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Comment éviter les taches au microscope ?

Comment éviter les taches au microscope ?


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Ma tâche consiste à prendre des photographies de spores de champignons au microscope à x100 en utilisant une immersion dans l'huile.

Mon problème est que je reçois tous ces petits blobs. Comment éviter les blobs ?

Donc, on m'a demandé de mettre d'abord les spores sur la lame de verre, puis d'y ajouter une petite goutte d'eau (j'utilise une seringue pour avoir un contrôle exact sur la gouttelette), puis de mettre la lamelle dessus. Ensuite, je tapote la lamelle vers le bas avec la gomme d'un crayon pour faire sortir l'excès d'eau de sous la lamelle. L'huile d'immersion s'ajoute à cela et je peux ensuite voir les spores et prendre les photos.

C'est ce que je veux dire :

Toutes ces petites gouttes ne sont pas censées être là. Je ne peux pas dire ce que sont des spores et ce qui ne le sont pas, ou si ces spores ont des ornements ou non. Cependant, je connais cette spore Est-ce que avoir des ornements (rhodotus palmatus).


Au moins certains des blobs que vous avez semblent être de l'air. Placer soigneusement la lamelle aidera à empêcher la formation de bulles d'air sous la lamelle. Posez un bord contre le fluide et relâchez-le lentement.

Vous mentionnez l'utilisation d'une lentille à immersion dans l'huile. Il est possible que de l'eau soit entrée en contact avec votre objectif. Le pétrole se frayant un chemin sous la lamelle pourrait également introduire des taches réfractaires.


Expériences sur les feuilles

Les cellules des feuilles ont une particularité : elles contiennent des pigments chloroplastes dans certaines cellules qui leur permettent de produire de l'énergie et leur propre nourriture grâce à la photosynthèse.

Qu'est-ce que ça veut dire? Eh bien, les chloroplastes d'une cellule contiennent différents pigments, ce qui donne sa couleur à une feuille.

Vert chlorophylle est le type de pigment le plus courant, mais il existe également des xanthophylles (jaunes), des cartenoïdes (jaunes, oranges) et des anthocyanes (rouges).

Les chlorophylles cachent généralement les autres pigments, sauf lorsque l'automne arrive et que la chlorophylle commence à se décomposer. C'est pourquoi les feuilles prennent des couleurs différentes à l'automne.

Alors, qu'est-ce que photosynthèse? En termes simples, il s'agit de la capture de l'énergie lumineuse pour produire de la nourriture. L'énergie lumineuse du soleil est transmise à travers les cellules d'une feuille aux chloroplastes, où la chlorophylle et d'autres pigments absorbants servent de récepteurs pour collecter l'énergie. Au cours de la photosynthèse, le dioxyde de carbone de l'air est converti en composés carbonés riches en énergie appelés glucides. Au fur et à mesure que cela se produit, de l'oxygène est émis dans l'air, fournissant l'oxygène que nous respirons.

Vous pouvez tester l'importance de l'énergie lumineuse dans croissance des plantes en faisant une expérience simple.

(Les plants de haricots sont un bon choix, car ils germent rapidement.)

Vous en aurez besoin pour contrôler, dans des conditions de croissance normales, soit à l'extérieur au soleil, soit à l'intérieur près d'une fenêtre lumineuse. Voyez comment la lumière affecte la croissance en couvrant les autres plantes d'essai avec un sac en papier ou une petite boîte pendant une partie de la journée.

Essayez d'en couvrir un pendant quatre heures le matin et un autre toute la journée.

Observez les changements des plantes au cours d'une semaine. Lequel pousse le mieux ? Quel est le résultat de la privation de lumière ?


Observer la moisissure de près

Pour examiner la moisissure au microscope, il est préférable de faire pousser la vôtre dans un environnement contrôlé. Nous vous recommandons d'utiliser du pain moelleux sans conservateur, mais de nombreux fruits ou légumes tels que les pommes de terre ou les oranges fonctionneront également. Un bon échantillon de moisissure peut prendre jusqu'à deux semaines pour se former, alors assurez-vous de planifier à l'avance ce projet. Veuillez noter: nous ne recommandons pas ce projet aux personnes allergiques aux moisissures (y compris la pénicilline) ou souffrant d'asthme sévère.

La façon la plus simple de faire pousser de la moisissure est sur un morceau de pain. Tout pain sans conservateur qui est doux fonctionnera bien. Le pain contenant des conservateurs mettra beaucoup plus de temps à former de la moisissure. Laissez le pain à l'air libre pendant environ une heure afin qu'il soit exposé aux contaminants dans l'air. Placez le pain dans un sac ziplock et saupoudrez d'eau dessus pour qu'il soit humide. Fermez le sac en laissant un peu d'air à l'intérieur. Placez le sac dans un endroit sombre et chaud, loin des autres aliments. Un placard de cuisine près du poêle peut être une option. Ou vous pouvez le placer à côté d'une fenêtre, avec un bol ou une assiette le couvrant de la lumière. La moisissure se développera mieux dans un environnement humide. La moisissure devrait commencer à se former dans 2-3 jours, mais il faudra une semaine ou plus pour obtenir un bon échantillon.

Vérifiez le morceau de pain tous les quelques jours et ajoutez plus d'eau s'il se dessèche. Évitez autant que possible d'ouvrir le sac en plastique. Si vous touchez le pain, assurez-vous de bien vous laver les mains par la suite. Lorsque suffisamment de moisissure s'est formée, vous pouvez préparer une lame et l'examiner au microscope (les microscopes pour étudiants fonctionnent bien pour cela). Vous aurez besoin d'un échantillon d'environ un pouce de diamètre.

De quoi as-tu besoin:

Remarque sur la sécurité : Lors de la manipulation de moisissures, il est très important de couvrir autant de peau que possible et de porter des gants. La moisissure est un allergène et peut être toxique. Travailler avec de la moisissure comme vous êtes dans l'expérience n'affecte généralement que les très jeunes ou très vieux, ou ceux qui ont de graves problèmes immunitaires, mais il est important de prendre des mesures de précaution (comme des gants) et de ne pas faire ce projet si vous avez des allergies ou asthme.

Que faites vous:

  1. Déposez une goutte d'eau au centre de la lame, à l'aide d'une pipette si vous en avez une, ou du bout d'un doigt propre. Vous pouvez utiliser à la place une solution de bleu de méthylène, qui est une coloration au microscope, et rend l'échantillon plus facile à voir en colorant certaines parties des cellules de la moisissure.
  2. À l'aide d'un cure-dent, grattez une partie de la moisissure et placez-la sur la goutte d'eau.
  3. Prenez la lamelle et placez-la à un angle par rapport à la lame de sorte qu'un bord de celle-ci touche la goutte d'eau, puis abaissez-la soigneusement sur la goutte de sorte que la lamelle recouvre l'échantillon sans piéger les bulles d'air en dessous.
  4. Utilisez le coin d'une serviette en papier pour éponger tout excès d'eau sur les bords de la lamelle.
  5. Voir la lame avec un microscope composé, en commençant par un objectif bas.

Saviez-vous que les moisissures sont en fait des champignons ? Les champignons se trouvent dans toutes sortes d'environnements, et certains sont utiles, tandis que d'autres peuvent être nocifs. Les champignons sont en fait un type de champignons comestibles. La moisissure est certainement une nuisance pour les aliments, mais certains antibiotiques ont été fabriqués à partir de moisissures similaires à celles que vous avez cultivées.

La croissance colorée sur le pain est faite de structures de fils connectés appelées hyphes. Ceux-ci forment un moule colonie qui a commencé par un seul moule spore. Les hyphes peuvent sembler douces et floues, ou elles peuvent être très colorées. En regardant les hyphes au microscope, vous pourrez identifier de quel type de moisissure il s'agit.

Rhizopus se nourrit d'amidon ou de sucre, ce qui en fait une moisissure courante sur le pain. Ce type de moisissure peut commencer par des structures ressemblant à des cheveux blancs et finir par former des points noirs solides. Au microscope, Rhizopus apparaît sous forme de brins courts avec des têtes de forme ovale, ressemblant à un ballon sur une ficelle. La tête est l'endroit où les spores de ce type de moisissure sont contenues.

Aspergillus est une autre moisissure que l'on trouve couramment sur les aliments, en particulier les céréales. C'est une couleur typiquement vert bleuâtre, avec un mince anneau de blanc autour de chaque colonie. Certaines espèces d'Aspergillus sont de couleur noire. Vous pouvez identifier ce type de moisissure en réalisant une lame et en la visualisant au microscope. Il a une structure en forme de branche mince, avec des têtes qui ressemblent à des fleurs épanouies et libèrent des spores sphériques.

Le pénicillium, d'où vient le puissant antibiotique pénicilline, peut être bleu-vert ou gris, souvent avec un bord blanc flou. Ce type de moisissure est courant et ressemble souvent à Aspergillus à l'œil nu. Si vous l'examinez au microscope, vous verrez que la tête a une structure plus fine que celle d'Aspergillus, avec plusieurs segments de brins partant du brin principal. À la fin de chaque segment de la tête, vous devriez pouvoir voir de petites spores.

Nettoyer: Une fois l'expérience terminée, mettez le pain et tout ce qui l'a touché (y compris les gants et le tablier) dans un sac en plastique résistant à fermeture éclair et jetez-le. La lame ne sera pas permanente et doit également être jetée. Nettoyez soigneusement la zone dans laquelle vous travailliez avec des lingettes javellisées (comme Clorox) ou de l'eau et du savon.


Un microscope ordinaire voit en super-résolution avec un matériau de réduction de la lumière spécialement conçu

Les ingénieurs électriciens de l'Université de Californie à San Diego ont développé une technologie qui améliore la résolution d'un microscope optique ordinaire afin qu'il puisse être utilisé pour observer directement des structures et des détails plus fins dans des cellules vivantes.

La technologie transforme un microscope optique conventionnel en ce qu'on appelle un microscope à super-résolution. Il s'agit d'un matériau spécialement conçu qui raccourcit la longueur d'onde de la lumière lorsqu'il illumine l'échantillon - cette lumière rétrécie est ce qui permet essentiellement au microscope d'imager avec une résolution plus élevée.

"Ce matériau convertit la lumière basse résolution en lumière haute résolution", a déclaré Zhaowei Liu, professeur de génie électrique et informatique à l'UC San Diego. « C'est très simple et facile à utiliser. Placez simplement un échantillon sur le matériau, puis placez le tout sous un microscope normal - aucune modification sophistiquée n'est nécessaire.”

Le matériel monté sur la platine d'un microscope inversé. Crédit : Junxiang Zhao

L'ouvrage, publié dans Communication Nature, surmonte une grande limitation des microscopes optiques conventionnels : la faible résolution. Les microscopes optiques sont utiles pour l'imagerie des cellules vivantes, mais ils ne peuvent pas être utilisés pour voir quoi que ce soit de plus petit. Les microscopes optiques conventionnels ont une limite de résolution de 200 nanomètres, ce qui signifie que tout objet plus proche que cette distance ne sera pas observé en tant qu'objet séparé. Et bien qu'il existe des outils plus puissants tels que les microscopes électroniques, qui ont la résolution de voir les structures subcellulaires, ils ne peuvent pas être utilisés pour imager des cellules vivantes car les échantillons doivent être placés à l'intérieur d'une chambre à vide.

"Le principal défi est de trouver une technologie qui a une très haute résolution et qui est également sans danger pour les cellules vivantes", a déclaré Liu.

La technologie que l'équipe de Liu a développée combine les deux fonctionnalités. Avec lui, un microscope optique conventionnel peut être utilisé pour imager des structures subcellulaires vivantes avec une résolution allant jusqu'à 40 nanomètres.

Comparaison d'images prises au microscope optique sans le métamatériau hyperbolique (colonne de gauche) et avec le métamatériau hyperbolique (colonne de droite) : deux billes fluorescentes proches (rangée du haut), des points quantiques (rangée du milieu) et des filaments d'actine dans les cellules Cos-7 (rangée du bas). Crédit : Nature Communications

La technologie consiste en une lame de microscope recouverte d'un type de matériau thermorétractable appelé métamatériau hyperbolique. Il est composé de couches alternées d'argent et de verre de silice, fines du nanomètre. Au fur et à mesure que la lumière la traverse, ses longueurs d'onde se raccourcissent et se dispersent pour générer une série de motifs mouchetés haute résolution aléatoires. Lorsqu'un échantillon est monté sur la lame, il est éclairé de différentes manières par cette série de motifs lumineux mouchetés. Cela crée une série d'images basse résolution, qui sont toutes capturées puis reconstituées par un algorithme de reconstruction pour produire une image haute résolution.

Les chercheurs ont testé leur technologie avec un microscope inversé commercial. Ils ont pu imager des caractéristiques fines, telles que des filaments d'actine, dans des cellules Cos-7 marquées par fluorescence - des caractéristiques qui ne sont pas clairement discernables en utilisant uniquement le microscope lui-même. La technologie a également permis aux chercheurs de distinguer clairement de minuscules billes fluorescentes et des points quantiques espacés de 40 à 80 nanomètres.

La technologie de super-résolution a un grand potentiel pour un fonctionnement à grande vitesse, ont déclaré les chercheurs. Leur objectif est d'incorporer une haute vitesse, une super-résolution et une faible phototoxicité dans un système d'imagerie de cellules vivantes.

L'équipe de Liu étend maintenant la technologie pour faire de l'imagerie haute résolution dans un espace tridimensionnel. Cet article actuel montre que la technologie peut produire des images à haute résolution dans un plan bidimensionnel. L'équipe de Liu a précédemment publié un article montrant que cette technologie est également capable d'imager avec une résolution axiale ultra-élevée (environ 2 nanomètres). Ils travaillent maintenant à combiner les deux.

Référence : « Nanoscopie d'éclairage assistée par métamatériau via des taches de super-résolution aléatoires » par Yeon Ui Lee, Junxiang Zhao, Qian Ma, Larousse Khosravi Khorashad, Clara Posner, Guangru Li, G. Bimananda M. Wisna, Zachary Burns, Jin Zhang et Zhaowei Liu, le 10 mars 2021, Communication Nature.
DOI : 10.1038/s41467-021-21835-8

Ce travail a été soutenu par la Gordon and Betty Moore Foundation et les National Institutes of Health (R35 CA197622). Ce travail a été réalisé en partie à la San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) de l'UC San Diego, membre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure, qui est soutenue par la National Science Foundation (subvention ECCS-1542148).


Comment éviter les taches au microscope ? - La biologie

L'objectif de ce chapitre est de créer une vue d'ensemble des types de microscopie les plus basiques et généraux, par exemple la microscopie optique. microscopie, etc.). Espérons que nous pourrons combler ces lacunes à l'avenir. Une ressource fantastique sur les microscopes, leur fonctionnement, leurs avantages/inconvénients, etc., peut être trouvée ici.

Les stéréomicroscopes sont des dispositifs optiques, conçus pour des grossissements inférieurs (généralement jusqu'à 100x) et l'observation d'échantillons de petite à moyenne taille. L'éclairage est réfléchi par l'échantillon et peut provenir d'une source externe. La lumière traverse 2 chemins optiques, ce qui améliore la visualisation en 3 dimensions. En raison de l'espace disponible entre l'échantillon et les pièces optiques, la configuration permet également la manipulation de l'échantillon et une préparation supplémentaire pour d'autres méthodes.

Mots-clés : stéréo, binoculaire, microscope

Les stéréomicroscopes commerciaux coûtent à partir de 150€, les très sophistiqués jusqu'à 1000€. La partie la plus chère de l'appareil est probablement l'optique, qui n'est guère compensée par les appareils de bricolage, car les lentilles de qualité sont extrêmement difficiles à fabriquer soi-même. En plus des appareils classiques, il existe également sur le marché des microscopes numériques, qui sont monoculaires, très bon marché (25 - 60€) et ont une constitution similaire aux stéréomicroscopes classiques et pourraient remplir la même fonction. Ils offrent également un grossissement très élevé, bien que la résolution et la mise au point soient discutables.

3. Ressources de bricolage disponibles

Comme mentionné, il est irrationnel de fabriquer des lentilles et autres optiques à partir de zéro, cependant, s'il existe des ressources pour celles-ci, qui sont relativement bon marché, cela pourrait avoir du sens. Il n'y a qu'un seul modèle de bricolage disponible pour le moment, qui utilise une combinaison de différentes jumelles bon marché. Les jumelles sont déjà disponibles chez amazon pour un peu plus de 10€, la construction semble donc rentable.

4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ?

Il est difficile de commenter les soultions de bricolage à ce stade, car peu sont disponibles. Les exigences pour un microscope stéréo sont, cependant, relativement faibles, donc un appareil à faible coût, comme mentionné ci-dessus, semble raisonnable.

Le grossissement et la mise au point doivent être progressivement réglables à la main. Un grossissement minimum satisfaisant est probablement d'environ 50x, cependant, l'appareil doit avoir suffisamment d'espace entre l'échantillon et les lentilles, pour permettre la manipulation.

Microscope optique classique

Des microscopes ont été développés pour l'observation de très petits échantillons. Traditionnellement, la première rencontre avec la microscopie se fait via un microscope optique classique. Dans ce que nous appelons la microscopie "à champ clair", la lumière d'une source est transmise à travers un échantillon très fin, l'image est ensuite focalisée et agrandie, à travers un système de lentilles. Pour améliorer la résolution et l'observabilité de l'échantillon, celui-ci peut être préparé à l'avance, par fixation, coupe très fine, coloration. Généralement, les microscopes optiques permettent des grossissements jusqu'à 1000x. En raison des limitations de la lumière visible, les grossissements les plus élevés nécessitent principalement des huiles d'immersion, pour une amélioration de la mise au point.

Mots-clés : optique, lumineux, champ, microscope

Les microscopes de loisir peuvent souvent être achetés pour 150 € ou moins, mais ceux-ci ont généralement une optique très médiocre, avec des résolutions, une profondeur de champ, une mise au point, etc. faibles et par conséquent ne sont pas vraiment adaptés à la recherche. Les microscopes de laboratoire les plus simples sont disponibles à partir de 300€, avec une limite en milliers d'€. Les prix élevés sont dus aux exigences optiques, cependant, les nouveaux microscopes ont également des fonctionnalités coûteuses, qui ne sont pas toujours nécessaires.

3. Ressources de bricolage disponibles

Il existe actuellement quelques microscopes de bricolage qui utilisent l'optique des appareils disponibles, tels que les webcams (exemple 1, exemple 2), les smartphones, etc. Ceux-ci peuvent être très bon marché (si vous avez déjà un smartphone) et conviennent à la microscopie simple, mais cela dépend si, ils conviendront à vos besoins. Un aspect très important de la microscopie est également le contrôle précis de l'échantillon, par rapport à l'objectif. La conception OpenFlexure permet une manipulation précise, vraisemblablement inférieure à 100 nm, ce qui est un outil puissant à intégrer à d'autres solutions.

4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ?

Les problèmes importants en microscopie sont, comme mentionné, un éclairage, une mise au point et un grossissement suffisants. L'éclairage peut être contrôlé avec une source lumineuse, et le condenseur (qui détermine également l'angle et la mise au point, auxquels la lumière frappe l'échantillon), la mise au point et le grossissement sont généralement déterminés par les lentilles de l'objectif et l'oculaire. Il y a aussi généralement d'autres problèmes. Les microscopes ont généralement une profondeur de champ très proche, il est donc crucial que les échantillons soient très fins. De plus, comme la lumière traverse normalement différents supports avant d'atteindre l'objectif, elle peut diffracter et déformer l'image. Par conséquent, à des grossissements plus élevés, des huiles d'immersion sont utilisées pour placer entre l'objectif et une lamelle, sur le dessus de l'échantillon. Avec les ressources de bricolage disponibles, tous ces facteurs sont difficiles à contrôler, on peut donc se demander s'ils sont suffisamment bons.

Un bon microscope doit avoir une source de lumière réglable (intensité réglable, cependant, fournissant un éclairage très uniforme), et les capacités de focaliser la lumière avec un condenseur. L'optique de microscopie doit également permettre un bon grossissement, tout en conservant la résolution. Un microscope optique peut être purement numérique et basé, par exemple, sur une webcam, cependant, nous pensons que des améliorations peuvent être apportées aux modèles existants.

Un microscope à fluorescence peut être utilisé pour des échantillons avec des propriétés luminescentes (auto-émettrices de lumière), comme la fluorescence ou la photophorescence, où au lieu de la lumière transmise ou réfléchie, la lumière émise par les échantillons eux-mêmes est observée. En principe, sa constitution est similaire à celle d'un microscope optique classique, mais en plus, il dispose d'une deuxième source lumineuse avec des longueurs d'onde appropriées, pour exciter l'échantillon et lui faire émettre sa propre lumière (avec des longueurs d'onde légèrement plus longues). Typiquement, la lumière excitatrice est réfléchie par un miroir dichronique (transmet certaines longueurs d'onde et en réfléchit d'autres), puis traverse l'objectif, où elle se concentre sur la partie visible de l'échantillon. La lumière fluorescente revient ensuite à travers l'objectif, mais aussi à travers le miroir dichronique, vers l'oculaire.

Mots clés : fluorescence, photophorescence, luminescence, optique, microscope

Bien qu'il semble que la modification soit petite, les microscopes à fluorescence sont nettement plus chers que les microscopes optiques classiques, qui coûtent plusieurs milliers d'euros, les moins chers autour de 3000 €. Les filtres dichroniques (miroirs) seuls peuvent coûter 500-1000€, selon leur spécificité de longueur d'onde. De plus, la deuxième source de lumière contribuera au coût.

3. Ressources de bricolage disponibles

Les microscopes à fluorescence de bricolage utilisent généralement des microscopes à champ clair existants comme base et intègrent un éclairage et des filtres supplémentaires. De bons exemples sont l'exemple 1 adapté à GFP et DsRED, et l'exemple plus sophistiqué 2, également adapté aux GFP. Le plus avancé est probablement le microscope portable à champ clair et à fluorescence - Le microscope Global Focus, qui est construit à partir de zéro pour 240 $, utilise une simple lampe de poche pour la source lumineuse et atteint une résolution de 0,8 μm à un grossissement de 1000x.

4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ?

Peut-être un peu surprenants, bien que plus difficiles à fabriquer, les microscopes à fluorescence DIY semblent être plus avancés que leurs homologues classiques à fond clair. Le projet de microscope Global Focus semble répondre aux attentes d'un microscope de laboratoire. Il pourrait même être amélioré en intégrant une source de lumière fixe et réglable et une lentille à condensateur pour un signal amélioré. De plus, un appareil photo numérique supplémentaire permettrait de capturer des images directement sur un ordinateur, ce qui est important pour les enregistrements.

Un microscope à fluorescence devrait en principe avoir les mêmes capacités optiques qu'un microscope à fond clair, avec en plus la création et la détection de fluorescence. Cette dernière dépend fortement de la source lumineuse et des filtres, et doit être adaptée au matériau fluorescent. Lors de la réalisation d'une analyse immunohistochimique, les fluorophores/anticorps doivent être acquis conformément aux capacités du microscope.

Les microtomes sont le principal outil de préparation des échantillons pour la microscopie optique. Ils se composent principalement d'un porte-échantillon, contenant l'échantillon (qui est fixé dans une sorte de support solide comme la paraffine, les résines époxy. ), un couteau et un mécanisme cyclique pour couper l'échantillon en fines tranches. Les sections "semi-fines" typiques, adaptées à la microscopie optique, ont une épaisseur d'environ 1 m, mais à des fins différentes, des sections allant jusqu'à 100 m sont également utilisées. Il existe quelques méthodes de microtomie, comme la cryosection (congélation rapide des échantillons, permet la coupe et l'analyse d'un échantillon, tandis que le reste du tissu est conservé intact), ou l'ultramicrosection (création de très fines,

des coupes de 70 nm d'épaisseur, adaptées à la microscopie électronique), toutes utilisant le même principe de base.

Mots-clés : microtome, sectionnement, semi, mince

Il existe différentes formes de microtomes sur le marché, les plus courantes sont les microtomes rotatifs, qui ont encore de nombreuses variantes. Manuel à automatique, utilisant des couteaux en acier, en verre ou même en diamant, appropriés pour les échantillons de paraffine, d'époxy ou congelés. Les microtomes semi-automatisés les plus courants sont assez chers, entre 2000 et 10000€. Il est crucial, que les sections soient aussi fines qu'ajustées et coupées uniformément (jusqu'à 20 nm d'épaisseur), ce qui nécessite une mécanique très précise, d'où le prix élevé.

3. Ressources de bricolage disponibles

Les projets de bricolage sont une rareté pour le moment, dont la raison est inconnue. Il est possible que cela soit dû à un écart important entre les normes de recherche et les exigences des loisirs. La plupart des méthodes de bricolage (exemple 1, exemple 2, exemple 3) utilisent un système manuel, où l'échantillon est placé sur un boulon et l'épaisseur de la section est réglée avec un écrou. Les coupes sont préparées manuellement, en glissant sur l'écrou avec une lame. Le microtome DIY le plus sophistiqué du moment est en fait construit à partir de LEGO et peut atteindre une épaisseur de section estimée à 250 μm.

4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ?

Le statut de bricolage actuel des microtomes est loin d'être suffisant pour une microscopie sérieuse. Dans tous les cas, il devrait être possible de construire un microtome de bricolage, peut-être 3D prinatlbe, produisant des tranches régulières, le plus grand défi serait d'atteindre la plage de section requise de 1 m, voire d'aller au-delà, jusqu'à des sections ultrafines. Pour cet effort, une combinaison de mécanismes mécaniques et de procédés alternatifs peut éventuellement être utilisée (par exemple, une expansion dépendante de la température).

Comme il fait défaut actuellement, nous nous attacherons à développer un microtome DIY, qui pourra être réalisé à partir de pièces imprimables en 3D, facilement assemblables, mais qui répondra aux exigences (ou s'en rapprochera du moins) des appareils du commerce.

Microscope électronique à transmission

####1. Contexte La résolution d'un système optique a ses limites physiques. En raison des propriétés de diffraction du rayonnement électromagnétique, la longueur d'onde en est une importante. En conséquence, nous ne pouvons pas regarder loin dans l'échelle submicrométrique avec seulement la lumière visible. Cependant, cela n'est pas toujours nécessaire. Les électrons peuvent avoir une longueur d'onde nettement plus courte que la lumière visible, ce qui permet l'observation d'objets encore plus petits, les appareils sophistiqués peuvent atteindre une résolution inférieure à Ångström. Un microscope électronique à transmission (MET) utilise un faisceau d'électrons focalisé, qui est projeté à travers un très mince (

70nm), échantillon contrasté (certaines structures absorbent les électrons, d'autres non), sur un CCD, qui est ensuite utilisé pour produire une image visible en niveaux de gris.

Mots-clés : transmission, électron, microscope, tem, longueur d'onde, résolution.

####2. Variantes commerciales Les TEM commerciaux sont très chers, coûtant plusieurs 10k€, jusqu'à quelques 100k€ voire 1M€, selon leurs capacités. Ceux-ci sont déterminés par la qualité du système de lentilles (lentilles magnétiques), la plage d'accélération des électrons. Pour empêcher les électrons d'interagir avec les gaz, la procédure doit se dérouler dans le vide, ce qui est également nécessaire pour éviter un arc entre la cathode haute tension et la masse. Le système nécessite également un refroidissement, une alimentation électrique stable et une mise à la terre sans vibration, pour créer des images nettes et de bonne qualité. De plus, l'imagerie TEM nécessite une préparation adéquate de l'échantillon, en utilisant un ultramicrotome pour la coupe, généralement en combinaison avec des couteaux en verre et en diamant.

####3. Ressources de bricolage disponibles Il semble n'y avoir qu'une seule ressource de quelqu'un qui construit un microscope électronique à transmission fait maison, malheureusement, aucune documentation n'est disponible.

####4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ? Les images produites avec le système mentionné sont de qualité raisonnable, permettant éventuellement l'inspection de l'ultrastructure de la cellule (avec des échantillons appropriés bien sûr), ce qui est assez bon pour un usage général !

####5. Exigences et plans Comme il n'y a pas de ressources disponibles sur les TEM DIY, ils devront être créés à partir de zéro. Heureusement, il existe un autre projet documenté sur la microscopie électronique à balayage, qui pourrait peut-être servir de base.

###Microscope électronique à balayage (MEB)

####1. Contexte Contrairement à un MET, un microscope électronique à balayage (MEB) ne projette pas d'électrons à travers un échantillon. Au contraire, le faisceau est focalisé sur la surface, qui absorbe les électrons et émet des électrons secondaires, qui sont ensuite projetés vers le CCD. Pour que cela fonctionne, la surface de l'échantillon doit être conductrice, c'est pourquoi les échantillons non métalliques sont recouverts d'un film métallique mince (or, argent), généralement par pulvérisation cathodique ou par dépôt physique en phase vapeur.

En plus d'émettre des électrons secondaires après l'absorption des électrons primaires, la matière émet généralement également d'autres rayonnements électromagnétiques, dans le spectre des rayons X. ceux-ci sont spécifiques à l'élément et peuvent être utilisés pour déterminer la composition chimique d'un échantillon, en utilisant la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX). Les capteurs sont pour la plupart très sensibles et nécessitent d'être refroidis à l'azote liquide.

Mots-clés : balayage, électron, microscope, pulvérisation cathodique, revêtement, edx, ex-ray

####2. Variantes commerciales En tant que TEM, les SEM sont des dispositifs très coûteux, ils utilisent cependant des tensions plus basses et ont généralement des tubes cathodiques plus courts. Les appareils d'occasion coûtent 10k à plusieurs 10k€, les nouveaux SEM vont jusqu'à 100k€ ou dans la gamme du million d'euros, pour les appareils avec des capacités supplémentaires EDX ou STEM (une forme limitée de TEM utilisant un SEM).

####3. Ressources DIY disponibles Il existe un projet DIY SEM « assez » documenté, réalisé par Ben Krasnow, qui a également réalisé quelques vidéos montrant les capacités de son appareil très impérieux.

####4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ? Les images fournies par Krasnow montrent une qualité suffisante de son DIY-SEM. Le grossissement est le principal facteur limitant et sa suffisance dépend des échantillons. Pour le bricoleur moyen, c'est sûrement assez bon.

####5. Exigences et plans Un SEM suffisamment bon devrait être capable de fournir une image nette à des grossissements de quelques milliers de fois.

####1. Contexte Les revêtements par pulvérisation cathodique sont utilisés pour le dépôt de métaux sur des échantillons non conducteurs pour la microscopie électronique à balayage. Habituellement, un gaz inerte (donc il ne réagit pas avec le matériau de la plaquette) à basse pression est accéléré et ionisé dans un champ électrique puissant, à des vitesses très élevées, auxquelles il peut éliminer les molécules d'une "plaquette" qu'il heurte. Ces molécules sont ensuite dispersées et peuvent se condenser sur les surfaces voisines. Si la plaquette est faite d'un métal, comme l'or ou le palladium (souvent utilisé pour la pulvérisation cathodique SEM), les surfaces revêtues deviennent conductrices et donc adaptées au SEM.

Mots-clés : pulvérisation cathodique, revêtement, métal, dépôt

####2. Variantes commerciales Les pulvérisateurs commerciaux coûtent quelques milliers d'euros, même d'occasion. Les variantes d'occasion les moins chères avec des pièces cassées coûtent environ 500 €.

####3. Ressources de bricolage disponibles Il est intéressant de noter qu'il semble y avoir plus de projets de revêtement par pulvérisation de bricolage circulant sur Internet que de SEM de bricolage. Exemple 1, exemple 2, exemple 3. La plupart utilisent une simple chambre à vide et beaucoup n'utilisent même pas de gaz noble, une composition magnétique simple et un générateur haute tension. Le revêtement par pulvérisation cathodique est probablement la méthode la plus largement utilisée pour la préparation d'échantillons SEM, cependant, il existe également d'autres alternatives, comme le dépôt physique en phase vapeur par évaporation à très haute température, ou même des méthodes chimiques comme le revêtement d'argent avec du nitrate d'argent. La pertinence d'une méthode dépend de l'échantillon et des résultats souhaités.

####4. Le bricolage est-il assez bon et raisonnable ? Les projets de bricolage existants semblent assez bons, cependant, la plupart d'entre eux sont mal documentés.

####5. Exigences et plans La pression dans la chambre doit être suffisamment basse pour supporter une petite quantité de particules de gaz ionisé, permettant ainsi des tensions élevées sans court-circuit. Il faut un gaz inerte, comme l'argon, qui ne réagit pas avec le métal pulvérisé et des champs magnétiques et électriques contrôlés sont nécessaires pour accélérer le gaz vers le métal.

####6. Travailler autour/sans l'appareil Si vous avez accès à un SEM ou STM, mais pas à une coucheuse par pulvérisation (ce qui n'est probablement pas si probable), il existe d'autres méthodes de revêtement d'une surface avec un matériau conducteur qui peut cependant ne pas être aussi précis. Une possibilité est le dépôt chimique d'argent, en trempant un échantillon dans un mélange de fabrication de miroirs au nitrate d'argent. Une autre possibilité est le dépôt de métal en phase vapeur, en évaporant des métaux, tels que l'argent, en chauffant et en plaçant les échantillons de manière adjacente.

###Microscope à effet tunnel

####1. Contexte Un microscope à effet tunnel (STM) est un dispositif d'imagerie de surfaces à des échelles du niveau atomique. Il utilise un concept connu sous le nom de tunnel quantique, où une pointe fine et conductrice (sous une petite tension) est placée près d'un échantillon. Lorsque la distance est suffisamment courte, les électrons peuvent "tunnel" à travers l'espace vide entre eux, alors que le courant mesuré dépend de la position de la pointe par rapport à l'échantillon, de la tension et de la densité de l'espace de l'échantillon. En utilisant cette technique, des profils de surface extrêmement précis d'un échantillon peuvent être mesurés, même des atomes isolés peuvent être rendus visibles.

Mots-clés : balayage, effet tunnel, microscope, atomique, échelle, surface

####2. Commercial variants "Cheap" commercial STMs can be acquired for about 10 000€, however more high-end devices can cost from 30k to 150k€.

####3. Available DIY resources A few DIY STMs with good documentation are currently available, which can be assembled for less than a 1000€, but can still reach the atomic scale. Best described are example 1, example 2 and example 3.

####4. Is DIY good enough and reasonable? The current DIY STMs seem to be a serious competition to the commercial devices, at least for measuring conductive materials. The control and precision may not be quite as high, but seems to be more than sufficient to determine the crystal structure of metals for example.

####5. Requirements and plans Due to the small scale, possibly the most important issue to tackle is vibration isolation. There are different methods, how to achieve this, in general, the measurement device (containing the sample) requires a large inertia (needs to be relatively heavy), while resting on some sort of spring or pillow. Another important characteristic is tip size, which needs to be appropriately small and narrow, to achieve a good spatial resolution and finally, motion control of the sensor needs to be sufficient, which can be achieved for example, by controling the thermal expansion of the mount, or using a piezoelectric crystal, etc.

####1. Background Similar to the STM, an atomic force microscope (AFM) uses a very fine tip (on a cantilever), which can be (but doesn't have to) brought in contact with the sample surface and is then used to scan across it, while the cantilever displacement is measured. In addition to measuring the height profile, an AFM can also be used to measure other characteristics, such as mechanical or surface interaction properties of a sample. The cantilever deflection is often measured by a laserbeam, which is reflected of the cantilever and redirected by a displacement.

Keywords: atomic, force, microscope, surface, properties

####2. Commercial variants Commercial AFMs usually cost several 10k€ and up to a few 100k€. They come in many different forms, for a wide range of applicability (different sizes, mounted on a microscope, adjusted for wet samples, automated to different degrees, etc.).

####3. Available DIY resources In 2015, a DIY AFM project was published in Nature Nanotechnology, which can be built by school children in a few hours and can successfully measure particles with a size of 2.5μm. This was part of the OpenAFM project, supported by the LEGO foundation. One of the more advanced spin-offs for example, is the Strømlingo nano, which is also available commercially for 2999$.

####4. Is DIY good enough and reasonable? The available DIY resources were actually created for educational purposes, however, they do achieve respectable specifications for a very low price. Whether they suffice for high end research is questionable. However, it should be noted, that open source devices can generally be easily modified for specific purposes, which is especially useful for AFMs, with their wide range of (typically very costly) forms and adaptations.

####5. Requirements and plans Due to the mechanical interaction of the AFM tip with the samples, it is easily damaged and needs to be replaced over time. For this reason it is imporant for an AFMs construction to allow simple and fast cantilever exchange. It is also beneficial, if it allows the installation of several types of cantilevers, which bring additional functionality to the device (different geometries, materials, tip coatings, etc.). The scannig process requires fine control over cantilever movement, and a precise displacement detection! Similar to the STM, an AFM also needs some form of vibration reduction.


New Era in Coral Biology Research: Scientists Have Cultured the First Stable Coral Cell Lines

Researchers in Japan have established sustainable cell lines in a coral, according to a study published today (April 25, 2021) in Marine Biotechnology.

Seven out of eight cell cultures, seeded from the stony coral, Acropora tenuis, have continuously proliferated for over 10 months, the scientists reported.

“Establishing stable cells lines for marine organisms, especially coral, has proven very difficult in the past,” said Professor Satoh, senior author of the study and head of the Marine Genomics Unit at the Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST). “This success could prove to be a pivotal moment for gaining a deeper understanding of the biology of these vitally important animals.”

Acropora tenuis appartient au Acroporidae family, the most common type of coral found within tropical and subtropical reefs. These stony corals are fast growers and therefore play a crucial role in the structural formation of coral reefs.

Cependant, Acroporidae corals are particularly susceptible to changes in ocean conditions, often undergoing bleaching events when temperatures soar or when oceans acidify. Establishing knowledge about the basic biology of these corals through cell lines could one day help protect them against climate change, explained Professor Satoh.

Creating the cultures

In the study, Professor Satoh worked closely with Professor Kaz Kawamura from Kochi University — an expert in developing and maintaining cell cultures of marine organisms.

Since adult coral host a wide variety of microscopic marine organisms, the group chose to try creating the cell lines from coral larvae to reduce the chances of cross-contamination. Another benefit of using larval cells was that they divide more easily than adult cells, potentially making them easier to culture.

The researchers used coral specimens in the lab to isolate both eggs and sperm and fertilize the eggs. Once the coral larvae developed, they separated the larvae into individual cells and grew them in petri dishes.

The microscope image shows three of the cell lines established in the study, ranging in color and form. Credit: OIST

Initially, the culture attempts ended in failure. “Small bubble bodies appeared and then occupied most of the petri dish,” said Professor Kaz Kawamura. “We later found that these were the fragments of dying stony coral cells.”

In the second year, the group discovered that by adding a protease called plasmin to the cell culture medium, right at the beginning of the culture, they could stop the stony coral cells from dying and keep them growing.

Two to three weeks later, the larval cells developed into eight different cell types, which varied in color, form and gene activity. Seven out of the eight continued to divide indefinitely to form new coral cells.

Exploring the symbiosis integral to coral survival

One of the most exciting advancements of this study was that some of the cell lines were similar in form and gene activity to endodermal cells. The endoderm is the inner layer of cells formed about a day after the coral eggs are fertilized.

Importantly, it is the cells in the endoderm that incorporate the symbiotic algae, which photosynthesize and provide nutrients to sustain the coral.

Corals are the one of the simplest animals, with only two layers of cells (called germ layers) forming in early embryonic development — an inner layer, the endoderm, and an outer layer, the ectoderm. Each germ cell layer ultimately develops into different types of cells, including digestive cells, muscle-like cells, nerve-like cells and stinging cells (cnidocytes) but how each cell type forms during development still requires investigation. Credit: OIST

“At this point in time, the most urgent need in coral biology is to understand the interaction between the coral animal and its photosynthetic symbiont at the cellular level, and how this relationship collapses under stress, leading to coral bleaching and death,” said Professor David Miller, a leading coral biologist from James Cook University, Australia, who was not involved in the study.

He continued: “Subject to confirmation that these cells in culture represent coral endoderm, detailed molecular analyses of the coral/photosymbiont interaction would then be possible — and from this, real advances in understanding and perhaps preventing coral bleaching could be expected to flow.”

For Professor Satoh, his interest is in how the photosymbiotic algae cells, which are almost as big as the larval cells, initially enter the coral.

“The algae are incorporated into the coral cells around a week after the larvae first develop,” said Prof. Satoh. “But no one has yet observed this endosymbiotic event on a single-cell level before.”

A new era for coral cell research

The scientists also found that the coral cell lines were still viable after being frozen with liquid nitrogen and then thawed. “This is crucial for being able to successfully supply the coral cell lines to research laboratories across the globe,” said Professor Satoh.

The implications for future research using these cell lines are far-reaching, ranging from research on how single coral cells respond to pollution or higher temperatures, to studying how corals produce the calcium carbonate that builds their skeleton.

Research could also provide further insight into how corals develop, which could improve our ability to farm coral.

In future research, the team hopes to establish cells lines that are clonal, meaning every cell in the culture is genetically identical.

“This will give us a much clearer idea of exactly which coral cell types we are growing, for example gut-like cells or nerve-like cells, by looking at which genes are switched on and off in the cells,” said Professor Satoh.

Reference: “Establishing Sustainable Cell Lines of a Coral, Acropora tenuis” by Kaz Kawamura, Koki Nishitsuji, Eiichi Shoguchi, Shigeki Fujiwara and Noriyuki Satoh, 26 April 2021, Marine Biotechnology.
DOI: 10.1007/s10126-021-10031-w


Tiny Blobs of Brain Cells Could Reveal How Your Mind Differs From a Neanderthal’s

Researchers grew clusters of brain cells in the lab with a gene carried by our ancient ancestors.

In recent years, scientists have figured out how to grow blobs of hundreds of thousands of live human neurons that look — and act — something like a brain.

These so-called brain organoids have been used to study how brains develop into layers, how they begin to spontaneously make electrical waves and even how that development might change in zero gravity. Now researchers are using these pea-size clusters to explore our evolutionary past.

In a study published on Thursday, a team of scientists describe how a gene likely carried by Neanderthals and our other ancient cousins triggered striking changes in the anatomy and function of brain organoids.

As dramatic as the changes are, the scientists say it’s too soon to know what these changes mean for the evolution of the modern human brain. “It’s more of a proof of concept,” said Katerina Semendeferi, a co-author of the new study and an evolutionary anthropologist at the University of California San Diego.

To build on the findings, she and her co-author, Alysson Muotri, have established the UC San Diego Archealization Center, a group of researchers focused on studying organoids and making new ones with other ancient genes. “Now we have a beginning, and we can start exploring,” Dr. Semendeferi said.

Dr. Muotri began working with brain organoids more than a decade ago. To understand how Zika produces birth defects, for example, he and his colleagues infected brain organoids with the virus, which prevented the organoids from developing their cortex-like layers.

In other studies, the researchers studied how genetic mutations help give rise to disorders like autism. They transformed skin samples from volunteers with developmental disorders and transformed the tissue into stem cells. They then grew those stem cells into brain organoids. Organoids from people with Rett Syndrome, a genetic disorder that results in intellectual disability and repetitive hand movements, grew few connections between neurons.

Dr. Semendeferi has been using organoids to better understand the evolution of human brains. In previous work, she and her colleagues have found that in apes, neurons developing in the cerebral cortex stay close to each other, whereas in humans, cells can crawl away across long distances. “It’s a completely different organization,” she said.

But these comparisons stretch across a vast gulf in evolutionary time. Our ancestors split off from chimpanzees roughly seven million years ago. For millions of years after that, our ancestors were bipedal apes, gradually attaining larger heights and brains, and evolving into Neanderthals, Denisovans and other hominins.

It’s been difficult to track the evolutionary changes of the brain along the way. Our own lineage split from that of Neanderthals and Denisovans about 600,000 years ago. After that split, fossils show, our brains eventually grew more rounded. But what that means for the 80 billion neurons inside has been hard to know.

Dr. Muotri and Dr. Semendeferi teamed up with evolutionary biologists who study fossilized DNA. Those researchers have been able to reconstruct the entire genome of Neanderthals by piecing together genetic fragments from their bones. Other fossils have yielded genomes of the Denisovans, who split off from Neanderthals 400,000 years ago and lived for thousands of generations in Asia.

The evolutionary biologists identified 61 genes that may have played a crucial role in the evolution of modern humans. Each of those genes has a mutation that’s unique to our species, arising some time in the last 600,000 years, and likely had a major impact on the proteins encoded by these genes.

Dr. Muotri and his colleagues wondered what would happen to a brain organoid if they took out one of those mutations, changing a gene back to the way it was in our distant ancestors’ genomes. The difference between an ancestral organoid and an ordinary one might offer clues to how the mutation influenced our evolution.

It took years for the scientists to get the experiment off the ground, however. They struggled to find a way to precisely alter genes in stem cells before coaxing them to turn into organoids.

Once they had figured out a successful method, they had to choose a gene. The scientists worried that they might pick a gene for their first experiment that would do nothing to the organoid. They mulled how to increase their odds of success.

“Our analysis made us say, ‘Let’s get a gene that changes a lot of other genes,’” said Dr. Muotri.

One gene on the list looked particularly promising in that regard: NOVA1, which makes a protein that then guides the production of proteins from a number of other genes. The fact that it is mainly active only in the developing brain made it more attractive. And humans have a mutation in NOVA1 not found in other vertebrates, living or extinct.


How to Prevent Parallax Error

Parallax error occurs when the measurement of an object's length is more or less than the true length because of your eye being positioned at an angle to the measurement markings. For example, a person viewing a car's speedometer from the driver's seat will get an accurate reading because she has a direct line of sight. A person viewing the speedometer from the passenger seat will overestimate the reading because of the angle between his eye, the meter and the arrow.

Orient your line of sight directly above the measurement marking on a ruler or similar device so that an imaginary vertical line connects your eye, the marking and the object. Parallax error is primarily caused by viewing the object at an oblique angle with respect to the scale, which makes the object appear to be at a different position on the scale.

Place the measurement device on its edge so it is level with the object being measured. If the measurement marking is above or below the object, it will magnify any parallax error caused by your line of sight being at an angle with respect to the marking.

Seek out the finest possible edge of the measurement device, or use a device with finer edges. A wider edge allows for a larger parallax error because the object could be higher or lower with respect to the true measurement marking.

Place your eye at the level of the appropriate measurement marking when measuring the level of a liquid in a graduated cylinder. Read the lower part of the curved surface of the liquid -- the meniscus -- to gain an accurate measurement and avoid parallax errors.

Ask other people to take measurements. Because parallax error is a type of random error, you can average multiple readings taken by different people to cancel out most of the parallax angle. It is likely that some readings will have positive parallax error and others will have negative error. The average of these readings will be closer to the true measurement.


Department of Biology

To learn biology is more than just learning facts! It’s learning how to answer questions, how to develop strategies to obtain answers and how to recognize the answers as they emerge. The department is dedicated to encouraging students to learn science in both an intuitive and logical way.

It encourages students to independently question, probe, experiment and experience the natural world around us as well as life under a microscope.

The curriculum is organized to provide students with a sound introduction to the major concepts of biology and to foster an appreciation for the diversity and complexity of life. Requirements for students majoring in biology have been designed for both breadth and depth of training.

Class sizes are small and almost every course has weekly laboratories, taught by faculty members, where students learn to become biologists by making observations, asking questions, and designing and testing hypotheses. Our students read and evaluate primary research articles, write laboratory reports, and are given opportunities to make oral presentations.

The curriculum prepares students to pursue careers in research and the health sciences or to apply their biology interests to careers as diverse as science education and public health. Moreover, our undergraduates have an excellent record of acceptance into medical, dental and allied health professional schools. Faculty members are committed to helping students investigate career opportunities and pursue careers which most clearly match their interests and abilities.

Biology at PLU operates within the Rieke Science Center, which also houses the Departments of Chemistry, Geosciences and Physics. Thirteen teachers-scholars make up the biology faculty. All are full-time and all have a doctorate. Their research ranges from the responses of the host to bacterial infections and physiological processes and signaling pathways in the plant, to the evolutionary biology of North American catfishes and song divergence in North American Red Crossbills. Hands-on laboratory experience is central to any biology curriculum, and we invite students to use departmental facilities for independent study and work with faculty members in ongoing research.


Education in Microscopy and Digital Imaging

A transmitted light microscope will typically be of little use to anyone wanting to examine the structure of metallic samples, the surface of ceramics, integrated circuits, or printed paper documents. As a result, the reflected light microscope has been developed for these purposes. Reflected light microscopy is often referred to as incident light, epi-illumination, or metallurgical microscopy, and is the method of choice for fluorescence and for imaging specimens that remain opaque even when ground to a thickness of 30 micrometers. Much like the fluorescence microscope, in reflected brightfield microscopy the sample is illuminated from above through the objective. The Köhler illumination principle applies in cases where the objective with its pupil plane is also utilized as the condenser.

The range of specimens falling into this category is enormous and includes most metals, ores, ceramics, many polymers, semiconductors (unprocessed silicon, wafers, and integrated circuits), slag, coal, plastics, paint, paper, wood, leather, glass inclusions, and a wide variety of specialized materials. Because light is unable to pass through these specimens, it must be directed onto the surface and eventually returned to the microscope objective by either specular or diffused reflection. As mentioned above, such illumination is most often referred to as episcopic illumination, epi-illumination, or vertical illumination (essentially originating from above), in contrast to diascopic (transmitted) illumination that passes through a specimen. Several reflected light specimens are presented in Figure 1. The surface of an integrated circuit is shown using reflected light differential interference contrast ( DIC ) in Figure 1(a), while the jewel bearing of a watch mechanism captured in brightfield is presented in Figure 1(b). Darkfield is another useful reflected light technique, as evidenced by the image revealing surface structure of a superconducting wire cable in Figure 1(c). Finally, a magnetic thin film (Figure 1(d)) can be imaged using polarized reflected light microscopy to examine surface defects (blisters) that affect the homogeneity of the film.

Back to top ^ The Reflected Light Microscope

Today, many microscope manufacturers offer advanced models that permit the user to alternate or simultaneously conduct investigations using both vertical and transmitted illumination. A typical microscope configured for both types of illumination is illustrated in Figure 2 (the transmitted light source and optical pathway is not shown in this illustration). The optical pathway for reflected light begins with illuminating rays originating in the lamp housing for reflected light (the upper housing in Figure 2). This light next passes through the collector lens and into the vertical illuminator where it is controlled by the aperture and field diaphragms. After passing through the vertical illuminator, the light is then reflected by a beamsplitter (a half mirror or elliptically shaped first-surface mirror) through the objective to illuminate the specimen. Light reflected from the surface of the specimen re-enters the objective and passes into the binocular head where it is directed either to the eyepieces or to a port for photomicrography. Reflected light microscopy is frequently the domain of industrial applications, especially in the rapidly growing semiconductor arena, and thus represents a most important segment of microscopical studies.

A typical upright compound reflected light microscope has a viewing tube with two eyepieces (Figure 2) and often a trinocular tube head for mounting a conventional or digital/video camera system (not illustrated). Standard equipment eyepieces are usually of 10x magnification, and most microscopes are equipped with a nosepiece capable of holding four to six objectives. The stage is mechanically controlled with a specimen holder that can be translated in the x- and y- directions and the entire stage unit is capable of precise up and down movement with a coarse and fine focusing mechanism. Built-in light sources range from 20 and 100 watt tungsten-halogen bulbs to higher energy mercury vapor or xenon lamps that are used in fluorescence microscopy. Light passes from the lamphouse through a vertical illuminator interposed above the nosepiece but below the underside of the viewing tube head. The specimen's top surface is upright (usually without a coverslip) on the stage facing the objective, which has been rotated into the microscope's optical axis. The vertical illuminator is horizontally oriented at a 90-degree angle to the optical axis of the microscope and parallel to the table top, with the lamp housing attached to the back of the illuminator. The coarse and fine adjustment knobs raise or lower the stage in large or small increments to bring the specimen into sharp focus.

Inverted reflected light microscope stands incorporate the vertical illuminator within the body of the microscope. Many types of objectives can be used with inverted reflected light microscopes, and all modes of reflected light illumination may be possible: brightfield, darkfield, polarized light, differential interference contrast, and fluorescence. Some of the instruments include a magnification changer for zooming in on the image, contrast filters, and a variety of reticules. Because an inverted microscope is a favorite instrument for metallographers, it is often referred to as a metallograph . Manufacturers are largely migrating to using infinity-corrected optics in reflected light microscopes, but there are still thousands of fixed tube length microscopes in use with objectives corrected for a tube length between 160 and 210 millimeters.

On the inverted stand (similar in basic construction to the inverted tissue culture style microscope frames commonly employed in biology), the specimen is placed on the stage with its surface of interest facing downward. The primary advantage of this design is that samples can be easily examined when they are far too large to fit into the confines of an upright microscope (such as large rock samples and industrial materials). Also, only the side of the specimen facing the objectives need be perfectly flat. The objectives are mounted on a nosepiece under the stage with their front lenses facing upward towards the specimen and focusing is accomplished either by moving the nosepiece or the entire stage up and down.

In the vertical illuminator, light travels from the light source, usually a 12 volt 50 or 100 watt tungsten-halogen lamp, passes through collector lenses, through the variable aperture iris diaphragm opening and through the opening of a variable and centerable pre-focused field iris diaphragm. The light then strikes a partially silvered plane glass reflector, or strikes a fully silvered periphery of a mirror with elliptical opening for darkfield illumination. The plane glass reflector is partially silvered on the glass side facing the light source and anti-reflection coated on the glass side facing the observation tube in brightfield reflected illumination. Light is thus deflected downward into the objective. The mirrors are tilted at an angle of 45 degrees to the path of the light travelling along the vertical illuminator.

In reflected light microscopy, absorption and diffraction of the incident light rays by the specimen often lead to readily discernible variations in the image, from black through various shades of gray, or color if the specimen is colored. Such specimens are known as amplitude specimens and may not require special contrast methods or treatment to make their details visible. Other specimens show so little difference in intensity and/or color that their feature details are extremely difficult to discern and distinguish in brightfield reflected light microscopy. The latter specimens behave much like the phase specimens so familiar in transmitted light work, and are suited for darkfield and reflected light differential interference contrast applications.

Back to top ^ Objectives for Reflected Light Microscopy

The resolving power in reflected light is based on the same relationship between the wavelength of light and numerical aperture (the Abbe equation) as in transmitted light. Optical performance is achieved in reflected light illumination when the instrument is adjusted to operate under Köhler illumination. A function of Köhler illumination (aside from providing evenly dispersed illumination) is to ensure that the objective will be able to deliver excellent resolution and good contrast even if the source of light is a coiled filament lamp. In many cases, modern reflected light microscopes may also be operated using transmitted light because the parfocal length is maintained in all objectives.

Objectives for reflected light can be recognized by the Epi or similar inscription on the decorative outer barrel (see Figure 3). They differ from objectives for transmitted light in two ways. Reflected light objectives feature lens surfaces that are particularly well coated with anti-reflection layers to prevent the illuminator light from being reflected towards the eyepiece. Such reflections would be superimposed on the image and have a disturbing effect. The second difference is that these objectives are designed and optically corrected for specimens lacking a coverslip. The vast majority of samples in the materials sciences (where reflected light microscopes are most heavily used) are usually viewed without a cover slip. Therefore, higher numerical aperture objectives require a different optical computation than do transmitted light objectives.

Back to top ^ Reflected Light Microscope Illuminators

In reflected light microscopy, illuminating light reaches the specimen, which may absorb some of the light and reflect some of the light, either in a specular or diffuse manner. Light that is returned upward can be captured by the objective in accordance with the objective's numerical aperture. After entering the objective, light then passes through the partially silvered mirror (or in darkfield, through the elliptical opening). In the case of infinity-corrected objectives, the light emerges from the objective in parallel (from every azimuth) wavefronts projecting an image of the specimen to infinity. The parallel rays enter the tube lens, which forms the specimen image at the plane of the fixed diaphragm opening in the eyepiece ( intermediate image plane ). It is important to note, that in these reflected light systems, the objective serves a dual function. For light waves on the way down to the specimen, the objective serves as a matching well-corrected (always properly aligned) condenser. Alternatively, for waves reflected by the specimen, the objective serves as an image-forming optical system in the customary role of an objective projecting the image-carrying rays toward the eyepiece. Optimal performance is achieved in reflected light illumination when the instrument is adjusted to produce Köhler illumination (discussed below). A function of Köhler illumination (aside from providing evenly dispersed illumination) is to ensure that the objective will be able to deliver excellent resolution and good contrast even if the source of light is a coiled filament lamp.

Several modern reflected light illuminators are described as universal illuminators because, with several additional accessories and little or no dismantling, the microscope can easily be switched from one mode of reflected light microscopy to another. Often, reflectors can be removed from the light path altogether in order to permit transmitted light observation. Universal illuminators may include a partially reflecting plane glass surface (the half-mirror) for brightfield (see Figure 4(a)), and a fully silvered reflecting surface with an elliptical, centrally located clear opening for darkfield observation (Figure 4(b)). The best-designed vertical illuminators include collector lenses to gather and control the light, an aperture iris diaphragm and a pre-focused, centerable field diaphragm to permit the desirable Köhler illumination.

The vertical illuminator should also make provision for the insertion of filters for contrast, digital imaging, and photomicrography, as well as polarizers, analyzers, and compensator plates for polarized light and differential interference contrast ( DIC ) illumination. In vertical illuminators designed for use with infinity-corrected objectives, the illuminator may also include a tube lens. Affixed to the back end of the vertical illuminator is a lamphouse (Figure 2), which usually contains a tungsten-halogen lamp. For fluorescence work, the lamphouse can be replaced with a fitting containing a mercury burner. The lamp may be powered by the electronics built into the microscope stand, or in fluorescence, by means of an external transformer or power supply.

Back to top ^ Köhler Illumination in Reflected Light Microscopy

In a reflected light microscope vertical illuminator, the light source is positioned so that the tungsten-halogen lamp filament is located near the principal focal point of the collector lens. In Köhler illumination, the lamp collector lens serves the function of a dramatically enlarged secondary light source to enhance overall illumination. One of the primary requirements of Köhler illumination is that an image of the lamp filament must ultimately be projected onto the rear focal plane of the objective, which also doubles as the (often high numerical aperture) condenser during excitation in reflected light illumination. The light source should ideally fill the entire objective aperture to both maximize the intensity of radiation and to produce an evenly illuminated field. In many cases, a ground glass filter is placed into the vertical illuminator between the lamphouse and the neutral density filters in order to increase the uniformity of illumination. However, because diffusion filters also reduce the level of illumination, they should be avoided whenever possible.

In reflected light Köhler illumination (illustrated schematically in Figure 5), an image of the light source is focused by the collector lens onto the aperture iris diaphragm located in the vertical illuminator. This diaphragm shares a conjugate plane with the rear aperture of the objective and the lamp filament, and therefore, determines the illuminated field aperture size. Together, the light source, vertical illuminator aperture diaphragm, and objective rear focal plane (pupil) form the illumination set of conjugate planes. Unlike the situation in transmitted light microscopy, the aperture iris and light source are imaged onto the objective (acting as a condenser) rear aperture plane, rather than being physically located at this position. As an added benefit to this configuration, all obstructions (such as iris diaphragms) are removed from the light path. Opening or closing the aperture diaphragm is used to control stray light and regulate the intensity (numerical aperture) of illumination without altering the size of the illuminated field. In the image, adjustment of the aperture diaphragm affects brightness and contrast.

The image-forming or field set of conjugate planes in reflected light Köhler illumination consists of the field diaphragm, the specimen surface, and the intermediate image plane. Thus, when the field diaphragm is placed in focus at the specimen plane, the image of the light source is significantly removed from focus in order to provide a uniform field of illumination. The field diaphragm controls the size of the illuminated field without affecting the illumination intensity of the area being observed. In practice, the field diaphragm opening size should be as small as possible in order to increase image contrast. Köhler illumination produces even illumination of the specimen field in spite of the uneven illumination intensity generated by most filament-based light sources. When the microscope is properly configured, the rear focal plane of the objective is fully illuminated, providing a field that is uniformly bright from edge to edge. Köhler illumination, in the ideal case, bathes the specimen with a converging set of wavefronts, each arising from separate points on the light source imaged into the condenser aperture. In a properly configured reflected light microscope, the result is optimum image contrast and resolution.

Back to top ^ Brief Overview Contrast Modes in Reflected Light Microscopy

Due to the fact that the objective serves a dual purpose (also performing as a condenser) in reflected light microscopy (refer to Figure 6(a)), there is sufficient room to introduce auxiliary components into the infinity space occupied by the parallel bundle of light wavefronts traveling from the objective rear aperture to the tube lens (termed the observation side of the optical train see Figure 6(a)). In addition, polarizing or filter components can be inserted into the vertical illuminator before light enters the objective (termed the optical train illumination side ). Many modern microscopes also provide additional space for components that affect both light paths. This space is usually built as a slot in the objective nosepiece where a slider containing either a filter or polarizer can be easily inserted.

Several techniques are commonly employed to introduce contrast in reflected light microscopy, including darkfield illumination, polarized light, and differential interference contrast. In reflected darkfield microscopy, which is an ideal methodology for exploring the relief in surfaces of materials, wavefronts from the vertical illuminator are directed toward the objective using a specialized mirror assembly that contains an oval opening (see Figure 4 and Figure 6(b)). This light passes through an outer sleeve in the microscope objective and impacts on a ring-shaped concave mirror, which directs the wavefronts at a highly incident angle onto the specimen surface. In cases where the specimen acts as a perfect mirror (in effect, there are no relief features on the surface), there is no light reflected back into the objective from the specimen and the image remains dark. Areas where relief contours exist, however, direct light back into the objective front lens and are observed as being bright features against a very dark background. Note that in darkfield reflected light microscopy, the field and aperture diaphragms in the vertical illuminator should be opened to their widest points so that the light beam illuminating the mirror assembly is not partially blocked.

Polarized reflected light microscopy (Figure 6(c)) is a technique that is suitable for examining surfaces containing structures that alter the state of polarization during the reflection process. For example, structural grains in ore samples and a number of metallic alloys and thin films can be readily examined using this method. In the optical configuration outlined in Figure 6(c), the illuminating wavefronts encounter a polarizer that is placed in the vertical illuminator before the mirror unit that directs light into the objective. The linearly polarized light waves are focused onto the specimen surface and reflected back into the objective. After leaving the objective aperture as a parallel bundle of wavefronts, the light is then projected onto a second polarizer (the analyzer ) oriented at 90 degrees with respect to the polarizer. Only the depolarized wavefronts are able to pass through the analyzer to reach the tube lens. An auxiliary lambda plate can also be inserted just prior to the analyzer in the optical train to examine the sign of birefringence (changing gray to color contrast). This method is sometimes referred to as sensitive tint . In cases where objectives of very low magnification are used in reflected polarized light, a rotatable optical plate (termed an Antiflex cap ) consisting of a one-quarter wavelength lambda plate is placed on the objective front lens element to block reflections from the objective itself. The Antiflex method is also particularly useful when the specimen has very low reflectivity, such as would be observed in coal samples.

One of the most powerful techniques for introducing contrast into reflected light imaging is differential interference contrast, which allows the visualization of minute elevation differences in surfaces. In the optical configuration (Figure 6(d)), a birefringent prism (also known as a Wollaston or Nomarski prism, depending upon design) is placed in the infinity space just above the objective and a polarizer is installed in the vertical illuminator (similar to polarized light). The prism splits the polarized light wavefronts into two orthogonal polarized beams on their way to the specimen. These perpendicular light beams impact the specimen to create a lateral displacement in regions where surface relief exists. If the surface is completely flat, no features are observed. However, if there is, for example, a small step (see Figure 6(d)) between the two wavefronts, one of the beams must travel a path that is longer and is assigned this path difference. Once the parallel beams have returned to the microscope after passing back through the objective and prism, they pass through a second polarizer (the analyzer) where interference produces an intermediate image where path differences are translated into gray values that can be seen by the eye. Similar to polarized light microscopy, a lambda plate can be positioned beneath the analyzer to shift gray values into colored hues.

Contributing Authors

Rudi Rottenfusser - Zeiss Microscopy Consultant, 46 Landfall, Falmouth, Massachusetts, 02540.

Erin E. Wilson and Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.