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4.1 : Purification des protéines - Biologie

4.1 : Purification des protéines - Biologie


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Dosages, activité spécifique, fractionnement initial

Une procédure de purification de protéines réussie peut être tout simplement incroyable. Que vous commenciez avec une protéine recombinante qui est produite dans E. coli, ou en essayant d'isoler une protéine d'un tissu de mammifère, vous commencez généralement avec des quantités en grammes d'un mélange complexe de protéines, d'acides nucléiques, de polysaccharides, etc. à partir desquels vous devrez peut-être extraire des quantités de milligrammes (ou microgrammes !) de la protéine souhaitée à haute pureté et, espérons-le, avec un rendement élevé.

La première étape de toute purification est le développement d'un dosage spécifique pour la protéine d'intérêt. Le dosage spécifique peut être basé sur certains caractéristique unique de la protéine d'intérêt

  • Activité enzymatique
  • Activité immunologique
  • Caractéristiques physiques (par exemple, masse moléculaire, propriétés spectroscopiques, etc.)
  • Activité biologique
  • Idéalement, un essai devrait être
    • Spécifique (vous ne voulez pas de faux positif)
    • rapide (vous ne voulez pas attendre une semaine pour les résultats)
    • sensible (vous ne voulez pas consommer tout votre échantillon pour le doser)
    • quantitatif (vous avez besoin d'un moyen précis pour mesurer la quantité de votre protéine à chaque étape de la purification)

Western blot

Les anticorps peuvent être utilisés dans une méthode appelée Western blot, qui est utile pour déterminer les niveaux d'expression des protéines et pour doser les protéines pendant la purification. Cette méthode comprend généralement les étapes suivantes :

  1. Un échantillon de protéine est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
  2. Après cela, le gel est placé sur une feuille de nitrocellulose et la protéine dans le gel est transférée par électrophorèse sur la nitrocellulose.
  3. La nitrocellulose est ensuite trempée dans de la gélatine pour « bloquer » sa capacité à se lier de manière non spécifique aux protéines.
  4. La nitrocellulose est ensuite incubée avec l'anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.
  5. La nitrocellulose est ensuite incubée avec un deuxième anticorps spécifique du premier anticorps. Par exemple, si le premier anticorps a été produit chez des lapins, le deuxième anticorps pourrait être appelé "immunoglobuline de chèvre anti-lapin". Cela signifie que les immunoglobulines de lapin ont été utilisées pour déclencher une réponse en anticorps chez les chèvres. Les anticorps de chèvre (polyclonaux) comprendront ceux qui reconnaissent la région conservée dans les anticorps de lapin. Étant donné que la région Fc est conservée, elle se liera à tous les anticorps de lapin, y compris ceux présents sur le papier de nitrocellulose.
  6. Le second anticorps aura typiquement une enzyme liée de manière covalente qui, lorsqu'elle est pourvue d'un substrat chromogène, provoquera une réaction colorée.
  7. Ainsi, le poids moléculaire et la quantité de la protéine souhaitée peuvent être caractérisés à partir d'un mélange complexe (par exemple un extrait cellulaire brut) d'autres protéines.

Dans une variante de ce qui précède, l'échantillon de protéine peut être transféré directement sur un papier de nitrocellulose (appelé un tache de point) sans d'abord exécuter un gel. Cela peut être souhaitable si, par exemple, l'anticorps est monoclonal et reconnaît un épitope qui dépend de la structure native (qui serait détruite lors de l'exécution d'une SDS PAGE).

En plus de leurs utilisations variées, les anticorps peuvent également être utilisés pour purifier des protéines.

  • Si des quantités relativement importantes d'un anticorps peuvent être obtenues, elles peuvent être fixées de manière covalente à une résine de chromatographie (par exemple des billes de Sephadex).
  • Si un extrait cellulaire brut est passé sur une telle colonne, seule la protéine d'intérêt devrait se lier et tout le reste passera.
  • La protéine liée peut ensuite être éluée. Ceci est généralement obtenu par des conditions de pH modérément bas (en utilisant de l'acide acétique). Tant que la protéine d'intérêt n'est pas irréversiblement dénaturée par de telles conditions, la méthode fonctionnera assez bien.
  • Un écueil potentiel implique celui des anticorps monoclonaux utilisés pour purifier les protéines mutantes. Les régions de la protéine comprenant l'épitope ne peuvent pas être modifiées sans détruire la capacité de l'anticorps à se lier. Ainsi, l'utilisation d'anticorps monoclonaux dans un schéma de purification peut empêcher son utilisation dans la purification de certains mutants.

La purification des protéines peut être considérée comme une série de étapes de fractionnement conçu de telle sorte que :

  • La protéine d'intérêt se trouve presque exclusivement dans une fraction (et avec un bon rendement)
  • Une quantité importante de contaminants peut être trouvée dans une fraction différente

Pendant la purification, vous devrez surveiller plusieurs paramètres, notamment :

  1. Volume d'échantillon total
  2. Protéine totale de l'échantillon (peut être estimé par A280; 1,4 ~ 1,0 mg/ml)
  3. Unités d'activité de la protéine désirée (basé sur un dosage spécifique)

Ces informations de base vous permettront de garder une trace des informations suivantes lors de chaque étape de purification :

  1. % rendement pour chaque étape de purification
  2. Activité spécifique de la protéine désirée (unités/mg de protéine totale)
  3. Amélioration de la purification de chaque étape (par exemple « purification 3,5 x)

Lors de la conception d'un schéma de purification, vous devez généralement équilibrer purification avec rendement.

  • Par exemple, il peut être relativement simple d'obtenir un matériau pur à 90 % avec un bon rendement.
  • Cependant, il peut être difficile d'améliorer cette pureté de quelques centiles supplémentaires avec un bon rendement.
  • L'application prévue de la protéine purifiée détermine la pureté cible.
  • Si la protéine doit être utilisée pour déterminer les informations de séquence d'acides aminés, peut-être 90 % est acceptable. Cependant, si le matériau doit être utilisé dans des essais cliniques, 99,99+% peut être la pureté cible.

Les premières étapes de la purification

Figure 4.1.1 : Étapes de purification

  • Il est extrêmement utile d'avoir des informations non seulement sur les caractéristiques physiques et chimiques générales de la protéine que vous essayez de purifier, mais aussi sur la contaminer Composants.
  • Par exemple, de nombreux E. coli les protéines sont généralement faible poids moléculaire (<50 000 Da) et un peu acide en point isoélectrique

Habituellement, les étapes initiales de la purification utilisent des différences physiques et/ou chimiques générales entre les protéines solubles et d'autres composants cellulaires.

  • Par exemple, les protéines solubles peuvent être séparées des débris cellulaires généraux et des cellules intactes, par centrifugation.
  • Ainsi, les cellules sont physiquement perturbées (via l'homogénéisation ou une presse à cellules) pour permettre la libération du contenu cellulaire. Ceci est ensuite suivi d'une centrifugation pour séparer les composants généralement solubles de ceux qui sont insolubles.
  • C'est à ce stade que commence la collecte des données afin de suivre la purification.

Les acides nucléiques peuvent parfois être facilement éliminés de l'échantillon par l'ajout de gros composés cationiques tels que polyéthylène imine, ou sulfate de streptomycine.

  • Les acides nucléiques se lient à ces composés via des interactions électrostatiques et le complexe précipite et peut être éliminé par centrifugation.
  • Le même résultat général peut être obtenu en mélangeant dans des résines échangeuses d'ions qui sont échangeurs d'anions (c'est-à-dire que les résines contiennent des groupes cationiques), puis filtrer ou centrifuger pour éliminer. Comme avec l'une ou l'autre méthode, il faut confirmer que la protéine désirée est ne pas lié aussi.

Les fractionnements bruts de protéines peuvent être obtenus en ajoutant diverses quantités de précipitants tels que sulfate d'ammonium, ou polyéthylène glycol (CHEVILLE).

  • Pour ce type d'étape de purification, une première expérience est réalisée pour surveiller la fraction de protéine globale, ainsi que la protéine souhaitée, restant en solution (et en culot) en fonction de la concentration en précipitant.

Sulfate d'ammonium (% saturé)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Échantillon A280

1000

900

600

200

100

75

50

40

25

20

Dosage d'activité (unités)

200

200

200

190

170

100

30

5

0

0

Figure 4.1.2 : Activité protéique en fonction de la concentration en précipitant

  • Dans cet exemple particulier, nous avons de la chance : à environ 30% de sulfate d'ammonium, nous pouvons précipiter environ 80% de la concentration totale de protéines dans notre échantillon, mais notre test d'activité pour notre protéine souhaitée indique qu'environ 95% de notre protéine souhaitée est encore soluble .
  • À 80 % de sulfate d'ammonium, toutes nos protéines désirées ont précipité. Ainsi, à partir de ces résultats, nous ferions ce qui suit :
  1. Ajouter du sulfate d'ammonium à notre échantillon à une concentration de 30% de saturation
  2. Centrifuger et jeter le culot
  3. Ajouter du sulfate d'ammonium à 80% de saturation
  4. Centrifuger et conserver le culot. Remettre en suspension le culot dans un tampon pour solubiliser la protéine.
  • Nous nous attendrions à une purification d'environ 5 fois avec un rendement d'environ 95 %.

Chromatographie sur colonne - Échange d'ions ; Dialyse et concentration

Chromatographie sur colonne

Après les premières étapes de fractionnement, la procédure typique consiste à passer à chromatographie sur colonne.

  • Dans la chromatographie sur colonne, nous avons un tube en verre (colonne) qui est rempli d'un matériau ("résine") qui a certaines caractéristiques physiques/chimiques.
  • Ces caractéristiques lui permettent d'interagir de diverses manières avec différentes protéines.
  • Certains types courants de résines chromatographiques comprennent :
  1. Échange d'ion
  2. Hydrophobe
  3. Filtration sur gel
  4. Affinité

Échange d'ion

Les résines échangeuses d'ions contiennent groupes payants.

  • Ceux-ci peuvent être acide dans la nature (auquel cas la résine est une cation échangeur)
  • ou de base (auquel cas il s'agit d'un anion échangeur).
  • Les échangeurs de cations et d'anions peuvent être décomposés en faible et fort échangeurs (reflétant l'affinité de liaison).

Type d'échangeur

Groupe fonctionnel

Nom commun

Échangeur de cations faibles

carboxyméthyle

CM cellulose/séphadex

Échangeur de cations fort

sulfopropyle

SP séphadex

Échangeur d'anions faible

diéthylaminoéthyle

DE cellulose/séphadex

Échangeur d'anions puissant

amine quaternaire

Séphadex QAE

  • Habituellement, les échantillons sont chargés sous faible force ionique conditions et le matériau lié est élué en utilisant soit une élution par étapes ou un gradient de tampon avec force ionique plus élevée.
  • D'une manière générale, une protéine se lie à une résine échangeuse de cations si le pH du tampon est inférieur au point isoélectrique (pI) de la protéine, et se liera à une résine échangeuse d'anions si le pH est supérieur au pI.

Graphique 4.1.3 : Liaison des protéines aux résines

  • La connaissance du pI de la protéine est donc utile pour concevoir un protocole de purification utilisant des résines échangeuses d'ions (cependant, vous pouvez toujours essayez simplement différentes résines pour voir laquelle fonctionne le mieux).

D'une manière générale, les colonnes échangeuses d'ions sont de dimensions courtes et épaisses.

Élution de protéines à partir de résines échangeuses d'ions

  • Les protéines liées aux résines échangeuses d'ions sont liées via des interactions ioniques non covalentes (pont salin). Nous pouvons rivaliser pour ces sites de liaison ionique sur la résine avec d'autres groupes ioniques, à savoir, sels
  • Il existe deux types généraux de méthodes lors de l'élution avec une solution saline : 1. Pente élution et 2. Étape élution
  • Une élution en gradient fait référence à une transition en douceur de la concentration en sel (de faible à élevée) dans le tampon d'élution. Les protéines à liaison faible sont éluées en premier et les protéines à liaison plus fortes sont éluées en dernier (c'est-à-dire qu'elles nécessitent des concentrations de sel plus élevées dans le tampon pour les faire sortir de la colonne)
  • Un gradient de concentration en sel peut être réalisé à l'aide d'un fabricant de dégradé. Dans sa forme la plus simple, cela se compose de deux conteneurs (doit avoir la même forme) relié par un siphon (ou tube en bas). Un conteneur contient le tampon à faible teneur en sel et l'autre contient un tampon à haute teneur en sel. Le tampon est retiré du conteneur à faible teneur en sel :

Graphique 4.1.4 : Créateur de dégradé

  • Cela produira un gradient linéaire de faibles à fortes concentrations de sel sur le volume total du gradient

Graphique 4.1.5 : Concentration et volume de sel

  • Si nous connaissons la plage de concentration de sel sur laquelle une protéine d'intérêt sera éluée, nous pouvons simplement éluer avec un tampon contenant cette concentration de sel. Ceci est connu comme un étape d'élution.
  • Les élutions par étapes sont généralement plus rapides à exécuter et éluent la protéine dans un volume global plus petit qu'avec les élutions en gradient. Ils fonctionnent généralement mieux lorsque les contaminants éluent à une concentration en sel significativement différente de celle de la protéine d'intérêt

Graphique 4.1.6 : Étape d'élution

Notez qu'après la chromatographie d'échange d'ions, la protéine d'intérêt sera dans un tampon avec une concentration en sel potentiellement élevée. Ceci doit être pris en compte avant de passer à l'étape suivante du schéma de purification

Dialyse

  • Après une étape de précipitation au sulfate d'ammonium, ou une étape de chromatographie échangeuse d'ions, la protéine d'intérêt peut être dans un tampon à haute teneur en sel. Cela peut être indésirable pour plusieurs raisons. Comment éliminer le sel de notre échantillon ?
  • L'une des méthodes les plus courantes est celle de dialyse
  • La méthode de dialyse utilise membranes semi-perméables. Dans l'exemple le plus simple, cette membrane est fabriquée sous forme de tube (ressemblant beaucoup à un boyau de saucisse)
  • La principale caractéristique de cette membrane est qu'elle est poreuse. Cependant, la taille des pores est telle que, alors que les petits ions de sel peuvent traverser librement la membrane, les molécules de protéines plus grosses ne le peuvent pas (c'est-à-dire qu'elles sont retenues). Ainsi, les membranes de dialyse sont caractérisées par la masse moléculaire de la plus petite protéine globulaire typique qu'elle retiendra.
  • C'est ce qu'on appelle communément le couper de la tubulure (par exemple, la tubulure de dialyse Spectrapore n° 6 a un seuil de coupure de 1 000 daltons, ce qui signifie qu'une protéine de 1 000 daltons sera retenue par la tubulure mais que des solutés de masse moléculaire plus petite passeront à travers la tubulure)
  • La dialyse se déroule en plaçant un échantillon à haute teneur en sel dans un tube de dialyse (c'est-à-dire le « sac » de dialyse) et en le plaçant dans le tampon à faible teneur en sel souhaité :

Graphique 4.1.7 : Dialyse

  • Au fil du temps, la concentration de solutés de faible masse moléculaire dans le sac et dans le tampon à faible teneur en sel viendra atteindre l'équilibre. En termes pratiques (pour le cas ci-dessus), les molécules de sel diffuseront hors du sac dans le tampon à faible teneur en sel :

Graphique 4.1.8 : Diffusion de sel

  • A l'équilibre, la concentration en sel de l'échantillon peut être calculée comme suit :

$$frac {(échantillon : volume) imes (échantillon : sel : concentration) + (tampon : volume) imes (tampon : sel : concentration)}{total :volume} = final :sel : concentration$$

Noter

Souvent, la concentration en sel tampon est de 0 M

  • Le volume tampon pour la dialyse est fonction de la concentration finale de sel requise dans l'échantillon

Exemple 4.1.1 :

Exemple de dialyse

Nous avons un échantillon de 10 ml de protéine provenant d'un pool d'élution de colonne échangeuse d'ions qui contient 1,0 M de NaCl. Pour notre prochaine étape dans la purification, nous ne pouvons pas avoir plus de 1 mM de NaCl dans l'échantillon.

Par conséquent, le volume de tampon requis serait (vol total - volume d'échantillon) = 9,990 L (ou ~ 10 L)

  • Ainsi, si nous dialysions 10 ml d'échantillon (avec 1,0 M de NaCl conc) dans 10 L d'eau après l'équilibre, la concentration de NaCl dans l'échantillon serait de 1,0 mM.

  • Notez que dans l'exemple ci-dessus, cela serait communément appelé une dialyse "1:1 000".
  • Supposons que nous ne voulions pas faire 10 L de tampon ? Nous pouvons en fait obtenir les mêmes résultats avec deux dialyses séquentielles "1:32" (c'est-à-dire la racine carrée de la dialyse 1:1000 - en d'autres termes, deux dialyses séquentielles 1:32 équivalent à une seule dialyse 1:1000):

Première dialyse versus 310 ml de tampon : échantillon NaCl conc sera (10*1.0)/(320) = 31 mM

Deuxième dialyse versus 310 ml de tampon : la concentration de NaCl de l'échantillon sera (10*0,031)/(320) = 0,97 mM

Ainsi, au lieu de faire 10 L de tampon, on pourrait n'en faire que 620 ml et obtenir les mêmes résultats avec deux étapes de dialyse

  • Dans ce cas, enlever le sel prendrait deux fois plus de temps, c'est-à-dire que nous devons effectuer deux étapes de dialyse. Combien de temps dure la dialyse ?

Une règle empirique utile est que pour la plupart des types de tubes de dialyse, la dialyse est de 80% en compétition après quatre heures

  • Une conséquence de la dialyse à surveiller est que pendant que les ions de sel sortent du sac, les molécules d'eau se déplacent dans le sac. Ainsi, le volume d'échantillon peut effectivement augmenter (le sac va gonfler) et, par conséquent, la concentration en protéines va diminuer
  • Dans le cas extrême, le sac peut en effet gonfler jusqu'à se rompre. Par conséquent, c'est une bonne idée de ne pas remplir complètement le sac, mais de laisser un vide pour permettre un gonflement potentiel.

Concentration

  • Et si notre échantillon de protéines était trop dilué pour nos besoins ? Comment concentrer nos échantillons ?
  • Une méthode courante consiste, encore une fois, à utiliser une membrane semi-perméable à cette fin.
  • Une méthode très simple consiste à placer notre échantillon dans un sac de dialyse et à l'enduire d'un soluté de poids moléculaire élevé qui peut être facilement dissous par le tampon.
  • Par exemple, les polyéthylène glycols et les polyvinyl pyrolidones peuvent avoir des masses moléculaires très importantes (c'est-à-dire 20 000 Da). Ces composés sont également facilement dissous dans l'eau. Si notre échantillon dans un sac de dialyse est recouvert de formes sèches des polymères ci-dessus, l'eau quittera le sac de dialyse (elle peut passer par les pores) et hydratera les polymères. Il en résulte une diminution du volume de tampon dans la poche de dialyse (la protéine sera concentrée).
  • Dans une autre variante, la membrane semi-perméable est fabriquée en un disque plat et placée au fond d'un récipient qui contient notre échantillon. Dans une méthode, le conteneur est pressurisé et force le tampon hors du conteneur (les protéines sont retenues et concentrées). Dans une autre méthode, le récipient est centrifugé et la force centripète atteint le même objectif que la pression dans l'exemple précédent.

Pour la dialyse et la concentration, il est essentiel que la membrane n'interagisse pas avec la protéine (c'est-à-dire qu'elle n'ait aucune affinité pour la protéine et ne se lie pas à celle-ci)

  • Avec les concentrateurs à pression, la dialyse et la concentration peuvent être réalisées en tandem. Par exemple, l'échantillon peut être concentré puis un tampon ajouté à l'échantillon. L'échantillon est ensuite à nouveau concentré. Chaque fois que du tampon est ajouté, la concentration en sel est réduite. Après des cycles répétés, la concentration en sel est au niveau souhaité et l'échantillon est concentré au volume final souhaité.

Filtration sur gel, résines d'affinité et hydrophobes ; Préparation de Résine, Plomberie

Filtration sur gel

La filtration sur gel ne repose sur aucune interaction chimique avec la protéine, mais repose plutôt sur une physique propriété de la protéine - qui est la rayon moléculaire effectif (qui concerne la masse pour la plupart des protéines globulaires typiques).

  • La résine de filtration sur gel peut être considérée comme des billes qui contiennent des pores d'une plage de taille définie.
  • Les grosses protéines qui ne peuvent pas entrer dans ces pores passent autour du à l'extérieur des perles.
  • Les protéines plus petites qui peuvent pénétrer dans les pores des billes ont un chemin plus long et tortueux avant de sortir de la bille.
  • Ainsi, un échantillon de protéines passant à travers une colonne de filtration sur gel sera séparer en fonction de la taille moléculaire: les plus grosses seront éluées en premier et les plus petites seront éluées en dernier (et les protéines de taille "moyenne" seront éluées au milieu).

Graphique 4.1.9 : Filtration sur gel

  • Si votre protéine est inhabituellement « petite » ou « grande » par rapport aux protéines contaminantes alors la filtration sur gel peut très bien fonctionner.

Où une protéine sera-t-elle éluée dans une expérience de filtration sur gel ?

  • Il existe deux extrêmes dans le profil de séparation d'une colonne de filtration sur gel.
  • Il existe une masse moléculaire critique (grande masse) qui sera complètement exclu des billes de filtration sur gel. Tous les solutés de l'échantillon qui sont égaux ou supérieurs à cette taille critique se comporteront de manière identique : ils seront tous élués dans le volume exclu de la colonne
  • Il existe une masse moléculaire critique (petite masse) qui sera complètement inclus dans les pores des billes de filtration sur gel. Tous les solutés de l'échantillon qui sont égaux ou inférieurs à cette taille critique se comporteront de manière identique : ils seront tous élués dans le volume inclus de la colonne
  • Les solutés entre ces deux plages de masse moléculaire élueront entre les volumes exclus et inclus

Graphique 4.1.10 : Volume exclu vs volume inclus

En règle générale, le volume exclu (Vo) est approximativement égal à un tiers du volume de la colonne, le volume inclus est approximativement égal aux deux tiers du volume de la colonne

  • En filtration sur gel, la résolution est fonction de la longueur de la colonne (plus elle est longue, mieux c'est)
  • Cependant, un inconvénient est lié au volume d'échantillon maximal qui peut être chargé. Plus le volume d'échantillon chargé est important, plus le chevauchement entre les pics séparés est important. D'une manière générale, la taille de l'échantillon que l'on peut charger est limitée à environ 3-5% du volume total de la colonne.
  • Ainsi, la filtration sur gel est mieux conservée pour les étapes finales d'une purification ,lorsque l'échantillon peut être facilement concentré à un petit volume.
  • La filtration sur gel peut également être utilisée pour éliminer les sels de l'échantillon, en raison de sa capacité à séparer les "petits" des "gros" composants.
  • Enfin, la filtration sur gel peut être parmi les méthodes de purification les plus « douces » en raison de l'absence d'interaction chimique avec la résine.

Chromatographie d'affinité

La chromatographie d'affinité est un terme général qui s'applique à une large gamme de supports chromatographiques. Il peut être essentiellement considéré comme une résine inerte à laquelle a été attaché un composé qui a un affinité spécifique pour votre protéine d'intérêt.

  • Ainsi, un anticorps spécifique attaché à une résine inerte serait un type de chromatographie d'affinité.
  • D'autres exemples pourraient inclure : un inhibiteur de protéase attaché à une matrice, conçu pour lier une protéase spécifique
  • un cofacteur lié à une matrice, conçu pour se lier à une enzyme particulière
  • un ion métallique lié à une matrice, conçu pour chélater une protéine avec un site de liaison métallique, et ainsi de suite.

Dans chaque cas, le type de résines utilisées et le mode de fixation peuvent varier, de même que le mode d'élution. Une généralisation concernant la méthode d'élution est que le ligand lié peut être éliminé du groupe fonctionnel de la colonne en incluant dans le tampon d'élution une concentration élevée du groupe fonctionnel libre. Par exemple, si le groupe fonctionnel de la colonne est un cofacteur, alors la protéine liée peut être éliminée de la colonne en faisant passer un tampon contenant une concentration élevée de cofacteur (ou d'analogue de cofacteur) à travers la colonne.

D'autres méthodes d'élution comprennent la modification des conditions du tampon de telle sorte que la protéine ne soit plus à l'état natif (puisque c'est l'état natif qui confère la structure requise pour l'interaction de liaison spécifique). Ceci peut être obtenu en modifiant le pH ou en ajoutant des agents dénaturants tels que l'urée ou la guanidine.

Avec la chromatographie d'affinité, la purification obtenue en une seule étape peut généralement être spectaculaire - de l'ordre de plusieurs milliers de fois. Les purifications en une seule étape avec des colonnes d'affinité spécifiques ne sont pas inconnues - en fait, c'est un objectif idéal de purification - une matrice qui ne reconnaît que la protéine d'intérêt et aucune autre.

Résines hydrophobes

Les résines hydrophobes contiennent un groupe fonctionnel non polaire, tel qu'un groupe alcane ou aromatique.

  • De nombreuses protéines sont capables de séquestrer de tels groupes à leur surface et cette exclusion du solvant fournit la base de l'énergie de liaison (c'est-à-dire "l'effet hydrophobe").
  • Cette interaction est renforcée par l'augmentation de la force ionique, de sorte que les protéines peuvent lier dans des conditions de sel élevé et éluer dans des conditions de faible teneur en sel.
  • En tant que telles, ces colonnes peuvent être utilisées non seulement pour fournir une purification, mais pour dessaler échantillons (par exemple après une précipitation initiale au sulfate d'ammonium).
  • Il n'est généralement pas possible de prédire à l'avance quelle résine particulière se liera à une protéine donnée, ceci est généralement déterminé de manière empirique. Cependant, plus l'alcane est long, ou plus le composé aromatique est gros, plus la liaison sera généralement forte.

En raison de la nature des interactions hydrophobes et de la force ionique, la Chromatographie hydrophobe et la Chromatographie par échange d'ions peuvent être commodément utilisées séquentiellement. Par exemple, après l'échange d'ions, la protéine est dans des conditions salines élevées, elle peut donc être chargée directement sur une colonne hydrophobe. A l'inverse, une colonne hydrophobe est éluée en faible teneur en sel, ce qui est une exigence pour la liaison à une résine échangeuse d'ions.

Une distinction doit être notée entre la chromatographie d'interaction hydrophobe et la chromatographie en phase inverse

  • La chromatographie d'interaction hydrophobe est réalisée dans des conditions de solvant aqueux et des changements de force ionique sont utilisés pour éluer la colonne. La protéine se lie typiquement à l'état natif via des groupes hydrophobes situés à la surface de la protéine. L'état natif est conservé pendant les conditions d'élution
  • La chromatographie en phase inverse utilise un solvant hydrophobe (généralement l'acétonitrile) et la liaison d'un ligand est fonction de la partition de phase entre la nature hydrophobe du solvant et le groupe fonctionnel de la colonne. Les protéines sont typiquement dénaturées dans de tels solvants et se lient en raison de la nature hydrophobe de la séquence polypeptidique entière. La majorité des groupements hydrophobes étant localisés au cœur des protéines globulaires, la liaison est liée à la dénaturation de la protéine et à l'accessibilité de ces groupements aux fonctions de la colonne. Les protéines peuvent être purifiées à l'aide de la chromatographie en phase inverse, mais doivent généralement être repliées d'une manière ou d'une autre pour retrouver la fonctionnalité (c'est-à-dire l'état natif)

Préparation des résines

Les étapes de préparation d'une résine chromatographique impliquent généralement :

  1. Hydratation de la résine
  2. Amendes de décantation
  3. Équilibrage de la résine et préparation d'un slurry
  4. Dégazage du lisier
  • Les résines sont soit sèches, soit prégonflées. S'ils sont secs, il faut les hydrater. Ceci est généralement accompli en mélangeant la résine sèche avec un tampon et en la laissant s'hydrater lentement pendant la nuit (ou plus rapidement à des températures plus élevées
  • Une fois la résine hydratée et déposée, des particules très fines se déposent au sommet. Ces « fines » ralentissent le débit de la résine tassée. La résine décantée est donc soigneusement décantée pour éliminer ces fines.
  • La résine est ensuite équilibrée dans le tampon à utiliser pour l'analyse. L'équilibrage implique généralement le pH de la résine ou des échanges de tampon. N'utilisez jamais un barreau d'agitation lors du pH de la résine (il peut cisailler mécaniquement la résine et produire des fines), remuez plutôt la suspension de résine avec un barreau d'agitation.
  • Une fois que la résine équilibrée s'est déposée, un volume égal de tampon est ajouté pour produire un 50% lisier de résine. Celui-ci est généralement suffisamment "fin" pour permettre aux bulles d'air de s'échapper lors du remplissage de la colonne.
  • Enfin, la suspension est dégazée avant le remplissage de la colonne. Cela aidera à minimiser la formation de bulles d'air.

Emballage de la colonne

Les colonnes basse pression sont généralement remplies par gravité.

  • Ajouter une petite quantité de tampon au bas de la colonne.
  • Placer un réservoir d'emballage en haut de la colonne. Puisque nous utiliserons une suspension à 50%, nous aurons un volume qui est 2x le volume de la colonne et il est préférable de verser la résine en une seule fois. Ainsi, le réservoir de garnissage doit avoir un volume égal ou supérieur au volume de la colonne.
  • Verser délicatement la bouillie de résine dans le réservoir/colonne d'emballage, en évitant autant que possible l'introduction de bulles d'air
  • Laissez la colonne reposer pendant environ 5 minutes pour permettre aux grosses bulles d'air de s'échapper
  • Ouvrez la vanne de la colonne en bas et laissez la colonne se tasser par gravité
  • Notez le haut du lit de résine. Il descendra au fur et à mesure que la colonne se remplira. Lorsque la colonne est remplie, le haut du lit de résine ne descend plus.

Plomberie

Les systèmes de chromatographie peuvent fonctionner en utilisant uniquement la gravité et un bécher pour collecter la fraction appropriée. Cependant, les systèmes les plus courants comprendront les éléments suivants :

  • Une pompe. Généralement une pompe péristaltique à débit variable et un port de communication pour un contrôleur. La pompe est généralement configurée pour pousser tampon à travers la colonne, plutôt que d'aspirer le tampon hors de la colonne (ce qui peut provoquer une condition de basse pression avec production de bulles d'air)
  • Un détecteur. Il s'agit généralement d'un UV (A280) détecteur. La plupart des détecteurs sont du type à deux cellules - ce qui signifie que vous pouvez avoir un tampon simple comme blanc dans le détecteur lors de l'analyse des fractions de vos colonnes. Le détecteur envoie les informations d'absorbance à un enregistreur graphique pour qu'elles soient affichées (imprimées)
  • Un collecteur de fractions. Cela vous permet de collecter des fractions soit par nombre de gouttes (~30 par ml) soit par temps. En conjonction avec une pompe contrôlable, la collecte du temps se traduit en volume. Le collecteur de fractions aura généralement un port de communication pour émettre un signal lorsqu'il change de fraction et pour recevoir des commandes du détecteur/contrôleur sur certains systèmes sophistiqués.
  • Un enregistreur graphique. Cela imprimera une trace continue de la sortie du détecteur et du marqueur d'événement du collecteur de fractions (signalisation lorsqu'une fraction change). Les fractions peuvent également être lues individuellement sur un spectrophotomètre UV si un enregistreur graphique n'est pas disponible.

Figure 4.1.11 : Configuration de la chromatographie

  • Si un système par gravité est utilisé, une boucle de sécurité doit être installée pour empêcher la colonne de se dessécher si le tampon est épuisé lorsque la colonne est sans surveillance

Graphique 4.1.12 : Boucle de sécurité

Notez que le bas de la boucle de sécurité est inférieur que la sortie vers le collecteur de fractions.

Exécution de l'expérience, résolution des pics

Ce qui suit représente un exemple d'expérience de chromatographie liquide à basse pression (résine échangeuse d'ions).

Échantillon:

  • Volume = 90 ml
  • UNE280 = 1.8
  • Total A280 = 162

Colonne:

  • DE-52 (diéthylaminoéthylcellulose; échange d'anions)
  • Taille = 1,0 x 12,7 cm
  • Volume = = 40 ml

Collecteur de fractions :

  • 10 mls/fraction (~300 gouttes/fraction)

Le chromatogramme de cette expérience ressemblait à ceci :

Graphique 4.1.13 : Chromatogramme

Les événements suivants ont eu lieu au cours de cette opération de chromatographie :

1. Notez les coches sur le chromatogramme.

  • Le marqueur « événement » du collecteur de fractions informe l'enregistreur graphique lorsqu'un changement de tube a lieu.
  • L'expérience commence par la coche à côté du '0' sur l'axe des x ("cocher 0"); cela indique le débutde fraction (tube) numéro 1.
  • La coche suivante ("tick 1") indique le finir de fraction numéro 1, et le début de fraction numéro 2.
  • Ainsi, les fractions couvrent l'écart entre les coches.

2. Le chargement de l'échantillon commence à la coche 0.

3. Au cours de la fraction 5, nous commençons à remarquer que l'absorbance de l'effluent de la colonne augmente

  • Il a fallu environ (5 fractions x 10 ml par fraction) ou 50 ml depuis le début du chargement jusqu'à ce que le détecteur constate une éventuelle absorbance.
  • Cela se compare bien au fait que le volume de la colonne est d'environ 40 ml et qu'il y a un certain volume associé à la tubulure entrant et sortant de la colonne.
  • Ainsi, ce « retard » entre le chargement de l'échantillon et la détection de l'échantillon est le volume mort du système

4. Évidemment, certains matériaux ne se fixent pas à la résine pendant l'étape de chargement. C'est le s'écouler à travers. S'agit-il d'un composant de l'échantillon qui n'a pas d'affinité pour la résine, ou cela représente-t-il que nous avons dépassé la capacité de la résine ?

  • Si nous avons dépassé la capacité de la résine, alors l'écoulement aura un A280 similaire à l'échantillon en cours de chargement
  • De plus, avant de dépasser la capacité, l'écoulement aura une caractéristique A280 qui passera ensuite à un autre A280 (celle de l'échantillon chargé), résultant en un double plateau chromatogramme.
  • Dans l'expérience ci-dessus, les plateaux d'écoulement autour de A280=0,5 soit environ 25 % de l'absorbance de la charge. Cela semblerait indiquer qu'un composant, ou composant(s), représentant un quart de notre échantillon, n'a pas d'affinité pour la résine dans la colonne

5. Autour de la fraction 9, nous commençons à laver la colonne

  • Cela a du sens car 9 fractions x 10 ml par fraction = 90 ml ont été chargés et cela équivaut à notre volume d'échantillon d'origine (c'est-à-dire que tout l'échantillon a été chargé)
  • La colonne est généralement lavée en utilisant les mêmes conditions de tampon dans l'échantillon de protéine

6. Autour de la fraction 14 on note le A280 commence à diminuer

  • Cela est logique étant donné que nous avons déterminé que le volume mort du système était d'environ 50 ml ou 5 fractions. Ainsi, un lavage commencé à la fraction 9 diminue l'absorbance autour de la fraction 14
  • Nous continuons à laver la colonne jusqu'à ce que le A280 approche 0 (ligne de base). En d'autres termes, tout le matériau non liant de l'échantillon a été emporté

7. Après le A280 revient à la ligne de base, nous commençons notre élution protocole. Dans cette expérience particulière, nous utiliserons un gradient linéaire de concentration croissante de sel (NaCl) (dans le tampon de lavage) pour éliminer le matériau lié à la résine échangeuse d'ions.

8. Notre élution a produit deux pics : un petit pic centré autour de la fraction 42 et un plus grand pic centré autour de la fraction 50

  • Nous devrons analyser chaque pic (et le flux) pour savoir où est passée notre protéine d'intérêt
  • Les deux pics d'élution sont assez bien résolus. Nous pourrions combiner les fractions 40-44 et appeler cela "pic 1", et combiner les fractions 46-55 et appeler cela "pic 2".

9. Reste-t-il du matériel sur la colonne ? Les zones intégrées (c'est-à-dire la somme des A280's de chaque fraction dans un pool) de l'écoulement, le pic 1 et le pic 2 sont les suivants

  • Débit : 4
  • Pic 1: 2
  • Pic 2 : 10
  • Cela donne une aire totale intégrée de 16. Chaque fraction est de 10 ml, cela donne donc un total de A280 = 16 x 10 = 160 ce qui est assez proche du total A280 de notre échantillon chargé.
  • En d'autres termes, il semble que notre chromatogramme représente tous les composants de notre échantillon d'origine.

10. Si notre protéine d'intérêt était en fait le pic 1 (et si notre rendement était de 100 %), alors cette colonne a fourni une purification huit fois (2 x 10 / 162).


Résolution des pics

  • Les pics contaminants ne seront pas nécessairement complètement séparés du pic qui contient notre protéine d'intérêt
  • Dans l'image suivante, il y a deux composants en cours de résolution, et ils sont présents en quantités équimolaires (ainsi, la pureté de départ est de 50 %). Le rendement et la pureté sont répertoriés pour la situation où nous devions mettre en commun chaque pic en divisant à mi-chemin entre eux (dans cet exemple particulier, le rendement et la pureté sont identiques dans chaque cas)

Graphique 4.1.14 : contaminant peaks

  • Cela vous donne une idée de la quantité de contamination croisée dans chaque pic en fonction de leur séparation les uns des autres.
  • Un logiciel pour adapter les gaussiennes à un chromatogramme peut fournir ce type d'informations

Mise en commun pour la pureté vers le rendement

Essayons-nous de mettre en commun pour maximiser le rendement ou maximiser la pureté ?

Habituellement, vous regrouperez probablement les fractions de manière à maximiser la récupération de votre protéine d'intérêt. Cependant, vous avez toujours la possibilité de mettre en commun pour augmenter la pureté, et si vous avez beaucoup de protéines avec lesquelles travailler, cela peut vous permettre d'atteindre la pureté souhaitée en moins d'étapes. Voici un exemple de la façon dont c'est fait :

Graphique 4.1.15 : Rendement vs pureté

  • Ce sont tous le même chromatogramme, cependant, nous pouvons les mettre en commun différemment pour obtenir une meilleure pureté (au détriment du rendement
  • Le pic bleu est le pic d'intérêt et il n'est pas résolu à partir d'un pic contaminant (en rouge).
  • La ligne verticale représente la fraction la plus à gauche que nous utilisons pour regrouper le pic (nous regroupons toutes les fractions à droite de la ligne verticale pour obtenir notre protéine d'intérêt)
  • Dans le dernier panneau, nous voyons que nous pouvons atteindre environ 98,8% de pureté si nous sommes prêts à nous séparer de la moitié de nos protéines !

Suivi de l'épuration

Comment savoir quand on a fini de purifier une protéine ?

Il y a plusieurs critères. L'un des critères est que nous ne pouvons pas améliorer le Activité spécifique de notre échantillon. Cette valeur fait référence à la activité fonctionnelle de notre échantillon en relation avec la concentration totale en protéines de l'échantillon.

  • Dans les étapes initiales de purification, cette valeur sera faible (peu d'activité par rapport à la quantité totale de protéine).
  • Cette valeur augmentera après chaque étape de purification à mesure que nous supprimer d'autres protéines de l'échantillon.
  • À un moment donné, l'activité spécifique sera plateau, et par définition, s'il est pur on ne peut pas augmenter l'activité spécifique.
  • Il peut y avoir une valeur publiée pour l'activité spécifique à laquelle nous pouvons comparer la nôtre.

De plus, chaque étape de la purification doit être contrôlée par électrophorèse sur gel.

  • Dans les premières étapes de la purification, nous verrons probablement une variété de bandes, de divers poids moléculaires, sur notre gel.
  • Après les différentes étapes de purification, nous devrions voir la disparition de certaines bandes concomitante avec l'augmentation de la concentration d'une certaine bande (ou bandes) représentant notre protéine.
  • Si nous avons réussi à purifier notre protéine (et s'il s'agit d'un seul polypeptide), nous devrions arriver à une activité spécifique constante et une seule bande sur un gel.
  • Les méthodes analytiques telles que la HPLC ou le balayage densitométrique d'un gel coloré peuvent nous donner une idée quantitative de la pureté de notre échantillon final.

Le graphique suivant représente les données typiques que l'on surveillerait lors d'une purification :

Étape
Protéines totales (mg)
Activité totale (unités)
Activité spécifique (unités/mg)
Purification
% Rendement
Lysat cellulaire brut
5500
6600
1.2
30-70% Sulfate d'ammonium coupé
1020
5910
5.8
4.8
89.5
Piscine DEAE Sephadex
187
5070
27.1
4.7
85.8
Piscine CM Sephadex
102
4420
43.3
1.6
87.2
Piscine Phényl Sépharose
56
3930
70.2
1.6
88.9
Piscine de filtration de gel
32
2970
92.8
1.3
75.6
Piscine en résine d'affinité type #1
5.8
2520
434.5
4.7
84.8
Piscine en résine d'affinité type #2
5.3
2390
450.9
1.0
94.8
Purification totale
376
Rendement total (%)
36

Purification des protéines : signification, stratégies principales, évaluation et autres détails

Lisez cet article pour en savoir plus sur la signification, les stratégies principales, la sélection et la combinaison des techniques de purification, la purification d'une protéine marquée, l'évaluation du rendement de purification, la concentration de protéine purifiée et l'analyse de protéines isolées.

Introduction:

La purification des protéines est une série de procédés destinés à isoler un seul type de protéine à partir d'un mélange complexe.

La purification des protéines est vitale pour la caractérisation de la fonction, de la structure et des interactions de la protéine d'intérêt. Le matériau de départ est généralement un tissu biologique ou une culture microbienne.

Les différentes étapes du processus de purification peuvent libérer la protéine d'une matrice qui la confine, séparer les parties protéique et non protéique du mélange et enfin séparer la protéine souhaitée de toutes les autres protéines. La séparation d'une protéine de toutes les autres est généralement l'aspect le plus laborieux de la purification des protéines. Les étapes de séparation exploitent les différences de taille des protéines, de propriétés physico-chimiques et d'affinité de liaison.

La purification peut être préparative ou analytique. Les purifications préparatoires visent à produire une quantité relativement importante de protéines purifiées pour une utilisation ultérieure.Les exemples incluent la préparation de produits commerciaux tels que les enzymes (par exemple, la lactase), les protéines nutritionnelles (par exemple, l'isolat de protéine de soja) et certains produits biopharmaceutiques (par exemple, l'insuline).

La purification analytique produit une quantité relativement faible de protéines à diverses fins de recherche ou d'analyse, notamment l'identification, la quantification et les études de la structure, des modifications post-traductionnelles et de la fonction de la protéine. Parmi les premières protéines purifiées figuraient l'uréase et la concanavaline-A.

Stratégies principales:

La plupart des protocoles de purification nécessitent plus d'une étape pour atteindre le niveau de pureté souhaité. Chaque étape du processus entraînera une certaine perte de produit, un rendement de 80% à chaque étape est supposé, et par conséquent, il est conseillé d'avoir le moins d'étapes de purification possible. Le choix d'un matériau de départ est la clé de la conception d'un procédé de purification.

Chez une plante ou un animal, une protéine particulière n'est généralement pas distribuée de manière homogène dans tout le corps, différents organes ou tissus ont des concentrations plus ou moins élevées de la protéine. L'utilisation des seuls tissus ou organes avec la concentration la plus élevée diminue les volumes nécessaires pour produire une quantité donnée de protéine purifiée.

Si la protéine est présente en faible abondance, ou si elle a une valeur élevée, les scientifiques peuvent utiliser la technologie de l'ADN recombinant pour développer des cellules qui produiront de grandes quantités de la protéine souhaitée (c'est ce qu'on appelle un système d'expression). L'expression recombinante permet à la protéine de être marqué, par exemple, par un marqueur His, pour faciliter la purification, ce qui signifie que la purification peut être effectuée en moins d'étapes. En plus de cette expression recombinante commence généralement avec une fraction plus élevée de la protéine souhaitée que celle présente dans une source naturelle.

Avec des informations de base, des tests et des procédures d'échantillonnage en place, les stratégies de purification en trois phases peuvent être envisagées. La purification comporte trois phases de capture, de purification intermédiaire et de polissage, chacune avec un objectif spécifique. En phase de capture, les objectifs sont d'isoler, de concentrer et de stabiliser la procédure cible.

Pendant la phase de purification intermédiaire, l'objectif est d'éliminer les impuretés en vrac telles que d'autres protéines, acides nucléiques, endotoxines et virus. En phase de polissage, l'objectif est d'éliminer toute trace d'impuretés et de substances étroitement liées. Par conséquent, la sélection et la combinaison optimale des techniques de purification pour la capture, la purification intermédiaire et le polissage sont nécessaires pour assurer un bon rendement et un produit pur.

Le processus de purification final consiste idéalement en la préparation de l'échantillon, y compris l'extraction et la clarification si nécessaire, suivie des trois phases de purification décrites ci-dessus. Le nombre d'étapes dépendra toujours de la pureté requise et de l'utilisation prévue de la protéine.

Une purification analytique utilise généralement trois propriétés pour séparer les protéines. Premièrement, les protéines peuvent être purifiées en fonction de leurs points isoélectriques en les faisant passer à travers un gel à indice de pH ou une colonne échangeuse d'ions. Deuxièmement, les protéines peuvent être séparées en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire par chromatographie d'exclusion stérique ou par analyse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et polyacrylamide).

Les protéines sont souvent purifiées en utilisant 2D-PAGE et sont ensuite analysées par empreinte de masse peptidique pour établir l'identité de la protéine. Ceci est très utile à des fins scientifiques et les limites de détection des protéines sont aujourd'hui très faibles et des quantités de nanogrammes de protéines sont suffisantes pour leur analyse.

Sélection et combinaison de techniques de purification:

Le but de cette combinaison est d'évoluer d'une voie la plus rapide vers un produit de pureté requise. Pour toute séparation chromatographique, chaque technique différente offrira des performances différentes en termes de récupération, de résolution, de vitesse et de capacité. Une technique peut être optimisée pour se concentrer sur l'un de ces paramètres par exemple, la résolution pour obtenir le meilleur entre deux paramètres tels que la vitesse et la capacité.

Une séparation optimisée pour l'un de ces paramètres produira un résultat assez différent en apparence de ceux produits en utilisant la même technique mais axés sur des paramètres alternatifs. Par conséquent, il est toujours préférable de sélectionner une technique pour répondre aux objectifs de l'étape de purification.

La capacité dans le modèle simple représenté représente la quantité de protéine cible chargée pendant la purification. Dans certains cas, la quantité qui peut être chargée peut être limitée par le volume (comme dans la filtration sur gel) ou par un grand volume de contaminants plutôt que la quantité de protéines cibles.

La vitesse est de la plus haute importance au début où les contaminants comme les protéases doivent être éliminés le plus rapidement possible. La récupération devient de plus en plus importante au fur et à mesure que la purification progresse en raison de la valeur accrue du produit purifié. La récupération est influencée par des processus destructeurs dans les échantillons et des conditions défavorables sur la colonne.

La résolution est obtenue par la sélectivité de la technique et l'efficacité de la matrice chromatographique pour produire des pics étroits. En général, la résolution est plus difficile à atteindre dans les phases finales de purification où la protéine cible et les impuretés ont des propriétés très similaires.

Chaque technique offre un équilibre entre capacité, vitesse, résolution et récupération et doit être sélectionnée pour répondre aux objectifs de chaque étape de purification. En général, l'optimisation de l'un de ces paramètres ne peut être réalisée qu'au détriment des autres et l'étape de purification sera un compromis.

L'importance de chaque paramètre variera selon qu'une étape de purification est utilisée pour la capture, la purification intermédiaire ou le polissage. Cela orientera l'optimisation des paramètres critiques ainsi que la sélection des supports appropriés pour l'étape.

Purification d'une protéine étiquetée:

L'ajout d'une étiquette à la protéine donne à la protéine une affinité de liaison qu'elle n'aurait pas autrement. Habituellement, la protéine recombinante est la seule protéine du mélange avec cette affinité, ce qui facilite la séparation. L'étiquette la plus courante est l'étiquette histidine (étiquette His) qui a une affinité avec les ions nickel ou cobalt. Ainsi, en immobilisant des ions nickel ou cobalt sur une résine, un support d'affinité qui se lie spécifiquement aux protéines marquées à l'histidine peut être créé. Étant donné que la protéine est le seul composant avec une étiquette His, toutes les autres protéines traverseront la colonne et laisseront la protéine étiquetée His liée à la résine.

La protéine est libérée de la colonne dans un processus appelé élution, qui dans ce cas implique l'ajout d'imidazole, pour rivaliser avec les balises His pour la liaison au nickel, car elle a une structure cyclique similaire à l'histidine. La protéine d'intérêt est maintenant le seul composant protéique dans le mélange élué, et peut facilement être séparée de tout contaminant mineur indésirable par une deuxième étape de purification, telle que la chromatographie d'exclusion stérique ou la RP-HPLC.

Une autre façon de marquer les protéines consiste à ajouter un peptide antigénique à la protéine, puis à purifier la protéine sur une colonne contenant un anticorps immobilisé. Cela génère une interaction très spécifique qui ne lie généralement que la protéine souhaitée. Lorsque les balises ne sont plus nécessaires, elles peuvent être séparées par une protéase. Cela implique souvent l'ingénierie d'un site de clivage par la protéase entre l'étiquette et la protéine.

Évaluation du rendement de purification:

La méthode la plus générale pour surveiller le processus de purification consiste à exécuter une SDS PAGE, des différentes étapes. Cette méthode ne donne qu'une mesure approximative des quantités de différentes protéines dans le mélange, et elle n'est pas en mesure de faire la distinction entre les protéines de poids moléculaire similaire.

Si la protéine a une caractéristique spectroscopique distinctive ou une activité enzymatique, cette propriété peut être utilisée pour détecter et quantifier la protéine spécifique, et ainsi pour sélectionner les fractions de la séparation, qui contiennent la protéine. Si des anticorps contre la protéine sont disponibles, le western blot et l'ELISA peuvent détecter et quantifier spécifiquement la quantité de protéine souhaitée. Certaines protéines fonctionnent comme des récepteurs et peuvent être détectées pendant les étapes de purification par un test de liaison de ligand, souvent à l'aide d'un ligand radioactif.

Afin d'évaluer le processus de purification en plusieurs étapes, les quantités de la protéine spécifique doivent être comparées à la quantité de protéine totale. Ce dernier peut être déterminé par le dosage des protéines totales de Bradford ou par l'absorbance de la lumière à 280 nm, cependant certains réactifs utilisés pendant le processus de purification peuvent interférer avec la quantification.

Par exemple, l'imidazole (couramment utilisé pour la purification des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine) est un analogue d'acide aminé et, à de faibles concentrations, interférera avec le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) pour la quantification des protéines totales. Les impuretés dans l'imidazole de faible qualité seront également absorbées à 280 nm, ce qui entraînera une lecture inexacte de la concentration en protéines à partir de l'absorbance UV.

Concentration de la protéine purifiée:

A la fin de la purification de la protéine, la protéine doit souvent être concentrée.

Différentes méthodes existent à cet effet :

1. Lyophilisation:

Si la solution ne contient aucun autre composant soluble que la protéine en question, la protéine peut être lyophilisée (séchée). Ceci est généralement effectué après une analyse HPLC. Cela supprime simplement tous les composants volatils en laissant les protéines derrière.

2. Ultrafiltration:

L'ultrafiltration concentre une solution protéique à l'aide de membranes perméables sélectives. La fonction de la membrane est de laisser passer l'eau et les petites molécules tout en retenant la protéine d'étain. La solution est forcée contre la membrane par pompe mécanique ou par pression de gaz ou centrifugation.

Analyse de protéines isolées:

Cette analyse se fait par les techniques suivantes :

1. Électrophorèse en condition dénaturante :

L'électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire courante qui peut être utilisée à la fois comme méthode de préparation et d'analyse. Le principe de l'électrophorèse repose sur le mouvement d'un ion chargé dans un champ électrique. En pratique, les protéines sont dénaturées dans une solution contenant un détergent (SDS). Dans ces conditions, les protéines sont dépliées et enrobées de molécules détergentes chargées négativement. Les protéines dans SDS-PAGE sont séparées sur la seule base de leur taille.

Dans les méthodes analytiques, la protéine migre sous forme de bandes en fonction de la taille. Chaque bande peut être détectée à l'aide de colorants tels que le bleu de Coomassie ou le colorant à l'argent. Les méthodes de préparation pour purifier de grandes quantités de protéines nécessitent l'extraction de la protéine du gel électrophorétique. Cette extraction peut impliquer l'excision du gel contenant une bande ou l'élution de la bande directement du gel lorsqu'elle s'écoule de l'extrémité du gel.

Dans le contexte d'une stratégie de purification, l'électrophorèse en conditions dénaturantes offre une résolution améliorée par rapport à la chromatographie d'exclusion stérique, mais ne s'adapte pas à une grande quantité de protéines dans un échantillon ainsi qu'aux colonnes de chromatographie tardives.

2. Électrophorèse en condition non dénaturante :

Une procédure électrophorétique non dénaturante importante pour isoler les métalloprotéines bioactives dans des mélanges de protéines complexes est appelée électrophorèse quantitative continue sur gel de polyacrylamide natif (QNC-PAGE).


Chromatographie

La chromatographie sur colonne est l'une des méthodes les plus courantes de purification des protéines. Comme beaucoup de techniques sur ce site, c'est autant une forme d'art qu'une science. Les protéines varient énormément dans leurs propriétés, et les différents types de chromatographie sur colonne vous permettent d'exploiter ces différences. La plupart de ces méthodes ne nécessitent pas la dénaturation des protéines.

Pour être très général, une protéine est passée à travers une colonne conçue pour piéger ou ralentir le passage des protéines en fonction d'une propriété particulière (telle que la taille, la charge ou la composition).

Il y a trois étapes principales pour la purification des protéines :

1. Capturez. Vous devez obtenir votre protéine sous une forme concentrée. Si, par exemple, vous essayez d'isoler une protéine que vous avez synthétisée dans une cellule d'E. coli, vous pourriez avoir un rapport protéine/poubelle de 1:1 000 000. Pour la purification par capture, vous avez besoin d'une méthode de grande capacité qui est également rapide. Vous avez besoin d'une méthode rapide car votre solution brute est très susceptible de contenir également des protéases et celles-ci peuvent rapidement mâcher vos protéines.

2. Intermédiaire. La purification intermédiaire nécessite à la fois de la vitesse et une bonne résolution.

3. Polissage. Pour l'étape finale de purification, vous avez besoin d'un système qui a à la fois une bonne résolution et une bonne vitesse. La capacité n'est généralement pas pertinente à ce stade.

Certaines des colonnes les plus courantes incluent :

IEX : Chromatographie d'échange d'ions. Bon pour la capture, l'intermédiaire et le polissage.

HIC : Colonne d'interaction hydrophobe. Bon pour la purification intermédiaire.

CA : Chromatographie d'affinité. Bon pour la capture et la purification intermédiaire.

GF : Chromatographie par filtration sur gel (exclusion stérique). Bonne étape de polissage.

Examinons ces types de colonnes plus en détail.

Chromatographie d'échange d'ions

La chromatographie par échange d'ions est basée sur la charge de la protéine que vous essayez d'isoler. Si votre protéine a une charge positive élevée, vous voudrez la faire passer dans une colonne avec une charge négative. La charge négative sur la colonne liera la protéine chargée positivement et d'autres protéines traverseront la colonne. Vous utilisez ensuite une procédure appelée « relargage » pour libérer votre protéine chargée positivement de la colonne chargée négativement. La colonne qui fait cela s'appelle une colonne échangeuse de cations et utilise souvent des résidus sulfonés. De même, vous pouvez lier une protéine chargée négativement à une colonne chargée positivement. La colonne qui fait cela s'appelle une colonne échangeuse d'anions et utilise souvent des résidus d'ammonium quaternaire.

Saler libérera ou éluera votre protéine de la colonne. Cette technique utilise une solution à forte concentration en sel. La solution saline surpassera la protéine en se liant à la colonne. En d'autres termes, la colonne a une plus grande attraction pour la charge de sels que pour la protéine chargée, et elle libérera la protéine en faveur de la liaison des sels à la place. Les protéines avec des interactions ioniques plus faibles seront éluées à un niveau de sel inférieur, vous voudrez donc souvent éluer avec un gradient de sel. Différentes protéines éluent à différentes concentrations de sel, vous voudrez donc être sûr de bien connaître les propriétés de vos meilleurs résultats de protéines.

Sachez également que les changements de pH modifient les charges des protéines. Assurez-vous de connaître le point isoélectrique de votre protéine (le point isoélectrique est le pH auquel la charge d'une protéine est nulle) et assurez-vous que le pH de votre système est ajusté et tamponné en conséquence.

Les étapes de base de l'utilisation d'une colonne échangeuse d'ions sont les suivantes :

1. Préparez la colonne. Versez votre tampon sur la colonne pour vous assurer qu'il s'est équilibré au pH requis.

2. Chargez votre solution de protéines. Certaines protéines de la solution ne se lient pas et s'élueront pendant cette phase de chargement.

3. Salez. Augmenter la concentration en sel pour éluer les protéines liées. Il est préférable d'utiliser un gradient de sel pour éluer progressivement les protéines avec différentes forces ioniques. À la fin, frappez le système avec une concentration en sel très élevée (2-3M) pour vous assurer que toutes les protéines sont hors de la colonne.

4. Retirez les sels. Utilisez la dialyse pour éliminer les sels de votre solution de protéines.

La température n'a pas un effet énorme sur la chimie de la colonne. Cependant, il vaut mieux travailler à froid car les protéines sont plus stables à froid.

Chromatographie d'interaction hydrophobe

Là où la chromatographie échangeuse d'ions repose sur les charges de protéines pour les isoler, la chromatographie d'interaction hydrophobe utilise les propriétés hydrophobes de certaines protéines. Les groupes hydrophobes sur la protéine se lient aux groupes hydrophobes sur la colonne. Plus une protéine est hydrophobe, plus elle se liera fortement à la colonne.

Charger les protéines en présence d'une forte concentration de sulfate d'ammonium (ne pas ammonium parsulfate). Le sulfate d'ammonium est un agent chaotrope. Il augmente le chaos (entropie) dans l'eau, et augmente ainsi les interactions hydrophobes (plus l'eau est désordonnée, plus les interactions hydrophobes sont fortes). Le sulfate d'ammonium stabilise également les protéines. Ainsi, grâce à l'utilisation d'une colonne HIC, vous pouvez vous attendre à ce que votre protéine soit sous sa forme la plus stable.

La colonne hydrophobe est garnie d'une matrice de phényl agarose. En présence de concentrations élevées de sel, les groupes phényle de cette matrice se lient aux portions hydrophobes des protéines. Vous pouvez contrôler l'élution de différentes protéines liées à la colonne en réduisant la concentration en sel ou en ajoutant des solvants.

Chromatographie d'affinité.

La chromatographie d'affinité repose sur les fonctions biologiques d'une protéine pour la lier à une colonne. Le type le plus courant implique un ligand, une petite biomolécule spécifique. Cette petite molécule est immobilisée et attachée à une matrice de colonne, telle que la cellulose ou le polyacrylamide. Votre protéine cible est ensuite passée à travers la colonne et liée à celle-ci par son ligand, tandis que d'autres protéines sont éluées. L'élution de votre protéine cible se fait généralement en faisant passer à travers la colonne une solution qui contient une forte concentration de ligand libre. Il s'agit d'une méthode de purification très efficace car elle repose sur la spécificité biologique de votre protéine cible, telle que l'affinité d'une enzyme pour un substrat.

Chromatographie par filtration sur gel (exclusion stérique) d

La filtration sur gel, ou la chromatographie d'exclusion stérique, sépare les protéines en fonction de leur taille. La colonne est garnie d'une matrice de fines billes poreuses.

Cela fonctionne un peu comme un tamis, mais à l'envers. Les perles ont de très petits trous. Au fur et à mesure que la solution de protéines est versée sur la colonne, de petites molécules pénètrent dans les pores des billes. Les molécules plus grosses sont exclues des trous et passent rapidement entre les billes.

Ces molécules plus grosses sont éluées en premier. Les molécules plus petites ont un chemin plus long à parcourir, car elles se coincent encore et encore dans le labyrinthe de pores allant de bille à bille. Ces molécules plus petites mettent donc plus de temps à traverser la colonne et sont éluées en dernier.


Purification des protéines marquées à la polyhistidine

Purification rapide de protéines marquées à la polyhistidine à l'aide de résines magnétiques

Il existe un besoin croissant de méthodes de purification de protéines à haut débit. Les résines magnétiques permettent la purification des protéines marquées par affinité sans avoir besoin de plusieurs étapes de centrifugation et de transfert séquentiel d'échantillons dans plusieurs tubes. Il existe plusieurs critères qui définissent une bonne résine de purification de protéines : une liaison protéique non spécifique minimale, une capacité de liaison élevée pour la protéine de fusion et une récupération efficace de la protéine de fusion. Le système de purification de protéines MagneHis™ répond à ces critères, permettant la purification de protéines avec une large gamme de poids moléculaires et différents niveaux d'expression. La nature magnétique des particules de liaison permet d'effectuer la purification des lysats bruts dans un seul tube. De plus, le système peut être utilisé avec des plates-formes automatisées de gestion des liquides pour les applications à haut débit.

Système de purification de protéines MagneHis™

Le système de purification de protéines MagneHis™ utilise des particules de nickel préchargées paramagnétiques (particules Ni MagneHis™) pour isoler une protéine marquée à la polyhistidine directement à partir d'un lysat cellulaire brut. La figure 2 montre un diagramme schématique du protocole du système de purification de protéines MagneHis™.La protéine marquée à la polyhistidine peut être purifiée à petite échelle en utilisant moins de 1 ml de culture ou à grande échelle en utilisant plus de 1 litre de culture. Les échantillons peuvent être traités à haut débit à l'aide d'une plate-forme robotique telle que l'instrument Beckman Coulter Biomek® FX ou Tecan Freedom EVO®. Les protéines marquées à la polyhistidine peuvent être purifiées dans des conditions natives ou dénaturantes (urée 2-8M ou guanidine-HCl). La présence de sérum dans le milieu de culture de cellules de mammifères et d'insectes n'interfère pas avec la purification. Pour plus d'informations et un protocole détaillé, consultez le manuel technique #TM060 et le protocole automatisé du système de purification de protéines MagneHis™.

Figure 2. Schéma du protocole du système de purification de protéines MagneHis™.

Protocole : MagneHis™ Purification des protéines exprimées dans les cellules bactériennes

Matériaux nécessaires:
    et protocole
  • Incubateur à 37°C pour flacons ou tubes
  • Mixeur
  • support de séparation magnétique
  • Solution d'imidazole 1M (pH 8,0 pour la purification à partir de cellules d'insectes ou de mammifères ou de milieu de culture)
  • tampon de liaison/lavage supplémentaire (peut être nécessaire si vous traitez de nombreux échantillons de cellules d'insectes, de cellules de mammifères ou de milieu de culture)
  • NaCl solide (pour la purification à partir de cellules d'insectes ou de mammifères ou de milieu de culture)

Purification à l'aide de conditions dénaturantes. Les protéines exprimées dans les cellules bactériennes peuvent être présentes dans les corps d'inclusion insolubles. Pour déterminer si votre protéine se trouve dans un corps d'inclusion, effectuez l'étape de lyse à l'aide du réactif de lyse cellulaire FastBreak™, 10X, comme décrit dans le manuel technique #TM060. Pellet débris cellulaires par centrifugation et vérifier le surnageant et le culot pour la protéine étiquetée polyhistidine par analyse de gel.

Une purification efficace des protéines insolubles nécessite des conditions de dénaturation. Étant donné que l'interaction des protéines de fusion marquées à la polyhistidine et des particules Ni MagneHis™ ne dépend pas de la structure tertiaire, les protéines de fusion peuvent être capturées et purifiées dans des conditions de dénaturation en ajoutant un dénaturant puissant tel que le chlorhydrate de guanidine 2-8M ou l'urée aux cellules. Des conditions de dénaturation doivent être utilisées tout au long de la procédure afin que les protéines ne s'agrègent pas. Nous recommandons de préparer des tampons dénaturants en ajoutant de la guanidine-HCl solide ou de l'urée directement aux tampons de liaison/lavage et d'élution MagneHis™. Pour plus d'informations, consultez le manuel technique #TM060.

Noter: Ne pas combiner le réactif de lyse cellulaire FastBreak™ et les dénaturants. Les cellules peuvent être lysées directement en utilisant des dénaturants tels que l'urée ou la guanidine-HCl.

Purification à partir de cellules d'insectes et de mammifères. Traiter les cellules à une densité cellulaire de 2 × 10 6 cellules/ml de culture. Les cellules adhérentes peuvent être retirées du récipient de culture tissulaire par grattage et remise en suspension dans un milieu de culture à cette densité. Les cellules peuvent être traitées dans un milieu de culture contenant jusqu'à 10 % de sérum. Le traitement de plus que le nombre indiqué de cellules par millilitre d'échantillon peut entraîner une réduction du rendement en protéines et une augmentation de la liaison non spécifique. Pour les protéines qui sont sécrétées dans le milieu de culture cellulaire, retirez toutes les cellules du milieu avant la purification. Pour plus d'informations, consultez le manuel technique #TM060.

Protocoles du système MagneHis™

Plus d'informations et des protocoles détaillés pour l'utilisation du système MagneHis™ sont disponibles dans le manuel technique #TM060. Un protocole d'automatisation du système MagneHis™ sur les manipulateurs de liquides est également disponible (#EP011).

Protocole : Purification MagZ&trade des protéines exprimées dans le lysat de réticulocytes

La purification d'une protéine marquée à la polyhistidine qui est exprimée dans le lysat de réticulocytes de lapin est compliquée par la copurification de l'hémoglobine dans le lysat et la protéine d'intérêt. La copurification de l'hémoglobine limite les applications en aval (par exemple, les tests fonctionnels basés sur la fluorescence, les études d'interaction protéine:protéine) et réduit la quantité de protéine purifiée. Le système de purification de protéines MagZ&trade fournit une méthode simple, rapide et fiable pour purifier la protéine marquée à la polyhistidine exprimée à partir de lysat de réticulocytes de lapin avec une copurification minimale de l'hémoglobine. Les particules de liaison MagZ&trade paramagnétiques et préchargées sont utilisées pour isoler la protéine marquée à la polyhistidine de 50&ndash500&mul de lysat de réticulocytes de lapin T n T®, ce qui donne des protéines marquées à la polyhistidine qui sont à 99 % exemptes d'hémoglobine contaminante.

Le système MagZ&trade est suffisamment flexible pour être utilisé avec différentes méthodes d'étiquetage et de détection. Les protéines marquées à la polyhistidine exprimées dans le lysat de réticulocytes de lapin peuvent être marquées avec de la [35S]méthionine ou le système de marquage de traduction in vitro FluoroTect&trade GreenLys. Les protéines à marquage polyhistidine marquées au colorant FluoroTect&trade peuvent être visualisées par analyse sur gel et analysées à l'aide d'un instrument FluorImager®. La figure 3 montre un diagramme schématique du protocole du système de purification de protéines MagZ&trade. Pour plus d'informations et un protocole détaillé, consultez le bulletin technique #TB336.

Matériaux nécessaires:

Figure 3. Diagramme schématique du système de purification de protéines MagZ™. Une réaction TnT® exprimant des protéines marquées à la polyhistidine est diluée avec MagZ™ Binding/Wash Buffer et ajoutée aux particules MagZ™. Les protéines marquées à la polyhistidine se lient aux particules pendant l'incubation, puis sont lavées pour éliminer les protéines non liées et liées de manière non spécifique.

Protocole du système MagZ™

Plus d'informations et un protocole détaillé pour l'utilisation du système MagZ&trade sont disponibles dans le manuel technique #TM336.

Purification à moyenne et grande échelle de protéines marquées à la polyhistidine dans des formats de colonne ou de lot

Les deux matériaux de support les plus courants pour la purification de protéines à base de résine et marquées par affinité sont l'agarose et le gel de silice. En tant que support chromatographique, la silice est avantageuse car elle a une structure mécanique rigide qui n'est pas vulnérable au gonflement et peut supporter de grandes variations de pression et de débit sans se désintégrer ni se déformer. La silice est disponible dans une large gamme de tailles de pores et de particules, y compris la silice macroporeuse, qui offre une capacité plus élevée pour les grandes biomolécules telles que les protéines. Cependant, deux des inconvénients de la silice en tant que support solide pour la purification par affinité sont la chimie limitée des réactifs disponibles et l'efficacité relativement faible de la modification de surface.

La résine de purification de protéine HisLink™ (Cat.# V8821, V8823) surmonte ces limitations en utilisant un nouveau processus de modification pour les surfaces de silice qui fournit un support solide chélaté par un métal tétradenté avec une capacité de liaison élevée et élimine simultanément la liaison non spécifique qui est caractéristique de silice non modifiée. La résine HisLink™ est une résine de silice macroporeuse modifiée pour contenir un niveau élevé de nickel tétradenté chélaté (>20 mmol Ni/ml de résine décantée). La figure 4 montre un diagramme schématique de l'interaction entre la résine HisLink™ et l'étiquette polyhistidine. La résine HisLink™ a une taille de pores qui se traduit par des capacités de liaison aussi élevées que 35 mg de protéine marquée à la polyhistidine par millilitre de résine.

La résine HisLink™ permet une capture et une purification efficaces des protéines marquées à la polyhistidine exprimées par des bactéries. Cette résine peut également être utilisée pour des applications générales qui nécessitent une matrice de chromatographie d'affinité métallique (IMAC) immobilisée (Porath et al. 1975 Lonnerdal et Keen, 1982). La résine HisLink™ peut être utilisée dans des formats de purification en colonne ou en lots. Pour un protocole détaillé, voir le bulletin technique #TB327.

Figure 4. Diagramme schématique de l'interaction entre la résine HisLink™ et la polyhistidine. Deux sites sont disponibles pour la liaison à l'étiquette polyhistidine et sont rapidement coordonnés avec l'histidine en présence d'un polypeptide à étiquette polyhistidine.

Purification sur colonne à l'aide de la résine HisLink™

La résine HisLink™ fournit un moyen conventionnel pour purifier les protéines marquées à la polyhistidine et ne nécessite qu'une colonne pouvant être remplie au volume de lit approprié. Lorsqu'elle est conditionnée à 1 ml sous flux gravitaire, la résine HisLink™ affiche un débit moyen d'environ 1 ml/minute. En général, un débit de 1 à 2 ml/minute par millilitre de résine est optimal pour une capture efficace des protéines marquées à la polyhistidine. L'écoulement par gravité d'un lysat clarifié sur une colonne HisLink™ entraînera une capture complète et une élution efficace des protéines marquées à la polyhistidine. Cependant, la résine peut également être utilisée avec des dispositifs de filtration sous vide (par exemple, Vac-Man® Vacuum Manifold, Cat. # A7231 ) pour permettre le traitement simultané de plusieurs colonnes. La résine HisLink™ est également un excellent choix pour la purification par affinité à l'aide de systèmes de chromatographie liquide basse à moyenne pression tels que la chromatographie liquide à performance rapide (FPLC).

Exemple de protocole utilisant la résine HisLink™ pour purifier les protéines du lysat clarifié par chromatographie sur colonne par gravité

Matériaux nécessaires:

  • Résine de purification de protéines HisLink™ (Cat.# V8821) et protocole
  • Tampon HEPES (pH 7,5)
  • imidazole
  • Tampon de liaison HisLink™
  • Tampon de lavage HisLink™
  • Tampon d'élution HisLink™
  • colonne

Lyse cellulaire: Les cellules peuvent être lysées en utilisant un certain nombre de méthodes, y compris la sonication, la presse française, le broyage des billes, le traitement avec des enzymes lytiques (par exemple, le lysozyme) ou l'utilisation d'un réactif de lyse cellulaire disponible dans le commerce tel que le réactif de lyse cellulaire FastBreak™ (Cat. # V8571) . Si le lysozyme est utilisé pour préparer un lysat, ajouter du sel (>300mM NaCl) aux tampons de liaison et de lavage pour empêcher le lysozyme de se lier à la résine. L'ajout d'inhibiteurs de protéase tels que le PMSF 1 mM aux lysats cellulaires n'inhibe pas la liaison ou l'élution des protéines marquées par la polyhistidine avec la résine HisLink™ et est fortement recommandé pour empêcher la dégradation de la protéine d'intérêt par les protéases endogènes. Lors de la préparation de lysats cellulaires à partir de cultures à haute densité, l'ajout de DNase et de RNase (concentrations jusqu'à 20 μg/ml) réduira la viscosité du lysat et facilitera la purification.

  1. Préparer les tampons de liaison, de lavage et d'élution HisLink™
    Noter: Les protéines marquées à la polyhistidine peuvent être éluées en utilisant 250 à 1 000 mM d'imidazole. Les étiquettes polyhistidine contenant moins de six histidines nécessitent généralement moins d'imidazole pour l'élution, tandis que les protéines polyhistidine contenant plus de six polyhistidines peuvent nécessiter des niveaux plus élevés d'imidazole.
  2. Déterminer le volume de colonne requis pour purifier la protéine d'intérêt. Dans la plupart des cas, 1 ml de résine décantée est suffisant pour purifier la quantité de protéines généralement trouvée dans jusqu'à 1 litre de culture (densité cellulaire de D.O.600 < 6,0). En cas de niveaux d'expression très élevés (par exemple, 50 mg de protéine/litre), jusqu'à 2 ml de résine par litre de culture peuvent être nécessaires.
  3. Une fois que vous avez déterminé le volume de résine décantée nécessaire, pré-étalonnez cette quantité directement dans la colonne en pipetant le volume équivalent d'eau dans la colonne et en marquant la colonne pour indiquer le haut de l'eau. Cette marque indique le sommet du lit de résine déposé. Retirez l'eau avant d'ajouter de la résine à la colonne.
  4. Assurez-vous que la résine est complètement suspendue remplissez la colonne de résine jusqu'à la ligne marquée sur la colonne en transférant la résine avec une pipette. Laissez la résine se déposer et ajustez le niveau de résine en ajoutant ou en enlevant de la résine si nécessaire.
    Noter: Si la résine n'est pas pipetée dans les 10 à 15 secondes suivant le mélange, une sédimentation importante se produira et la résine devra être remise en suspension. Alternativement, une barre d'agitation magnétique peut être utilisée pour maintenir la résine en suspension pendant le transfert. Pour éviter de fracturer la résine, ne laissez pas la résine sous agitation plus longtemps que le temps nécessaire pour pipeter et transférer la résine.
  5. Laisser la colonne se vider et équilibrer la résine avec cinq volumes de colonne de tampon de liaison, permettant au tampon d'entrer complètement dans le lit de résine.
  6. Ajouter doucement le lysat clarifié à la résine jusqu'à ce que le lysat soit complètement entré dans la colonne. Le débit à travers la colonne ne doit pas dépasser 1 à 2 ml/minute pour chaque 1 ml de volume de colonne. Dans des conditions normales d'écoulement par gravité, le débit est typiquement d'environ 1 ml/minute. Le débit réel dépendra du type de colonne utilisé et de la mesure dans laquelle le lysat a été nettoyé et filtré. Ne laissez pas la résine sécher après avoir appliqué le lysat sur la colonne.
  7. Laver les protéines non liées de la résine en utilisant au moins 10 à 20 volumes de colonne de tampon de lavage. Divisez le volume total de tampon de lavage en deux ou trois aliquotes et laissez chaque aliquote pénétrer complètement dans le lit de résine avant d'ajouter l'aliquote suivante.
  8. Une fois que le tampon de lavage a complètement pénétré dans le lit de résine, ajoutez le tampon d'élution et commencez à collecter les fractions (fractions de 0,5 à 5 ml). Les profils d'élution dépendent des protéines, mais les protéines marquées à la polyhistidine seront généralement éluées dans le premier 1 ml. L'élution est généralement complète après 3 à 5 ml de tampon collectés pour 1,0 ml de résine décantée, à condition que la concentration en imidazole soit suffisamment élevée pour éluer efficacement la protéine d'intérêt.

Purification des protéines par lots à l'aide de la résine HisLink™

L'un des principaux avantages de la résine HisLink™ est son utilisation dans la purification par lots. En mode batch, la protéine d'intérêt est liée à la résine en mélangeant le lysat avec la résine pendant environ 30 minutes à une température comprise entre 4 et 22 °C. Une fois liée à la protéine, la résine peut se déposer au fond du récipient et le lysat épuisé est retiré. Le lavage ne nécessite que la remise en suspension de la résine dans un tampon de lavage approprié suivi d'une brève période pour permettre à la résine de se déposer. Le tampon de lavage est ensuite soigneusement vidé. Ce processus est répété autant de fois que souhaité. L'élution finale est mieux obtenue en transférant la résine HisLink™ dans une colonne pour éluer la protéine en fractions. Les avantages de la purification par lots sont : 1) moins de temps est nécessaire pour effectuer la purification 2) de grandes quantités de lysat peuvent être traitées et 3) la clarification du lysat avant la purification n'est pas nécessaire.

Purification de protéines marquées à la polyhistidine par FPLC

La structure particulaire rigide de la base de silice utilisée dans la résine HisLink™ fait de ce matériau un excellent choix pour les applications nécessitant une pression appliquée pour charger le lysat, laver ou éluer les protéines de la résine. Ces applications impliquent à la fois des systèmes manuels et automatisés qui fonctionnent sous pression positive ou négative (par exemple, les systèmes FPLC et sous vide, respectivement). Pour démontrer l'utilisation de la résine HisLink™ sur une plate-forme automatisée, nous avons utilisé un explorateur AKTA de GE Healthcare pour purifier des quantités de milligrammes de protéines marquées à la polyhistidine à partir d'un litre de culture. La culture a été lysée dans 20 ml de tampon de liaison/lavage et chargée sur une colonne contenant 1 ml de résine HisLink™. Nous estimons que la quantité totale de protéines récupérées représente 75 à 90 % de la protéine exprimée dans le lysat d'origine.

Purification des protéines en conditions dénaturantes : Les protéines qui sont exprimées sous forme de corps d'inclusion et qui ont été solubilisées avec des agents chaotrophes tels que la guanidine-HCl ou l'urée peuvent être purifiées en modifiant le protocole pour inclure la quantité appropriée de dénaturant (jusqu'à 6M de guanidine-HCl ou jusqu'à 8M d'urée) dans les tampons de liaison, de lavage et d'élution.

La résine HisLink™ peut être utilisée dans des formats de purification en colonne ou en lots. Pour un protocole détaillé, voir le bulletin technique #TB327.


Balise RAP : Une nouvelle approche de purification des protéines

Qu'il s'agisse de notre alimentation, de notre renforcement musculaire ou des progrès de la médecine, ce n'est un secret pour personne que les protéines font partie intégrante de notre vie. Le suivi du fonctionnement et du mouvement des protéines dans les cellules et la purification des protéines modifiées sont des outils importants pour les chercheurs. Les approches traditionnelles pour marquer les protéines d'intérêt, appelées "marquage", ont l'inconvénient d'interférer avec les caractéristiques des protéines, y compris la fonction et la localisation. Parfois, ces balises peuvent également réagir de manière croisée, ce qui rend les informations qu'elles fournissent non spécifiques. Un système de marquage de protéines réussi doit être hautement spécifique et avoir une affinité élevée.

Dans une étude publiée en septembre 2020 dans Frontiers in Plant Science, des chercheurs de l'Université de Tsukuba, dirigés par le professeur Kenji Miura, ont décrit un nouveau système de marquage pour détecter et purifier les protéines dans les cellules végétales. Cette approche utilise une courte séquence appelée "étiquette RAP" pour marquer les protéines. Un anticorps, PMab-2, est alors capable de reconnaître spécifiquement le tag RAP et peut être utilisé pour purifier les protéines d'intérêt.

En décrivant cette approche, le professeur Miura déclare : « La haute affinité et la spécificité de la chromatographie d'immunoaffinité utilisant des anticorps monoclonaux en font un outil très puissant, en particulier pour la purification des protéines exprimées à de faibles niveaux. » Un obstacle à l'application de cette approche, cependant, est le coût élevé des réactifs, en particulier celui des anticorps.

Pour contourner ce problème, le professeur Miura et ses collègues ont exploré s'ils pouvaient produire l'anticorps PMab-2 dans le modèle végétal Nicotiana benthamiana, un parent de la plante de tabac. Non seulement ils ont réussi à produire du PMab-2, mais ils ont ensuite montré que le PMab-2 produit par les plantes se comportait de la même manière que celui produit dans les cellules animales. Cette découverte ouvre la porte à la réduction du coût de production des anticorps et pourrait être appliquée plus largement dans les domaines scientifiques.

Testant la faisabilité d'une approche de purification par affinité marquée RAP/PMab-2, les chercheurs ont ensuite exprimé des protéines marquées RAP dans des cellules végétales. Ils ont découvert que ces protéines marquées pouvaient être spécifiquement identifiées à l'aide de l'anticorps PMab-2. De plus, des protéines recombinantes marquées par RAP, impliquant la fusion de séquences de plus d'une protéine, et des complexes protéiques ont également été exprimés dans ces cellules et identifiés par PMab-2. Ces protéines pourraient également être purifiées à partir de cellules végétales à l'aide de l'anticorps PMab-2, indiquant que l'étiquette RAP peut être utilisée à la fois pour la détection de protéines et la purification à partir d'extraits de plantes solubles.

« Les plantes sont une ressource extrêmement précieuse pour la biologie moléculaire », explique le professeur Miura. "Ils peuvent être utilisés comme bioréacteurs pour produire de grandes quantités de protéines, car il est peu probable qu'ils souffrent de problèmes de contamination rencontrés par les systèmes cellulaires bactériens et mammifères."

Les résultats présentés par l'équipe montrent que cette approche a le potentiel d'être largement appliquée dans les sciences moléculaires.


4.1 : Purification des protéines - Biologie

Extraction de protéines bactériennes - mini échelle - Sonication

1) Remettre en suspension le culot de 10 ml de culture cellulaire dans 1 ml de tampon de lyse (ou 100 ml de culture bactérienne pour un niveau d'expression très faible).

Tampon de lyse suggéré : 140mM NaCl 2,7mM KCL 10mM Na2HPO4 1.8mM KH2Bon de commande4 pH 7,3 (PBS)
ou 100 mM NaCl 25 mM TrisHCl pH 8,0
en option 0,02% NaN3 (azoture)
inhibiteurs de protéase facultatifs

Additifs optionnels au tampon de lyse
a) PMSF 1 mM ou cocktail d'inhibiteur de protéase 1:200 (cocktail pour cellules bactériennes #P-8849 de Sigma)
b) Dnase 100U/ml ou 25-50ug/ml (SIGMA DN-25). Incuber 10min 4°C en présence de 10mMMgCl2.
c) Lysozime 0,2 mg/ml. Incuber 10min 4°C.
d) ßME, DTT ou DTE jusqu'à 10 mM pour les protéines contenant de nombreuses cystéines.
e) 0,1-2% de Triton X-100, NP40 ou tout autre détergent qui n'affecte pas l'activité biologique de votre protéine.
f) 10% de glycérol (pour la stabilisation de la protéine et la prévention de l'agrégation).

2) Soniquer dans un seau à glace 3 x 10sec ou plus si les cellules ne sont pas complètement perturbées (La lyse est terminée lorsque la suspension cellulaire trouble devient translucide. Eviter la dénaturation des protéines par moussage).

3) Essorage 5min 13000rpm 4°C . Séparer les protéines solubles (surnageant) des protéines insolubles ou des corps d'inclusion (pellet).Utilisez le surnageant pour l'étape suivante. Conservez un échantillon de 40 ul de surnageant pour PAGE-SDS et Western blot : protéines solubles

4) Remettre en suspension le culot dans un autre tampon de lyse de 1 ml et conserver un échantillon de 40 ul pour PAGE-SDS et Western blot : protéines insolubles ou cellules non lysées .


Technologies de découverte de médicaments

3.19.7.3 Étape de capture avec des balises d'affinité

Au cours de la dernière décennie, une grande variété de protéines de fusion ou de peptides pour une purification et une détection simplifiées des protéines ont été décrites. Le partenaire de fusion est codé sur le plasmide ou l'ADN viral et soit en C- ou N-terminalement lié à la protéine d'intérêt. Pour les marqueurs de fusion plus grands, l'introduction d'un site de clivage de protéase approprié entre la protéine de fusion et la protéine d'intérêt est considérée pour retirer le marqueur avant la cristallisation. L'élimination soigneuse de la protéase avant de commencer les expériences de cristallisation est très importante afin d'éviter le clivage de la protéine d'intérêt pendant la procédure de cristallisation.

Plasmides contenant de l'ADN codant pour des protéines comme le glutathion-S-transférase, 58,59 protéine de liaison au maltose, NusA, peptide de liaison à la calmoduline, intéine, thiorédoxine, protéine de liaison à la cellulose et fragments Fc des anticorps 17 sont disponibles dans le commerce, ainsi que les outils de purification de protéine appropriés. Beaucoup de ces grands partenaires de fusion augmentent la solubilité de la protéine de fusion exprimée (voir, par exemple, Kapust et Waugh 60). Parfois, les partenaires de fusion simulent la solubilité de la protéine exprimée. Après retrait de l'étiquette, la protéine d'intérêt précipite de manière irréversible.

Les petites étiquettes d'affinité telles que Poly-His-tag et Strep-tag 61,62 sont largement utilisées car elles ne modifient pas les propriétés des protéines et n'ont pas besoin d'être clivées. Lors de l'utilisation de Poly-His-tags pour la purification des protéines, il faut tenir compte du fait que E. coli les souches produisent la protéine SlyD (20 kDa) contenant un domaine potentiel de site de liaison aux métaux. Cette protéine se lie étroitement à la chromatographie sur chélate métallique et est souvent détectée comme une bande de contamination. 63

La chromatographie par marqueur d'affinité peut être effectuée en mode batch, par des dispositifs de filtration centrifuge ou à seringue, ou sur un équipement chromatographique avec des colonnes pré-remplies conformément aux instructions du fabricant. 58,62,64

Dans certains cas, l'élimination de l'agent d'élution est nécessaire pour maintenir la stabilité des protéines : les protéines de fusion du fragment Fc sont éluées dans des conditions acides extrêmes : le pH doit être ajusté à des valeurs neutres immédiatement après l'élution. L'utilisation d'imidazole à des concentrations élevées dans l'élution des protéines marquées Poly-His déstabilise les protéines et doit être éliminé par dialyse.


Contenu

La purification des protéines est soit préparatoire ou analytique. Purifications préparatoires visent à produire une quantité relativement importante de protéines purifiées pour une utilisation ultérieure. Les exemples incluent la préparation de produits commerciaux tels que les enzymes (par exemple la lactase), les protéines nutritionnelles (par exemple l'isolat de protéine de soja) et certains produits biopharmaceutiques (par exemple l'insuline). Plusieurs étapes de purifications préparatoires sont souvent déployées pour éliminer les sous-produits, tels que les protéines de la cellule hôte, qui constituent une menace potentielle pour la santé du patient. [1] Purification analytique produit une quantité relativement faible d'une protéine à diverses fins de recherche ou d'analyse, y compris l'identification, la quantification et les études de la structure, des modifications post-traductionnelles et de la fonction de la protéine. La pepsine et l'uréase ont été les premières protéines purifiées au point de pouvoir être cristallisées. [2]

Extraction Modifier

Si la protéine d'intérêt n'est pas sécrétée par l'organisme dans la solution environnante, la première étape de chaque processus de purification est la rupture des cellules contenant la protéine. En fonction de la fragilité de la protéine et de la stabilité des cellules, on pourra par exemple utiliser l'une des méthodes suivantes : i) congélation et décongélation répétées, ii) sonication, iii) homogénéisation par haute pression (presse française), iv ) homogénéisation par broyage (broyeur à billes), et v) perméabilisation par des détergents (ex. Triton X-100) et/ou des enzymes (ex. lysozyme). [3] Enfin, les débris cellulaires peuvent être éliminés par centrifugation afin que les protéines et autres composés solubles restent dans le surnageant.

Des protéases sont également libérées lors de la lyse cellulaire, qui commencera à digérer les protéines dans la solution. Si la protéine d'intérêt est sensible à la protéolyse, il est recommandé de procéder rapidement, et de garder l'extrait au frais, pour ralentir la digestion. En variante, un ou plusieurs inhibiteurs de protéase peuvent être ajoutés au tampon de lyse immédiatement avant la rupture des cellules. Parfois, il est également nécessaire d'ajouter de la DNAse afin de réduire la viscosité du lysat cellulaire causée par une teneur élevée en ADN.

Précipitation et solubilisation différentielle Modifier

Dans la purification des protéines en vrac, une première étape courante pour isoler les protéines est la précipitation avec du sulfate d'ammonium (NH4)2DONC4. [4] Ceci est réalisé en ajoutant des quantités croissantes de sulfate d'ammonium et en collectant les différentes fractions de protéine précipitée. Par la suite, le sulfate d'ammonium peut être éliminé par dialyse. Au cours de l'étape de précipitation du sulfate d'ammonium, les groupes hydrophobes présents sur les protéines sont exposés à l'atmosphère, attirant d'autres groupes hydrophobes, ce qui entraîne la formation d'un agrégat de composants hydrophobes. Dans ce cas, le précipité de protéine sera typiquement visible à l'œil nu. Un avantage de cette méthode est qu'elle peut être réalisée à moindre coût, même avec de très gros volumes.

Les premières protéines à purifier sont des protéines hydrosolubles. La purification des protéines membranaires intégrales nécessite une rupture de la membrane cellulaire afin d'isoler une protéine particulière des autres qui se trouvent dans le même compartiment membranaire. Parfois, une fraction membranaire particulière peut être isolée en premier, par exemple en isolant les mitochondries des cellules avant de purifier une protéine située dans une membrane mitochondriale. Un détergent tel que le dodécyl sulfate de sodium (SDS) peut être utilisé pour dissoudre les membranes cellulaires et maintenir les protéines membranaires en solution pendant la purification. Cependant, comme le SDS provoque une dénaturation, des détergents plus doux tels que Triton X-100 ou CHAPS peuvent être utilisés pour conserver conformation pendant la purification complète.

Ultracentrifugation Modifier

Centrifugation est un processus qui utilise la force centrifuge pour séparer des mélanges de particules de masses ou de densités variables en suspension dans un liquide. Lorsqu'un récipient (généralement un tube ou une bouteille) contenant un mélange de protéines ou d'autres matières particulaires, telles que des cellules bactériennes, tourne à grande vitesse, l'inertie de chaque particule génère une force dans la direction de la vitesse des particules qui est proportionnelle à sa masse. La tendance d'une particule donnée à se déplacer à travers le liquide en raison de cette force est compensée par la résistance que le liquide exerce sur la particule. L'effet net du « tournage » de l'échantillon dans une centrifugeuse est que les particules massives, petites et denses se déplacent vers l'extérieur plus rapidement que les particules moins massives ou les particules avec plus de « traînée » dans le liquide. Lorsque des suspensions de particules sont "filées" dans une centrifugeuse, un "pastille" peut se former au fond de la cuve qui s'enrichit pour les particules les plus massives à faible traînée dans le liquide.

Les particules non compactées restent majoritairement dans le liquide appelé "surnageant" et peuvent être retirées du récipient séparant ainsi le surnageant de la pastille. Le taux de centrifugation est déterminé par l'accélération angulaire appliquée à l'échantillon, généralement mesurée par rapport à la g. Si les échantillons sont centrifugés suffisamment longtemps, les particules dans le récipient atteindront un équilibre dans lequel les particules s'accumulent spécifiquement à un point dans le récipient où leur densité de flottaison est équilibrée avec la force centrifuge. Une telle centrifugation "à l'équilibre" peut permettre une purification poussée d'une particule donnée.

Centrifugation en gradient de saccharose - un gradient de concentration linéaire de sucre (généralement du saccharose, du glycérol ou un milieu à gradient de densité à base de silice, comme Percoll) est généré dans un tube de telle sorte que la concentration la plus élevée se trouve en bas et la plus faible en haut. Percoll est une marque déposée par les sociétés GE Healthcare. Un échantillon de protéine est ensuite déposé sur le gradient et centrifugé à grande vitesse dans une ultracentrifugeuse. Cela fait migrer les macromolécules lourdes vers le fond du tube plus rapidement que les matériaux plus légers. Lors de la centrifugation en l'absence de saccharose, au fur et à mesure que les particules s'éloignent du centre de rotation, elles subissent de plus en plus de force centrifuge (plus elles se déplacent, plus elles se déplacent rapidement). Le problème avec ceci est que la plage de séparation utile à l'intérieur du récipient est limitée à une petite fenêtre observable. Faire tourner un échantillon deux fois plus longtemps ne signifie pas que la particule d'intérêt ira deux fois plus loin, en fait, elle ira beaucoup plus loin. Cependant, lorsque les protéines se déplacent à travers un gradient de saccharose, elles rencontrent un liquide de densité et de viscosité croissantes. Un gradient de saccharose bien conçu contrebalancera la force centrifuge croissante de sorte que les particules se déplacent en proportion proche du temps qu'elles ont passé dans le champ centrifuge. Les échantillons séparés par ces gradients sont appelés centrifugations « zonales de taux ». Après séparation protéine/particules, le gradient est ensuite fractionné et collecté.

Le choix d'un matériau de départ est la clé de la conception d'un procédé de purification. Chez une plante ou un animal, une protéine particulière n'est généralement pas distribuée de manière homogène dans tout le corps, différents organes ou tissus ont des concentrations plus ou moins élevées de la protéine. L'utilisation des seuls tissus ou organes avec la concentration la plus élevée diminue les volumes nécessaires pour produire une quantité donnée de protéine purifiée. Si la protéine est présente en faible abondance, ou si elle a une valeur élevée, les scientifiques peuvent utiliser la technologie de l'ADN recombinant pour développer des cellules qui produiront de grandes quantités de la protéine souhaitée (c'est ce qu'on appelle un système d'expression). L'expression recombinante permet à la protéine d'être marquée, par ex. par un His-tag [5] ou Strep-tag [6] pour faciliter la purification, réduisant le nombre d'étapes de purification nécessaires.

Une purification analytique utilise généralement trois propriétés pour séparer les protéines. Premièrement, les protéines peuvent être purifiées en fonction de leurs points isoélectriques en les faisant passer à travers un gel à pH gradué ou une colonne échangeuse d'ions. Deuxièmement, les protéines peuvent être séparées en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire par chromatographie d'exclusion stérique ou par analyse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide). Les protéines sont souvent purifiées en utilisant 2D-PAGE et sont ensuite analysées par empreinte de masse peptidique pour établir l'identité de la protéine. Ceci est très utile à des fins scientifiques et les limites de détection des protéines sont aujourd'hui très faibles et des quantités de nanogrammes de protéines sont suffisantes pour leur analyse. Troisièmement, les protéines peuvent être séparées par polarité/hydrophobie via une chromatographie liquide à haute performance ou une chromatographie en phase inverse.

Habituellement, un protocole de purification de protéines contient une ou plusieurs étapes chromatographiques. La procédure de base en chromatographie consiste à faire circuler la solution contenant la protéine à travers une colonne remplie de divers matériaux. Différentes protéines interagissent différemment avec le matériau de la colonne et peuvent ainsi être séparées par le temps nécessaire pour passer la colonne ou les conditions requises pour éluer la protéine de la colonne. Habituellement, les protéines sont détectées lorsqu'elles sortent de la colonne par leur absorbance à 280 nm. De nombreuses méthodes chromatographiques différentes existent :

Chromatographie d'exclusion stérique Modifier

La chromatographie peut être utilisée pour séparer les protéines en solution ou dans des conditions dénaturantes en utilisant des gels poreux. Cette technique est connue sous le nom de chromatographie d'exclusion stérique. Le principe est que les petites molécules doivent traverser un plus grand volume dans une matrice poreuse. Par conséquent, les protéines d'une certaine gamme de taille nécessiteront un volume variable d'éluant (solvant) avant d'être collectées à l'autre extrémité de la colonne de gel.

Dans le cadre de la purification des protéines, l'éluant est généralement regroupé dans différents tubes à essai. Tous les tubes à essai ne contenant aucune trace mesurable de la protéine à purifier sont jetés. La solution restante est ainsi constituée de la protéine à purifier et de toute autre protéine de taille similaire.

Séparation basée sur la charge ou l'hydrophobie Modifier

Chromatographie d'interaction hydrophobe Modifier

Le milieu HIC est amphiphile, avec à la fois des régions hydrophobes et hydrophiles, permettant la séparation des protéines en fonction de leur hydrophobie de surface. Les protéines cibles et leurs espèces d'agrégats de produits ont tendance à avoir des propriétés hydrophobes différentes et leur élimination via HIC purifie davantage la protéine d'intérêt. [7] De plus, l'environnement utilisé emploie généralement des conditions de dénaturation moins dures que d'autres techniques de chromatographie, aidant ainsi à préserver la protéine d'intérêt dans son état natif et fonctionnel. Dans l'eau pure, les interactions entre la résine et les régions hydrophobes de la protéine seraient très faibles, mais cette interaction est renforcée en appliquant un échantillon de protéine à la résine HIC dans un tampon à haute force ionique. La force ionique du tampon est ensuite réduite pour éluer les protéines par ordre d'hydrophobie décroissante. [8]

Chromatographie d'échange d'ions Modifier

La chromatographie échangeuse d'ions sépare les composés selon la nature et le degré de leur charge ionique. La colonne à utiliser est choisie en fonction de son type et de sa force de charge. Les résines échangeuses d'anions ont une charge positive et sont utilisées pour retenir et séparer les composés chargés négativement (anions), tandis que les résines échangeuses de cations ont une charge négative et sont utilisées pour séparer les molécules chargées positivement (cations).

Avant le début de la séparation, un tampon est pompé à travers la colonne pour équilibrer les ions chargés opposés. Lors de l'injection de l'échantillon, les molécules de soluté échangeront avec les ions tampons, chacun étant en compétition pour les sites de liaison sur la résine. La durée de rétention pour chaque soluté dépend de la force de sa charge. Les composés les plus faiblement chargés seront élués en premier, suivis de ceux avec des charges successivement plus fortes. En raison de la nature du mécanisme de séparation, le pH, le type de tampon, la concentration de tampon et la température jouent tous un rôle important dans le contrôle de la séparation.

La chromatographie par échange d'ions est un outil très puissant pour une utilisation dans la purification des protéines et est fréquemment utilisée dans les séparations analytiques et préparatives.

Électrophorèse à flux libre Modifier

L'électrophorèse à flux libre (FFE) est une technique d'électrophorèse sans support qui permet la séparation préparative des protéines dans un flux tampon laminaire en utilisant un champ électrique orthogonal. En utilisant un gradient de pH, qui peut par exemple être induit par des ampholytes, cette technique permet de séparer des isoformes de protéines jusqu'à une résolution de < 0,02 delta-pI.

Chromatographie d'affinité Modifier

La chromatographie d'affinité est une technique de séparation basée sur la conformation moléculaire, qui utilise fréquemment des résines spécifiques à l'application. Ces résines ont des ligands attachés à leurs surfaces qui sont spécifiques des composés à séparer. Le plus souvent, ces ligands fonctionnent d'une manière similaire à celle des interactions anticorps-antigène. Cet ajustement "lock and key" entre le ligand et son composé cible le rend hautement spécifique, générant fréquemment un pic unique, tandis que tout le reste dans l'échantillon n'est pas retenu.

De nombreuses protéines membranaires sont des glycoprotéines et peuvent être purifiées par chromatographie d'affinité de lectine. Les protéines solubilisées dans un détergent peuvent être autorisées à se lier à une résine de chromatographie qui a été modifiée pour avoir une lectine liée de manière covalente. Les protéines qui ne se lient pas à la lectine sont éliminées, puis les glycoprotéines spécifiquement liées peuvent être éluées en ajoutant une concentration élevée d'un sucre qui entre en compétition avec les glycoprotéines liées au site de liaison de la lectine. Certaines lectines ont une affinité élevée de liaison aux oligosaccharides de glycoprotéines qui est difficile à concurrencer avec les sucres, et les glycoprotéines liées doivent être libérées en dénaturant la lectine.

Chromatographie d'immunoaffinité Modifier

La chromatographie d'immunoaffinité utilise la liaison spécifique d'un anticorps-antigène pour purifier sélectivement la protéine cible. La procédure consiste à immobiliser une protéine sur un substrat solide (par exemple, une bille poreuse ou une membrane), qui se lie ensuite sélectivement à la cible, tandis que tout le reste passe à travers. La protéine cible peut être éluée en modifiant le pH ou la salinité. Le ligand immobilisé peut être un anticorps (comme l'immunoglobuline G) ou il peut s'agir d'une protéine (comme la protéine A). Parce que cette méthode n'implique pas d'ingénierie dans une étiquette, elle peut être utilisée pour des protéines provenant de sources naturelles. [9]

Purification d'une protéine marquée Modifier

Une autre façon de marquer les protéines consiste à créer un marqueur peptidique antigénique sur la protéine, puis à purifier la protéine sur une colonne ou en l'incubant avec une résine en vrac recouverte d'un anticorps immobilisé. Cette procédure particulière est connue sous le nom d'immunoprécipitation. L'immunoprécipitation est tout à fait capable de générer une interaction extrêmement spécifique qui aboutit généralement à ne lier que la protéine souhaitée. Les protéines marquées purifiées peuvent ensuite être facilement séparées des autres protéines en solution et ensuite éluées de nouveau dans une solution propre.

Lorsque les balises ne sont plus nécessaires, elles peuvent être séparées par une protéase. Cela implique souvent l'ingénierie d'un site de clivage par la protéase entre l'étiquette et la protéine.

HPLC Modifier

La chromatographie liquide haute performance ou chromatographie liquide haute pression est une forme de chromatographie appliquant une haute pression pour conduire les solutés à travers la colonne plus rapidement. Cela signifie que la diffusion est limitée et la résolution est améliorée. La forme la plus courante est la HPLC en "phase inversée", où le matériau de la colonne est hydrophobe. Les protéines sont éluées par un gradient de quantités croissantes d'un solvant organique, tel que l'acétonitrile. Les protéines éluent en fonction de leur hydrophobie. Après purification par HPLC la protéine est dans une solution qui ne contient que des composés volatils, et peut être facilement lyophilisée. [10] La purification par HPLC entraîne fréquemment la dénaturation des protéines purifiées et n'est donc pas applicable aux protéines qui ne se replient pas spontanément.

A la fin d'une purification de protéine, la protéine doit souvent être concentrée. Différentes méthodes existent.

Lyophilisation Modifier

Si la solution ne contient aucun autre composant soluble que la protéine en question, la protéine peut être lyophilisée (séchée). Ceci est généralement effectué après une analyse HPLC. Cela supprime simplement tous les composants volatils, laissant les protéines derrière.

Ultrafiltration Modifier

L'ultrafiltration concentre une solution protéique à l'aide de membranes perméables sélectives. La fonction de la membrane est de laisser passer l'eau et les petites molécules tout en retenant la protéine. La solution est forcée contre la membrane par une pompe mécanique, une pression de gaz ou une centrifugation.

La méthode la plus générale pour surveiller le processus de purification consiste à exécuter une SDS-PAGE des différentes étapes. Cette méthode ne donne qu'une mesure approximative des quantités de différentes protéines dans le mélange, et elle n'est pas en mesure de faire la distinction entre les protéines ayant un poids moléculaire apparent similaire.

Si la protéine a une caractéristique spectroscopique distinctive ou une activité enzymatique, cette propriété peut être utilisée pour détecter et quantifier la protéine spécifique, et ainsi pour sélectionner les fractions de la séparation, qui contiennent la protéine. Si des anticorps dirigés contre la protéine sont disponibles, le western blot et l'ELISA peuvent détecter et quantifier spécifiquement la quantité de protéine souhaitée. Certaines protéines fonctionnent comme des récepteurs et peuvent être détectées pendant les étapes de purification par un test de liaison de ligand, souvent à l'aide d'un ligand radioactif.

Afin d'évaluer le processus de purification en plusieurs étapes, la quantité de protéine spécifique doit être comparée à la quantité de protéine totale. Ce dernier peut être déterminé par le dosage des protéines totales de Bradford ou par l'absorbance de la lumière à 280 nm, cependant certains réactifs utilisés pendant le processus de purification peuvent interférer avec la quantification. Par exemple, l'imidazole (couramment utilisé pour la purification des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine) est un analogue d'acide aminé et, à de faibles concentrations, interférera avec le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) pour la quantification des protéines totales. Les impuretés dans l'imidazole de faible qualité seront également absorbées à 280 nm, ce qui entraînera une lecture inexacte de la concentration en protéines à partir de l'absorbance UV.

Une autre méthode à considérer est la résonance plasmonique de surface (SPR). La SPR peut détecter la liaison de molécules sans marqueur à la surface d'une puce. Si la protéine souhaitée est un anticorps, la liaison peut être traduite directement en l'activité de la protéine. On peut exprimer la concentration active de la protéine en pourcentage de la protéine totale. La SPR peut être une méthode puissante pour déterminer rapidement l'activité des protéines et le rendement global. C'est une technologie puissante qui nécessite un instrument pour fonctionner.

Électrophorèse en condition dénaturante Modifier

L'électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire courante qui peut être utilisée à la fois comme méthode de préparation et d'analyse. Le principe de l'électrophorèse repose sur le mouvement d'un ion chargé dans un champ électrique. En pratique, les protéines sont dénaturées dans une solution contenant un détergent (SDS). Dans ces conditions, les protéines sont dépliées et enrobées de molécules détergentes chargées négativement. Les protéines dans SDS-PAGE sont séparées sur la seule base de leur taille.

Dans les méthodes analytiques, la protéine migre sous forme de bandes en fonction de la taille. Chaque bande peut être détectée à l'aide de colorants tels que le bleu de Coomassie ou le colorant à l'argent. Les méthodes de préparation pour purifier de grandes quantités de protéines nécessitent l'extraction de la protéine du gel électrophorétique. Cette extraction peut impliquer l'excision du gel contenant une bande ou l'élution de la bande directement du gel lorsqu'elle s'écoule de l'extrémité du gel.

Dans le contexte d'une stratégie de purification, l'électrophorèse en conditions dénaturantes offre une résolution améliorée par rapport à la chromatographie d'exclusion stérique, mais ne s'adapte pas à une grande quantité de protéines dans un échantillon ainsi qu'aux colonnes de chromatographie tardives.

Électrophorèse en condition non dénaturante Modifier

Une procédure électrophorétique non dénaturante pour isoler des métalloprotéines bioactives dans des mélanges de protéines complexes est la PAGE native préparative. L'intégrité ou l'intégrité structurelle de la protéine isolée doit être confirmée par une méthode indépendante. [11]


La description

Guide to Protein Purification, Second Edition fournit une mise à jour complète des méthodes existantes dans le domaine, reflétant les énormes progrès réalisés au cours des deux dernières décennies. En particulier, la protéomique, la spectrométrie de masse et la technologie de l'ADN ont révolutionné le domaine depuis la publication de la première édition, mais à travers toutes les avancées, la purification des protéines reste une première étape indispensable pour comprendre leur fonction. Ce volume examine les méthodes les plus fiables et les plus robustes pour les chercheurs en biochimie, biologie moléculaire et cellulaire, génétique, pharmacologie et biotechnologie et établit une norme pour les meilleures pratiques dans le domaine. Il explique comment ces méthodes de pointe traditionnelles et nouvelles se connectent aux avancées explosives dans le domaine. Ce "Guide de" donne des conseils pratiques pour éviter des erreurs coûteuses dans le choix d'une méthode et apporte la perspective des meilleurs chercheurs tout en présentant un aperçu complet du domaine aujourd'hui.


Voir la vidéo: Synthèse des protéines: Traduction (Septembre 2022).


Commentaires:

  1. JoJok

    Il a tout à fait raison

  2. Taicligh

    Désolé, la question a été supprimée.

  3. Fegrel

    Pièce très précieuse

  4. Shakahn

    Il y a quelque chose dans ce domaine. Merci pour l'explication. Je ne le savais pas.



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