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1.11 : Cas de paternité avec électrophorèse - Biologie

1.11 : Cas de paternité avec électrophorèse - Biologie


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Objectifs d'apprentissage

Buts:

  • Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose sur des échantillons.
  • Apprenez à analyser les empreintes génétiques.

Résultats d'apprentissage des élèves :

À la fin de ce laboratoire, les étudiants seront capables de :

  • Séparer les molécules par électrophorèse.
  • Analyser les bandes résultant de l'électrophorèse sur gel.
  • Déterminer la paternité de la progéniture en utilisant l'analyse des empreintes digitales ADN.

Partie I : Électrophorèse sur gel d'agarose

Introduction

L'électrophorèse sur gel est une technique très courante et utile pour séparer les molécules d'ADN, d'ARN et de protéines sur la base de la taille et de la charge moléculaires. L'agarose est un polysaccharide, présent dans les algues, qui forme une matrice de gel (maillage de trous de différentes tailles). Lorsqu'un courant électrique traverse le tampon et le gel, les molécules de l'échantillon se déplacent vers l'électrode avec la charge opposée. Les molécules d'ADN, d'ARN et de protéines ont généralement une charge globale négative et se déplaceront vers l'électrode positive. Les molécules plus petites peuvent se déplacer à travers la matrice du gel plus rapidement que les molécules plus grosses.

Les empreintes génétiques utilisent des modèles de bandes qui résultent d'un traitement spécifique d'échantillons d'ADN pour identifier la relation entre un échantillon et des échantillons de référence. Dans ce laboratoire, vous exécuterez une simulation d'une activité d'empreintes génétiques afin de vous familiariser avec ce processus. Vous chargerez des échantillons sur un gel et séparerez les bandes dans chaque échantillon pour créer des motifs spécifiques à l'aide d'une électrophorèse sur gel.

Préparation des gels d'agarose

Il existe différents tampons courants qui peuvent être utilisés pour séparer l'ADN. Quelques-uns des tampons couramment utilisés sont appelés TAE (Tris Acetate EDTA), TBE (Tris Borate EDTA) et SB (Sodium Borate). Utilisez toujours le même tampon pour faire le gel d'agarose et exécuter l'électrophorèse.

MATÉRIAUX

  • Poudre d'agarose
  • Spatule
  • Bateau de pesée
  • 20x stock
  • Cylindres gradués
  • PipetAid
  • Pipette sérologique
  • Flacon avec bouchon ventilé

ÉQUIPEMENT

  • Équilibre
  • Four micro onde

PROCÉDURE

  1. Préparer 500 ml de tampon borate de sodium 1X à partir d'une solution mère 20X.
    1. Mesurer 25 ml de solution tampon de borate de sodium 20X dans un cylindre gradué de 25 ml et verser dans un récipient de 500 ml.
    2. Mesurer 475 ml d'eau DI dans un cylindre gradué de 500 ml et verser dans le même récipient.
    3. Fermez bien et mélangez.
  2. Préparez 50 ml d'agarose à 0,8 % (p/v) dans du tampon borate de sodium 1X verser quatre gels Mini One. Notez que l'agarose (et la gélatine) sont deux substances qui sont préparées d'une manière spéciale, car elles ne peuvent se dissoudre que dans les liquides bouillants. Ainsi, nous ne mettons JAMAIS de poudre d'agarose (et de gélatine) dans des cylindres gradués. Au lieu de cela, nous versons la poudre dans le récipient final (fiole Erlenmeyer).
    1. Mesurer 50 ml de tampon 1X avec une éprouvette graduée de 50 ml et verser dans un erlenmeyer.
    2. Mesurer 0,4 g de poudre d'agarose et verser dans le même flacon. Cela ressemblera à une suspension opaque.
    3. Utilisez un capuchon ventilé si possible (ou pas de capuchon). Placez le ballon dans un four à micro-ondes et allumez (pendant 1 minute) à réglage élevé. Surveillez attentivement - ne laissez pas le liquide déborder !
    4. Surveillez le bouillonnement du liquide. Dès que le liquide commence à bouillonner, arrêtez le micro-ondes, utilisez des mitaines ou des « mains chaudes » en silicone pour faire tournoyer la fiole 2-3 fois.
    5. Ensuite, remplacez et rallumez le micro-ondes pour la deuxième ébullition.
    6. Dès que le liquide commence à bouillonner, arrêtez le micro-ondes, utilisez des mitaines ou des « mains chaudes » pour tenir le flacon contre le plafonnier. Recherchez attentivement les taches ou les cristaux dans le liquide. Lorsqu'il n'y a plus de taches visibles dans la solution claire, l'agarose a complètement fondu.
    7. Placer le flacon sur la table et laisser refroidir à 60oC. Lorsque vous êtes d'abord capable de tenir le flacon à mains nues, l'agarose est suffisamment froid pour être versé dans des plateaux. Ne versez pas d'agarose trop chaud, car les gels de coulée se déformeront et crépiteront. Ne laissez pas refroidir l'agarose trop longtemps, car le gel ne polymérisera pas uniformément.
    8. Préparez les plateaux de coulée et entraînez-vous à charger des échantillons de gel pendant que vous attendez.

Gels d'agarose à couler (SYSTÈME DE GEL MINI ONE EMBITEC)

  1. Placez deux plateaux de coulée en acrylique transparent dans le support de coulée blanc.
  2. Insérez le peigne à 9 puits dans la fente appropriée du support de coulée.
  3. Il est préférable d'utiliser un Pipet-Aid et une pipette sérologique de 25 ml pour mesurer et transférer 12,5 ml de solution d'agarose fondue dans chaque plateau de coulée. Ou versez une solution d'agarose jusqu'au 1/3 du peigne.
  4. Déplacez ou éclatez rapidement les bulles d'air avec une pointe de pipette ou un peigne à gel. Insérez le peigne à gel dans la fente appropriée.
  5. Ne déplacez pas et ne heurtez pas le plateau de gel jusqu'à ce que le gel se soit solidifié en 15 minutes environ.
  6. Conservez la solution d'agarose supplémentaire dans un flacon, recouvert de parafilm ou d'un capuchon, à 4 oC pour une utilisation ultérieure.

Entraînez-vous à charger des échantillons de gel

Le chargement d'échantillons de gel est une compétence qui demande de la pratique pour apprendre ! Le gel d'agarose que vous allez utiliser pour l'électrophorèse est très délicat et peut facilement être perforé. Le gel d'entraînement ne peut pas être perforé, mais fournit des puits de la même taille pour distribuer vos échantillons. Comme l'ADN est clair, un colorant de charge coloré est généralement ajouté aux échantillons d'ADN. Du glycérol haute densité est également ajouté au colorant de charge, de sorte que les échantillons d'ADN tombent rapidement au fond du puits.

Astuce de laboratoire : Lors du chargement des échantillons dans les puits de gel, poussez uniquement le piston de la micropipette jusqu'à la première butée, ne poussez PAS jusqu'à la deuxième butée. Assurez-vous de maintenir votre pouce enfoncé sur le piston jusqu'à ce que la micropipette soit complètement sortie du réservoir tampon.

  1. Procurez-vous un gel d'uréthane pratique.
  2. Couvrir le gel avec de l'eau déminéralisée. S'il y a des bulles dans les puits, utilisez une pipette de transfert en plastique pour éliminer les bulles.
  3. Utilisez une pointe de pipette sur une micropipette P20 et réglez le cadran sur 10,0 ul.
  4. Pousser et maintenir le piston de la micropipette jusqu'à la première butée.
  5. Prenez 10 µL du colorant rouge d'entraînement et relâchez lentement votre pouce.
  6. Tenez la micropipette verticalement (voir Figure 1) sur le gel de pratique, de telle sorte que la pointe soit en dessous du niveau de l'eau et juste au-dessus du puits. Il n'est pas nécessaire que la pointe pénètre dans le puits, car le glycérol lourd tirera l'échantillon vers le bas dans le fond du puits.
  7. Poussez le piston jusqu'au PREMIER ARRÊT uniquement et gardez votre pouce là. (Facultatif : essayez d'appuyer jusqu'au deuxième arrêt pour voir ce qui se passe.)
  8. Déplacez tout votre bras vers le haut, de sorte que la micropipette soit hors de l'eau, puis laissez votre pouce se détacher du piston. (Facultatif : essayez de relâcher votre pouce pendant que la pipette est encore dans l'eau pour voir ce qui se passe).
  9. Entraînez-vous à charger 10,0 µL de colorant rouge dans trois puits ou plus du gel d'entraînement.
  10. Vous devriez pouvoir voir l'échantillon coloré descendre au fond des puits.

Astuce de laboratoire : Si cela est fait correctement, tout l'échantillon restera dans le puits. Vérifiez s'il y a un colorant coloré flottant loin du sommet du puits, ce qui signifie que l'échantillon peut contaminer un autre puits. Vérifiez s'il y a une fuite de colorant au fond du puits, ce qui signifie que vous avez percé le puits et que l'échantillon ne peut pas entrer dans le gel.

PARTIE II : Cas de paternité : Qui est le père de mes chatons ?

Mary a un chat blanc nommé « Honey » qui a été perdu pendant deux jours il y a environ trois mois. Elle a maintenant quatre chatons (photo 1) et Marie veut savoir si les deux chats voisins, « Tom » ou « Butch », pourraient être le père de chaque chaton. Pour analyser leur empreinte ADN, Mary a collecté les follicules pileux de chaque chat et chaton adultes, extrait l'ADN et amplifié l'ADN à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase.

Hypothèse

A l'aide de la photo, complétez le tableau 1 avec votre prédiction du père de chaque chaton.

Tableau 1. Hypothèse sur la paternité des chatons

Chaton

Père potentiel

Raisonnement

Crème

mélasse

Gingembre

Sucre

Matériaux

Réactifs

  • Gel d'agarose pré-coulé à 0,8%
  • Sept échantillons dans des tubes à centrifuger. Un pour chaque félin
  • 135-150 ml de tampon de borate de sodium 1X (assez pour immerger le gel d'agarose)

Équipement et fournitures

  • Système d'électrophorèse tel que MiniOne ou autre marque avec la chambre de gel et l'alimentation
  • Micropipettes P-20 et embouts appropriés
  • Téléphone portable ou appareil photo pour photographier le gel pour documenter les résultats

Procédure

  1. REMARQUE : ce qui suit est terminé lorsque la chambre d'électrophorèse a été préparée avec un gel d'agarose à 0,8 % et un tampon de borate de sodium 1x dans la chambre. N'oubliez pas de documenter votre procédure de manière appropriée dans votre cahier de laboratoire.
  2. Obtenez les « échantillons d'ADN » - il y a sept tubes de microcentrifugation étiquetés P-V.
  3. À l'aide d'une micropipette P-20 et d'une pointe de pipette, mesurer 10 µL du tube P et transférer dans le premier puits du gel d'agarose. Assurez-vous de suivre l'ordre de chargement du gel noté dans la colonne 1 - bien.
  4. En utilisant une nouvelle pointe pour chaque échantillon, transférez 10 µL de chaque échantillon dans de nouveaux puits du gel.
  5. Assurez-vous de garder une trace du chargement de votre échantillon, si vous ne suivez pas le tableau ci-dessous. S'il y a eu des problèmes avec le chargement (gel perforé, pas assez d'échantillon), assurez-vous d'écrire dans la colonne REMARQUE.
Tableau 2. Remarques sur le chargement : Incluez tout écart ou note dans votre cahier de laboratoire

bien

Tube

Échantillon d'ADN 10µL

Remarques pour le chargement

1

P

Tom (homme)

2

Q

Crème (chaton)

3

R

Mélasse (chaton)

4

S

Miel (femelle)

5

T

Gingembre (chaton)

6

U

Sucre (chaton)

7

V

Butch (mâle)

  1. Si vous utilisez un système d'électrophorèse MiniOne, faites fonctionner le gel pendant 15 minutes, jusqu'à ce que les bandes de couleur se séparent. Si vous utilisez un autre système d'électrophorèse, faites fonctionner le gel à 135 V jusqu'à ce que le front du colorant soit.
  2. Pour une meilleure visualisation des résultats, retirez le plateau de coulée (avec gel) du réservoir tampon, faites glisser le gel sur un papier laminé blanc, étiquetez les échantillons (et le nom de votre équipe) et prenez une photo.
  3. Étant donné que les échantillons d'ADN diffuseront à travers les gels d'agarose, vous devez toujours enregistrer les résultats rapidement une fois l'électrophorèse désactivée.

UNE ANALYSE

  1. Utilisez des crayons de couleur pour enregistrer les motifs de bande (colorez les blocs appropriés) dans le tableau de données ci-dessous.
Tableau 3. Bandes colorées « ADN » séparées par électrophorèse sur gel d'agarose

Tube

P

Q

R

S

T

U

V

Bande

À M (Homme)

Crème

mélasse

Chéri(Femelle)

Gingembre

Sucre

Hommasse (Homme)

Bleu #1

Bleu #2

Rose #1

Violet #1

Jaune #1

Jaune #2

  1. Examinez attentivement chaque bande des quatre échantillons de chaton et déterminez si la bande correspond à Tom, Honey ou Butch. Pour les échantillons de chatons (colonnes QRTU) dans le tableau de données 3, écrivez (à l'intérieur des blocs de couleur) qui correspond à cette bande - Tom, Honey ou Butch.
  2. Tirez vos conclusions sur la base des « preuves ADN ».
  3. Remplissez les 2e et 3e colonnes du tableau 4 ci-dessous. Comparez votre hypothèse dans le tableau 1 où vous avez deviné le père pour chaque chaton sur la base des apparences à votre conclusion concernant le père sur la base des preuves ADN. Votre hypothèse était-elle correcte pour chaque chaton ?
  4. Quelle est la preuve spécifique qui justifie votre conclusion en déterminant le père de chaque chaton ? Remplissez vos réponses à ces questions dans le tableau ci-dessous.
Tableau 4. Comparaison des hypothèses et des conclusions étayées par des preuves expérimentales

CHATON

PÈRE basé sur le visuel

PÈRE basé sur l'ADN

Preuve

Crème

mélasse

Gingembre

Sucre

Questions d'étude

  1. Lors de l'électrophorèse sur gel, l'ADN va migrer vers quelle électrode ?
  2. Si vous aviez des molécules d'ADN petites, moyennes, longues et extra longues, lesquelles seraient les plus proches du fond du gel après électrophorèse ?
  3. Que savez-vous du modèle de bandes qui résultent d'une progéniture en ce qui concerne la mère et le père ?
  4. Si vous exécutiez une analyse d'empreintes génétiques mais que le motif de bande de la progéniture ne correspondait à aucun des parents, que concluriez-vous ?



Commentaires:

  1. Verdell

    Je suis d'accord avec tout ce qui précède.

  2. Bourn

    L'idée est bonne, vous êtes d'accord.

  3. Ros

    il est possible d'argumenter à l'infini.

  4. Teshakar

    À mon avis, quelqu'un est resté coincé ici



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