg de protéine. La mobilité électrophorétique de ce type de préparation d'OxLDL est au moins deux fois supérieure à celle des LDL natives (Figure 2B). Cette procédure d'oxydation très contrôlée garantit que principalement les lipides à la surface des LDL sont oxydés, avec une oxydation très limitée de l'apolipoprotéine de surface, afin d'induire une réponse inflammatoire physiologiquement pertinente des cellules.

Une fois le bon niveau d'oxydation atteint et testé, l'OxLDL marqué par fluorescence est généré par marquage avec l'intercalateur à membrane lipidique DiI (1,1´-dioctadécyl-3,3,3´,3´-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate ou DiIC18(3)). DiI est un colorant lipophile hautement fluorescent qui peut diffuser dans la partie hydrophobe du complexe LDL sans affecter la liaison spécifique aux LDL de l'apolipoprotéine. Le degré de marquage dans la sonde DiI-OxLDL a été optimisé pour produire une sensibilité supérieure dans les applications d'imagerie par fluorescence (Figure 1), ainsi qu'en cytométrie de flux et en analyses d'imagerie à haut contenu. Chaque lot est analysé pour le degré de marquage et testé fonctionnellement avec des cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine (BPAEC) pour s'assurer que la sonde oxydée est reconnue par les récepteurs charognards (Figures 1 et 3). Ces tests de qualité approfondis permettent d'obtenir des résultats similaires d'un lot à l'autre, d'expérience en expérimentation.

Figure 1. Endocytose de DiI OxLDL par les BPAEC. Les BPAEC (cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits recouvertes de poly-D-lysine pendant 24 heures, puis privées de sérum pendant la nuit dans Gibco FluoroBrite DMEM plus 0,3 % de BSA. Le jour de l'expérience, 10 µg/mL de DiI OxLDL ont été ajoutés au milieu et les cellules ont été incubées pendant 3 h. Après cette incubation, les cellules ont été rincées avec du tampon de dosage plus 0,3 % de BSA et fixées dans 4 % de formaldéhyde. Après coloration nucléaire avec le réactif Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes, les images ont été acquises sur la plate-forme de criblage à haut contenu Thermo Scientific CellInsight CX5.

Figure 2. Suivi en temps réel de la formation d'OxLDL.(UNE) La génération d'OxLDL est surveillée en continu en mesurant la densité optique à 234 nm (DO234) avec un spectrophotomètre Thermo Scientific NanoDrop pendant l'incubation de LDL native avec du sulfate de cuivre. L'incubation est terminée pendant la phase de peroxydation lipidique (indiquée par la flèche) et le lot OxLDL est collecté pour un traitement ultérieur. (B) La mobilité électrophorétique des LDL oxydées (OxLDL) est au moins deux fois supérieure à la mobilité des LDL natives.

Figure 3. Spécificité de DiI OxLDL pour le récepteur OxLDL, telle que déterminée par inhibition compétitive. Les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine (BPAEC) ont été étalées dans des plaques à 96 puits recouvertes de poly-D-lysine pendant 24 heures, puis privées de sérum pendant la nuit dans du Gibco FluoroBrite DMEM plus 0,3 % de BSA. Le jour de l'expérience, les cellules ont été prétraitées avec une série de dilutions d'OxLDL non marqué (de 0 à 500 g/mL) pendant 30 min à 37°C, marqué avec 10 g/mL DiI OxLDL pendant 3 h dans un incubateur de culture cellulaire , rincé avec du tampon de dosage plus 0,3 % de BSA et fixé dans 4 % de formaldéhyde. Après coloration nucléaire avec le colorant Hoechst, les images ont été acquises et dénombrées sur la plate-forme de criblage à haut contenu Thermo Scientific CellInsight CX5. L'analyse des données a été effectuée avec le module d'internalisation et de comptage de taches dans le logiciel d'analyse cellulaire Thermo Scientific HCS Studio pour quantifier le nombre de taches positives par cellule. Cinq cents cellules ont été échantillonnées par puits, avec n = 3 puits

LDL acétylés pour des récepteurs charognards spécifiques

Les voies de piégeage dans les macrophages et les cellules endothéliales, ainsi que la formation de cellules spumeuses, ont été traditionnellement étudiées à l'aide de LDL acétylées (AcLDL). Contrairement à l'oxydation des LDL, qui implique principalement la modification des lipides de surface, l'acétylation des LDL altère l'unique copie de l'apolipoprotéine B100 à la surface des LDL. Lorsque les complexes AcLDL s'accumulent dans les macrophages et les cellules endothéliales, les cellules prennent une apparence similaire à celle des cellules spumeuses trouvées dans les plaques d'athérosclérose. Cependant, Wang et ses collègues ont signalé que les LDL, OxLDL et AcLDL natifs sont chacun acheminés vers différents endosomes et s'accumulent dans des compartiments lysosomal distincts, indiquant différentes voies endocytiques [4].

Thermo Fisher Scientific propose plusieurs dérivés d'AcLDL fluorescents qui peuvent être utilisés sur une variété de plates-formes basées sur la fluorescence. DiI AcLDL est couramment utilisé pour identifier les cellules endothéliales et microgliales dans les cultures cellulaires primaires (Figure 4). Les dérivés Invitrogen Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 et BODIPY FL AcLDL peuvent être préférés dans certaines applications car les colorants sont liés de manière covalente à la partie apolipoprotéine modifiée du complexe LDL et ne sont donc pas extraits lors des manipulations ultérieures des cellules. Compte tenu de la riche histoire de publication pour OxLDL et AcLDL, les chercheurs peuvent choisir la modification appropriée pour leurs études particulières et leur configuration expérimentale.

Figure 4. Cellules microgliales dans une cryosection d'hippocampe de rat marquée avec DiI AcLDL. Les cellules microgliales d'une cryosection d'hippocampe de rat ont été marquées avec du DiI AcLDL rouge-orange-fluorescent et contre-colorées à l'aide d'un colorant d'acide nucléique DAPI bleu-fluorescent.

Gouttelettes lipidiques dans les alvéoles de mousse

L'étude des cellules spumeuses joue un rôle important dans la dissection du mécanisme de l'athérosclérose et le développement de la prochaine génération de médicaments qui réduisent le risque de maladie coronarienne. Les gouttelettes lipidiques qui s'accumulent dans ces cellules spumeuses sont généralement détectées à l'aide de colorants lipidiques neutres. Avec une affinité extrêmement élevée pour les gouttelettes lipidiques neutres, les colorations lipidiques neutres Invitrogen HCS LipidTOX ont été développées pour détecter les gouttelettes ou globules lipidiques intracellulaires et caractériser les effets des médicaments et autres composés sur le métabolisme des lipides dans les lignées cellulaires de mammifères. Ces réactifs sont ajoutés après fixation des cellules (Figure 5), les rendant compatibles avec les protocoles d'immunocytochimie, et ils ne nécessitent pas d'étapes de lavage ultérieures après incubation avec l'échantillon. De plus, ils sont plus sensibles et photostables que les colorants lipidiques neutres traditionnels tels que le colorant Invitrogen BODIPY 493/503 ou le Nile Red, et sont disponibles avec une émission de fluorescence verte, rouge et rouge foncé.

Figure 5. Accumulation de gouttelettes lipidiques dans des cellules RAW traitées avec OxLDL. Les cellules RAW cultivées sur des boîtes MatTek ont ​​été privées de sérum pendant une nuit et traitées avec 50 ug/mL d'OxLDL non marqué pendant 24 heures. Le milieu sérique a ensuite été rajouté aux cellules pendant une nuit, et les cellules ont été fixées dans du formaldéhyde à 4 % et stockées à 4°C. Le jour de l'expérience, les cellules ont été rincées dans du PBS, colorées avec le réactif Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes et le colorant lipidique neutre vert Invitrogen HCS LipidTox pendant 30 min, et rincées à nouveau dans du PBS. Les images ont été collectées sur un système d'imagerie Invitrogen EVOS FL Auto 2 à un grossissement de 10x.

En savoir plus sur nos sondes LDL

Thermo Fisher Scientific propose le portefeuille le plus complet de LDL, OxLDL et AcLDL natifs non marqués et marqués par fluorescence pour l'étude du métabolisme des lipides par imagerie par fluorescence, analyse à haut contenu et cytométrie en flux. Tous nos produits LDL sont dérivés de LDL humains isolés à partir de plasma humain, provenant d'une banque de sang et testés pour le VIH, l'hépatite B et C, la syphilis et d'autres maladies infectieuses.


Propriétés anti-inflammatoires de l'OxLDL

Fait intéressant, Lara-Guzman et al. en 2018 a démontré pour la première fois que l'interaction des macrophages THP-1 et des oxLDL pouvait induire huit PG et huit IsoP, dont deux, PGE1 et 17-trans-PGF3α ont des propriétés anti-inflammatoires. De plus, leurs niveaux n'étaient pas augmentés par le traitement des LDL mais étaient significativement induits par les oxLDL (Moore et Tabas, 2011). Cette réponse anti-inflammatoire indique que les cellules spumeuses expriment des voies pour réduire la cytotoxicité et l'inflammation déclenchées par la charge en cholestérol dans les macrophages (Lara-Guzmán et al., 2018). Un autre exemple de conséquences anti-inflammatoires de l'action des oxLDL est l'interaction des oxLDL avec les cellules B passant par liaison au récepteur CD36. Un autre exemple de conséquences anti-inflammatoires de l'action des oxLDL est l'interaction des oxLDL avec les cellules B passant par liaison au récepteur CD36. Cela conduit à la production d'anti-oxLDL, qui a une activité anti-inflammatoire (Rhoads et Major, 2018). Ceci a été décrit pour la première fois en 1999 par le groupe Witztum (Hörkkö et al., 1999).


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Réactifs

Les LDL préparées à partir de plasma humain ont été modifiées par oxydation comme décrit précédemment en utilisant un système myéloperoxydase, glucose oxydase, nitrite. 34 L'insuline bovine provenait de Sigma et l'adiponectine humaine recombinante des systèmes R&D. L'anticorps polyclonal dirigé contre le CD36 humain provenait de Cayman Chemical. IgG monoclonale anti-CD36 humaine, IgG anti-CD36 conjuguée à la phycoérythrine et anticorps contre SR-A, actine et ??-tubuline provenait de Santa-Cruz Biotechnology. Les anticorps contre ABCA-1 et EMR1 (F4/80) ont été achetés auprès d'Abcam. Le cholestérol marqué au C14 a été acheté chez American Radiolabeled Chemicals. La protéine ApoA1 a été préparée comme décrit précédemment. 35 kits ELISA Quantikine Colorimetric Sandwich pour l'IL-6 et la protéine chimiotactique des monocytes-1 (MCP-1) provenaient des systèmes R&D.

Cellules

Les monocytes humains ont été isolés du sang périphérique par centrifugation Ficoll-Hypaque et ont été cultivés dans du RPMI contenant du sérum AB humain (10 %) pendant 7 jours pour permettre la différenciation des macrophages. La différenciation des monocytes en macrophages a été confirmée par cytométrie en flux avec l'anticorps anti-EMR1(F4/80). Le sang périphérique humain a été donné par des volontaires sains non diabétiques. Chaque échantillon a été examiné et l'absence d'infection par l'hépatite B, l'hépatite C et le VIH a été confirmée.

Analyses d'immunoempreinte

Macrophages humains incubés avec différentes concentrations d'insuline (300 pM, 2 nM, 100 nM), d'adiponectine (2 ??g/ml), oxLDL (50 ??g/ml), LY294002 (10 ??M) ou de la wartmannine (100 nM) pendant 16 h ont été lysées avec du tampon contenant 1 % de triton X-100. Les lysats ont été séparés par SDS-PAGE, transférés sur des membranes PVDF (Millipore) et sondés avec des anticorps contre CD36, ABCA-1, SR-A, actine ou ??-tubuline. Les intensités de bande ont été quantifiées par ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), le logiciel Image-Pro Plus (Media Cybernetics) et Gel-Pro Analyzer (MediaCybernetics).

Cytométrie en flux

Les macrophages humains étalés sur des lamelles de verre recouvertes de sérum ont été incubés avec de l'insuline, de l'adiponectine ou de l'oxLDL pendant 16 h, puis fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Les macrophages traités ont été doucement grattés et collectés dans des microtubes puis colorés avec des IgG anti-CD36 ou anti-SR-A conjugués au PE avant de mesurer l'intensité de fluorescence par cytométrie en flux avec un Becton-Dickinson FACScan. Les données ont été analysées par le logiciel FlowJo (Tree Star). Pour évaluer l'absorption des oxLDL, les oxLDL ont été marqués avec la sonde fluorescente 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanide perchlorate (dil Molecular Probes) comme décrit précédemment. 36 Les macrophages pré-incubés comme ci-dessus avec de l'insuline ou de l'adiponectine pendant 16 h ont ensuite été exposés à diI-oxLDL (10 ??g/ml) pendant 20 min puis fixé avec du paraformaldéhyde 4% et analysé par microscopie confocale laser. L'absorption de fluorescence a été quantifiée à l'aide du logiciel Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

RT-PCR

L'ARN total a été isolé par le réactif Tri à partir de macrophages humains traités avec de l'insuline, de l'adiponectine ou de l'oxLDL pendant 16 h et a été converti en ADNc par transcriptase inverse (Roche) avec une amorce oligo-dT. Les ADNc ont ensuite été utilisés pour la PCR avec les amorces 5′- IndexTerm CAG AGG CTG ACA ACT TCA CAG-3′, 5′- IndexTerm AGG GTA CGG AAC CAA ACT CAA-3′ pour CD36 ou les amorces 5′- IndexTerm AAC TCT ACA TCT CCC TT CCC G -3′, 5′- IndexTerm TGT CCT CAT ACC AGT TGA GAG AC-3′ pour ABCA-1. La PCR pour l'actine a été utilisée comme référence avec les amorces 5'- IndexTerm GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3', 5'- IndexTerm CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'. L'amplification PCR était de 22 cycles de 94°C pendant 1 min, 56°C pendant 1 min et 72°C pendant 2 min pour CD36, 28 cycles à la même température pour ABCA-1 et 17 cycles pour l'actine.

Dosage d'efflux de cholestérol

Les macrophages étalés sur des boîtes à 24 puits ont été traités avec de l'insuline (2 nM, 100 nM) ou de l'adiponectine (2 ??g/ml) avec ou sans wartmannine (100 nM) pendant 16 h. OxLDL (50 ??g/ml) a été incubé avec du cholestérol marqué au C 14 (0,2 ??Ci/ml) à 37°C pendant 30 min puis chargée sur les macrophages. Après 6 h, les cellules marquées au C14-cholestérol ont été lavées avec du PBS et incubées avec du milieu RPMI 1640 pendant 16 h. Le cholestérol en C14 libéré des cellules dans le milieu a été mesuré à l'aide d'un compteur à scintillation. Le cholestérol cellulaire a été extrait par hexane:isopropanol (3:2 v/v), et la radioactivité C14 dans la solution d'extrait a été mesurée par compteur à scintillation. Le pourcentage d'efflux a été calculé comme étant la radioactivité C 14 dans le milieu/(radioactivité C 14 dans le milieu + radioactivité C 14 dans les cellules) × 100 %.

Mesure du cholestérol intracellulaire

Les macrophages humains étalés dans une boîte à 6 puits ont été incubés avec de l'insuline (2 nM, 100 nM) ou de l'adiponectine (2 ??g/ml) avec ou sans LY294002 (10 ??M). Les cellules ont été traitées avec de l'oxLDL pendant 16 h et lysées par du tampon contenant 0,5 % de triton X-100 sur de la glace. Les lysats ont été centrifugés à 17 000 g pendant 30 min à 4°C et le surnageant a été collecté pour la mesure du cholestérol. Le cholestérol a été mesuré en utilisant le kit de dosage du cholestérol Cayman (Cayman Chemical). Brièvement, les lysats cellulaires ont été mélangés avec un tampon de dosage contenant de la cholestérol estérase, de la cholestérol oxydase, de la HRP et de l'ADHP (10-acétyl-3,7-dihydroxyphénoxazine). Le produit fluorescent résorufine généré par la réaction entre l'ADHP et le peroxyde d'hydrogène provenant de l'oxydation du cholestérol a pu être mesuré par un lecteur de plaque à fluorescence en utilisant des longueurs d'onde d'excitation de 530 à 580 nm et des longueurs d'onde d'émission de 585 à 595 nm. Nous avons également mesuré le cholestérol total et le cholestérol libre des macrophages en utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Les macrophages humains ont été incubés avec de l'insuline (2 nM, 100 nM) ou de l'adiponectine (2 ??g/ml) avec ou sans wartmannine (200 nM) puis traité avec oxLDL (50 ??g/ml) pendant 16 h. Ces cellules ont été remises en suspension avec 900 ??l eau et 100 ??l de 1 ??g/ml de coprosternol dans l'isopropanol et appliqué à la GC-MS comme décrit précédemment. 37 Nous avons enregistré les spectres de masse ionique totale des dérivés triméthylsilyle, extrait les chromatogrammes GC et calculé la teneur en cholestérol dans chaque échantillon. Le cholestérol intracellulaire de chaque échantillon a été normalisé par la concentration en protéines de chaque échantillon.


Enquêter sur l'athérosclérose avec des lipoprotéines de basse densité modifiées

Les altérations du métabolisme des lipides sont connues pour être le défaut à la racine de l'athérosclérose. L'athérosclérose est une forme d'artériosclérose dans laquelle l'épaississement et la perte d'élasticité des parois des artères sont causés par l'accumulation de plaques graisseuses - composées principalement de cholestérol et d'autres lipides dans les vaisseaux sanguins - qui inhibent ou bloquent le flux sanguin.Le mécanisme exact de l'athérogenèse fait encore l'objet de nombreux débats, mais des niveaux élevés de lipoprotéines de basse densité (LDL) sont considérés comme un facteur de risque d'athérosclérose, et des niveaux élevés de lipoprotéines de haute densité (HDL) semblent offrir une certaine protection.

En tant que l'un des principaux complexes lipides-protéines dans le sang, les LDL sont responsables du transport et de l'administration des lipides, y compris le cholestérol, les triglycérides et les phospholipides, dans tout le corps via une endocytose médiée par des récepteurs. Les LDL modifiées ne se lient plus au récepteur LDL et sont généralement éliminées par les récepteurs «scavenger» sur les macrophages et les cellules endothéliales. Des conjugués fluorescents de LDL (natifs et modifiés) peuvent être utilisés pour étudier ces voies en utilisant la microscopie à fluorescence, l'analyse à haut contenu et la cytométrie en flux. Thermo Fisher Scientific propose des LDL non modifiées et leurs conjugués fluorescents pour l'étude de l'endocytose médiée par les récepteurs LDL et d'autres aspects du métabolisme des lipides. Ici, nous nous concentrons sur deux ensembles de LDL modifiées et marquées par fluorescence - les LDL oxydées et les LDL acétylées - pour étudier les voies endocytiques médiées par les récepteurs charognards.

Les LDL oxydés imitent les processus naturels

L'oxydation du LDL est un processus naturel dans le corps, que l'on pense être causé par la présence de radicaux libres. Les cellules endothéliales puis les macrophages sont mis en action pour débarrasser l'organisme des LDL oxydées (OxLDL) qui déclenchent des réponses inflammatoires et immunogènes. Les sondes OxLDL non marquées et fluorescentes sont donc des outils importants pour l'étude de l'endocytose médiée par les récepteurs charognards par les macrophages et les cellules endothéliales (Figure 1), ainsi que la formation de cellules spumeuses dérivées de macrophages, une caractéristique de l'athérogenèse précoce [1].

Notre sonde OxLDL non marquée est générée en oxydant les lipides de surface de LDL natives ou non modifiées à l'aide d'une incubation au sulfate de cuivre. Au cours de cette incubation, l'oxydation est surveillée en continu par mesure de la densité optique à 234 nm [2,3]. L'incubation est terminée approximativement à mi-parcours pendant la phase de peroxydation lipidique (Figure 2A). Ce niveau d'oxydation représente des valeurs de TBAR (réactif à l'acide thiobarbiturique) d'environ 25 à 35 nmol/mg de protéine. La mobilité électrophorétique de ce type de préparation d'OxLDL est au moins deux fois supérieure à celle des LDL natives (Figure 2B). Cette procédure d'oxydation très contrôlée garantit que principalement les lipides à la surface des LDL sont oxydés, avec une oxydation très limitée de l'apolipoprotéine de surface, afin d'induire une réponse inflammatoire physiologiquement pertinente des cellules.

Une fois le bon niveau d'oxydation atteint et testé, l'OxLDL marqué par fluorescence est généré par marquage avec l'intercalateur à membrane lipidique DiI (1,1´-dioctadécyl-3,3,3´,3´-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate ou DiIC18(3)). DiI est un colorant lipophile hautement fluorescent qui peut diffuser dans la partie hydrophobe du complexe LDL sans affecter la liaison spécifique aux LDL de l'apolipoprotéine. Le degré de marquage dans la sonde DiI-OxLDL a été optimisé pour produire une sensibilité supérieure dans les applications d'imagerie par fluorescence (Figure 1), ainsi qu'en cytométrie de flux et en analyses d'imagerie à haut contenu. Chaque lot est analysé pour le degré de marquage et testé fonctionnellement avec des cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine (BPAEC) pour s'assurer que la sonde oxydée est reconnue par les récepteurs charognards (Figures 1 et 3). Ces tests de qualité approfondis permettent d'obtenir des résultats similaires d'un lot à l'autre, d'expérience en expérimentation.

Figure 1. Endocytose de DiI OxLDL par les BPAEC. Les BPAEC (cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits recouvertes de poly-D-lysine pendant 24 heures, puis privées de sérum pendant la nuit dans Gibco FluoroBrite DMEM plus 0,3 % de BSA. Le jour de l'expérience, 10 µg/mL de DiI OxLDL ont été ajoutés au milieu et les cellules ont été incubées pendant 3 h. Après cette incubation, les cellules ont été rincées avec du tampon de dosage plus 0,3 % de BSA et fixées dans 4 % de formaldéhyde. Après coloration nucléaire avec le réactif Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes, les images ont été acquises sur la plate-forme de criblage à haut contenu Thermo Scientific CellInsight CX5.

Figure 2. Suivi en temps réel de la formation d'OxLDL.(UNE) La génération d'OxLDL est surveillée en continu en mesurant la densité optique à 234 nm (DO234) avec un spectrophotomètre Thermo Scientific NanoDrop pendant l'incubation de LDL native avec du sulfate de cuivre. L'incubation est terminée pendant la phase de peroxydation lipidique (indiquée par la flèche) et le lot OxLDL est collecté pour un traitement ultérieur. (B) La mobilité électrophorétique des LDL oxydées (OxLDL) est au moins deux fois supérieure à la mobilité des LDL natives.

Figure 3. Spécificité de DiI OxLDL pour le récepteur OxLDL, telle que déterminée par inhibition compétitive. Les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine (BPAEC) ont été étalées dans des plaques à 96 puits recouvertes de poly-D-lysine pendant 24 heures, puis privées de sérum pendant la nuit dans du Gibco FluoroBrite DMEM plus 0,3 % de BSA. Le jour de l'expérience, les cellules ont été prétraitées avec une série de dilutions d'OxLDL non marqué (de 0 à 500 g/mL) pendant 30 min à 37°C, marqué avec 10 g/mL DiI OxLDL pendant 3 h dans un incubateur de culture cellulaire , rincé avec du tampon de dosage plus 0,3 % de BSA et fixé dans 4 % de formaldéhyde. Après coloration nucléaire avec le colorant Hoechst, les images ont été acquises et dénombrées sur la plate-forme de criblage à haut contenu Thermo Scientific CellInsight CX5. L'analyse des données a été effectuée avec le module d'internalisation et de comptage de taches dans le logiciel d'analyse cellulaire Thermo Scientific HCS Studio pour quantifier le nombre de taches positives par cellule. Cinq cents cellules ont été échantillonnées par puits, avec n = 3 puits

LDL acétylés pour des récepteurs charognards spécifiques

Les voies de piégeage dans les macrophages et les cellules endothéliales, ainsi que la formation de cellules spumeuses, ont été traditionnellement étudiées à l'aide de LDL acétylées (AcLDL). Contrairement à l'oxydation des LDL, qui implique principalement la modification des lipides de surface, l'acétylation des LDL altère l'unique copie de l'apolipoprotéine B100 à la surface des LDL. Lorsque les complexes AcLDL s'accumulent dans les macrophages et les cellules endothéliales, les cellules prennent une apparence similaire à celle des cellules spumeuses trouvées dans les plaques d'athérosclérose. Cependant, Wang et ses collègues ont signalé que les LDL, OxLDL et AcLDL natifs sont chacun acheminés vers différents endosomes et s'accumulent dans des compartiments lysosomal distincts, indiquant différentes voies endocytiques [4].

Thermo Fisher Scientific propose plusieurs dérivés d'AcLDL fluorescents qui peuvent être utilisés sur une variété de plates-formes basées sur la fluorescence. DiI AcLDL est couramment utilisé pour identifier les cellules endothéliales et microgliales dans les cultures cellulaires primaires (Figure 4). Les dérivés Invitrogen Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 et BODIPY FL AcLDL peuvent être préférés dans certaines applications car les colorants sont liés de manière covalente à la partie apolipoprotéine modifiée du complexe LDL et ne sont donc pas extraits lors des manipulations ultérieures des cellules. Compte tenu de la riche histoire de publication pour OxLDL et AcLDL, les chercheurs peuvent choisir la modification appropriée pour leurs études particulières et leur configuration expérimentale.

Figure 4. Cellules microgliales dans une cryosection d'hippocampe de rat marquée avec DiI AcLDL. Les cellules microgliales d'une cryosection d'hippocampe de rat ont été marquées avec du DiI AcLDL rouge-orange-fluorescent et contre-colorées à l'aide d'un colorant d'acide nucléique DAPI bleu-fluorescent.

Gouttelettes lipidiques dans les alvéoles de mousse

L'étude des cellules spumeuses joue un rôle important dans la dissection du mécanisme de l'athérosclérose et le développement de la prochaine génération de médicaments qui réduisent le risque de maladie coronarienne. Les gouttelettes lipidiques qui s'accumulent dans ces cellules spumeuses sont généralement détectées à l'aide de colorants lipidiques neutres. Avec une affinité extrêmement élevée pour les gouttelettes lipidiques neutres, les colorations lipidiques neutres Invitrogen HCS LipidTOX ont été développées pour détecter les gouttelettes ou globules lipidiques intracellulaires et caractériser les effets des médicaments et autres composés sur le métabolisme des lipides dans les lignées cellulaires de mammifères. Ces réactifs sont ajoutés après fixation des cellules (Figure 5), les rendant compatibles avec les protocoles d'immunocytochimie, et ils ne nécessitent pas d'étapes de lavage ultérieures après incubation avec l'échantillon. De plus, ils sont plus sensibles et photostables que les colorants lipidiques neutres traditionnels tels que le colorant Invitrogen BODIPY 493/503 ou le Nile Red, et sont disponibles avec une émission de fluorescence verte, rouge et rouge foncé.

Figure 5. Accumulation de gouttelettes lipidiques dans des cellules RAW traitées avec OxLDL. Les cellules RAW cultivées sur des boîtes MatTek ont ​​été privées de sérum pendant une nuit et traitées avec 50 ug/mL d'OxLDL non marqué pendant 24 heures. Le milieu sérique a ensuite été rajouté aux cellules pendant une nuit, et les cellules ont été fixées dans du formaldéhyde à 4 % et stockées à 4°C. Le jour de l'expérience, les cellules ont été rincées dans du PBS, colorées avec le réactif Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes et le colorant lipidique neutre vert Invitrogen HCS LipidTox pendant 30 min, et rincées à nouveau dans du PBS. Les images ont été collectées sur un système d'imagerie Invitrogen EVOS FL Auto 2 à un grossissement de 10x.

En savoir plus sur nos sondes LDL

Thermo Fisher Scientific propose le portefeuille le plus complet de LDL, OxLDL et AcLDL natifs non marqués et marqués par fluorescence pour l'étude du métabolisme des lipides par imagerie par fluorescence, analyse à haut contenu et cytométrie en flux. Tous nos produits LDL sont dérivés de LDL humains isolés à partir de plasma humain, provenant d'une banque de sang et testés pour le VIH, l'hépatite B et C, la syphilis et d'autres maladies infectieuses.


Voir la vidéo: Recommendation: Keep Your LDL Cholesterol Below 100 mgdL (Septembre 2022).


Commentaires:

  1. Tezuru

    C'est difficile à dire.

  2. Goltill

    Oui, la réponse est presque la même que la mienne.

  3. Colbert

    J'y ai pensé et j'ai supprimé cette phrase



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