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La lumière à 405 nm déclenche-t-elle la phosphorescence dans l'œil ?

La lumière à 405 nm déclenche-t-elle la phosphorescence dans l'œil ?


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En jouant avec un laser bleu/violet (5 mW, 405 nm) ce soir, j'ai remarqué que sur des surfaces sombres et non fluorescentes, la réflexion du faisceau était traînée par ce qui ressemblait à une réflexion plus faible du faisceau. L'effet a été le plus facilement observé lorsque j'ai déplacé le laser dans un mouvement circulaire. L'apparent 2sd la réflexion n'était pas produite par un lobe latéral de la diode laser, car elle était toujours à la traîne de la réflexion principale, quelle que soit la rotation dans le sens horaire ou antihoraire. De plus, lorsque j'arrête de déplacer le faisceau, la deuxième « réflexion » a rapidement fusionné avec la réflexion du faisceau principal.

Je doute que cela soit causé par la phosphorescence du matériau (tissu) que je traitais au laser, car cela s'est également manifesté lorsque j'ai pointé le laser sur le sol, d'autres types de tissu et des murs peints.

Alors, est-ce que les bâtonnets, les cônes, le violet visuel ou d'autres composants oculaires phosphorescent lorsqu'ils sont touchés par une lumière bleu foncé ?


Au lieu de la phosphorescence, une explication plus parcimonieuse est la perception de images rémanentes. Des images rémanentes apparaissent régulièrement après la visualisation d'un stimulus lumineux. Ils se produisent au même endroit dans le champ visuel que le stimulus d'origine, mais manquent de clarté. Les images rémanentes dépendent de l'intensité et contraste du stimulus d'origine (c'est-à-dire qu'ils sont plus prononcés avec des stimuli lumineux dans un environnement sombre), le moment de fixation (c'est-à-dire qu'une fixation plus longue génère des images rémanentes plus persistantes), et adaptation rétinienne (c'est-à-dire que les environnements sombres améliorent les images rémanentes).

Les images après sont presque toujours la couleur complémentaire (image rémanente négative) du stimulus d'origine, mais peuvent très brièvement être de la même couleur (image rémanente positive) lors de la visualisation d'un stimulus exceptionnellement lumineux. Un stimulus produit systématiquement la même image rémanente, dont la taille varie en fonction de la distance entre la personne et l'arrière-plan. Après les images sont souvent ravivées par le clignotement.

On pense que les images rémanentes proviennent principalement du photoblanchiment de la rétine, bien que des processus cérébraux puissent également y contribuer.

La phosphorescence de la rétine doit être induite par injection de marqueurs phosphorescents (Wanek et al., 2013). Autant que je sache, la rétine n'est pas autophosphorescente.

Les références
- Gersztenkorn & Lee, Enquête Ophtalmol, (2015): 1-35
- Wanek et al., Curr Eye Res (2012); 37(2): 132-137


Fluorescence et phosphorescence

La fluorescence et la phosphorescence sont des types de méthodes de luminescence moléculaire. Une molécule d'analyte absorbe un photon et excite une espèce. Le spectre d'émission peut fournir une analyse qualitative et quantitative. Les termes fluorescence et phosphorescence sont généralement appelés photoluminescence car les deux sont similaires dans l'excitation apportée par l'absorption d'un photon. La fluorescence diffère de la phosphorescence en ce que la transition énergétique électronique qui est responsable de la fluorescence ne change pas dans le spin des électrons, ce qui entraîne des électrons de courte durée (<10 -5 s) dans l'état excité de fluorescence. Dans la phosphorescence, il y a un changement dans le spin des électrons, ce qui entraîne une durée de vie plus longue de l'état excité (de quelques secondes à quelques minutes). La fluorescence et la phosphorescence se produisent à une longueur d'onde plus longue que le rayonnement d'excitation.


Imagerie et analyse spectroscopique de cellules vivantes

Mikko Koskinen , . Pirta Hotulainen , dans Méthodes en Enzymologie , 2012

2.3.3 Exemple d'expérience

Dans cette expérience de photoactivation, des neurones hippocampiques de rat d'embryons E17 ont été cotransfectés avec PAGFP-actine et mCherry à DIV 10, et l'analyse de photoactivation a été réalisée à DIV 14 selon la configuration du microscope et les paramètres décrits dans la section 2.3.1. Dans le test de photoactivation, le temps de transfection optimal était plus long que ce que nous utilisons normalement (normalement un jour). Le temps de transfection plus long a augmenté l'intensité de la PAGFP activée mais n'a pas affecté la survie des neurones. La cellule et la colonne vertébrale représentatives ont été sélectionnées sur la base de la fluorescence mCherry (Fig. 3.3 A). Le retour sur investissement pour la photoactivation a été défini autour de la colonne vertébrale sélectionnée (Fig. 3.3 A), et l'analyse de photoactivation a été enregistrée à l'aide de l'assistant FRAP. Les images de temps excitées à 488 nm avant (− 1,6 s) et après (de + 1,6 à + 1000 s) la photoactivation sont représentées sur la figure 3.3 A sous forme de cartes thermiques (blanc-intensité la plus élevée, bleu-intensité la plus faible). Le protocole de photoactivation a été enregistré à partir de quatre épines provenant de trois cellules différentes. Seules les épines contenant un pool stable de fluorescence F-actine observable 300 s après l'activation ont été prises en compte dans une analyse plus approfondie. La courbe de décroissance de fluorescence moyenne montre (voir la ligne pointillée sur la figure 3.3 B) qu'environ 10 % de la F-actine totale appartient à un pool stable de F-actine dans ces 14 épines DIV.

Graphique 3.3. (A) Les neurones de l'hippocampe de rats E17 ont été cotransfectés avec mCherry et PAGFP-actine à DIV 10 et imagés à DIV 14. Les cellules ont été visualisées par excitation mCherry et le retour sur investissement pour l'activation (cercle rouge) a été défini en fonction de la fluorescence mCherry. Barre d'échelle, 1 m. (B) La décroissance moyenne de fluorescence de la PAGFP-actine à partir de quatre épines qui contenaient le pool stable visible après 5 min de postactivation révèle que la taille du pool stable est d'environ 10 % de l'actine totale. Les barres d'erreur représentent les SEM. (C) Une carte thermique des images time-lapse prises avant (− 1,6 s) et après (de 1,6 à 1000 s) la photoactivation montre l'augmentation (1,6 s) puis la décroissance de la fluorescence PAGFP-actine. Le contour de la colonne vertébrale est basé sur la fluorescence mCherry acquise simultanément.


A quoi ressemble un spectre d'absorption

Le diagramme ci-dessous montre un spectre d'absorption UV-visible simple pour le buta-1,3-diène - une molécule dont nous parlerons plus tard. L'absorbance (sur l'axe vertical) est juste une mesure de la quantité de lumière absorbée. Plus la valeur est élevée, plus une longueur d'onde particulière est absorbée.

Vous verrez que l'absorption culmine à une valeur de 217 nm. C'est dans l'ultra-violet et il n'y aurait donc aucun signe visible d'absorption de lumière - le buta-1,3-diène est incolore. Vous lisez le symbole sur le graphique comme "lambda-max". En buta-1,3-diène, CH2=CH-CH=CH2, il n'y a pas d'électrons non-liants. Cela signifie que les seuls sauts d'électrons qui ont lieu (dans la plage que le spectromètre peut mesurer) vont de la liaison pi aux orbitales anti-liaison pi.


La lumière à 405 nm déclenche-t-elle la phosphorescence dans l'œil ? - La biologie

À chaque extrémité de l'arc-en-ciel, il y a de la lumière que nous ne pouvons pas voir. Au-dessous de l'extrémité rouge se trouve la lumière proche de l'infrarouge, dont la longueur d'onde est plus courte que l'infrarouge que nous ressentons sous forme de chaleur. Au-dessus de l'extrémité violette de l'arc-en-ciel se trouve l'ultraviolet proche, dont la longueur d'onde est plus longue que la lumière ultraviolette qui provoque les coups de soleil.

Parce que ces lumières invisibles sont si proches de la lumière visible que nous pouvons voir, elles agissent à bien des égards comme la lumière normale. Ils peuvent être mis au point avec des objectifs et les caméras peuvent les voir.


Lumière fluorescente

Voir dans l'infrarouge

Une source de lumière proche infrarouge est aussi proche que la télécommande de votre téléviseur.


Télécommande infrarouge

Regardez directement à l'avant de la télécommande et appuyez sur quelques boutons. Vous ne pouvez rien voir changer. Mais pointez maintenant la télécommande vers un appareil photo numérique ou une caméra vidéo bon marché et appuyez sur les boutons. Maintenant, sur l'écran de l'appareil photo, vous voyez un phare lumineux clignotant. Vous pouvez l'utiliser comme lampe de poche pour lire, tant que vous regardez dans l'écran de l'appareil photo.


Télécommande infrarouge

Les capteurs des appareils photo numériques peuvent facilement voir dans l'infrarouge. En fait, ils sont plus sensibles aux infrarouges qu'à la lumière normale. Les fabricants de caméras tentent de résoudre ce problème en ajoutant des filtres de blocage infrarouge devant le capteur. Dans les appareils photo bon marché, ceux-ci ne sont pas très efficaces. Dans les appareils photo plus chers, tels que l'appareil photo reflex numérique à objectif unique utilisé pour prendre la photo ci-dessous, la lumière infrarouge est beaucoup plus faible que dans les photos de l'appareil photo de poche ci-dessus.


Télécommande infrarouge

Voir dans l'ultra-violet

Les sources de lumière ultraviolette bon marché utilisent une lampe à vapeur de mercure et du verre violet foncé qui empêche la majeure partie de la lumière visible de briller. Malheureusement, beaucoup de lumière bleue et violette passe.

Une meilleure source est une diode électroluminescente ultraviolette. Alors que certaines des LED bon marché appelées « ultraviolettes » ne sont en fait que des LED violettes, vous pouvez obtenir de bonnes LED dont la longueur d'onde est de 395 nanomètres ou moins. Au moment d'écrire ces lignes, les LED 395 nm peuvent être achetées pour quelques dollars, tandis qu'une lampe-stylo LED 375 nm coûte 25 $, et une LED 255 nm vous coûtera 600,00 $.

Il n'est pas conseillé de regarder dans une LED ultraviolette, pas plus que de regarder le soleil. Mais un rapide coup d'œil montre qu'une LED de 395 nm semble légèrement bleu-violet à l'œil humain. Mais lorsque nous le regardons à travers l'appareil photo, nous pouvons voir que le capteur de l'appareil photo est à nouveau plutôt bon pour voir cette lumière autrement principalement invisible. La lumière semble bleu-blanc à la caméra parce que la caméra et son logiciel interprètent l'ultraviolet comme du bleu, et cette lumière est très brillante dans l'ultraviolet.


Diodes émettrices de lumière ultraviolette

Les abeilles peuvent voir dans l'ultraviolet. Les fleurs en profitent et ont des pigments ultraviolets que les abeilles peuvent voir mais pas les humains. Mais lorsque nous prenons une telle fleur, dans ce cas un coquelicot de Californie, et l'éclairons avec notre LED ultraviolette de 395 nanomètres, et prenons une photo, nous pouvons voir certaines de ces marques.

Sur la photo ci-dessous, j'ai pris la photo de gauche en lumière normale, et la photo de droite en utilisant la LED UV. Vous pouvez voir que les bords de la fleur sont de couleur plus claire et que le centre est plus foncé, à l'exception des étamines qui sont très brillantes.


Coquelicot dans le visible et l'ultraviolet

Encre invisible

L'encre invisible a de nombreuses utilisations au-delà des communications secrètes entre espions ou criminels. L'une de ces utilisations est une mesure anti-contrefaçon d'argent, comme le montre la photo ci-dessous, où un billet de vingt dollars américains est éclairé par derrière par l'une de nos LED ultraviolettes.


Billet de vingt dollars en lumière ultraviolette

Dans la bande verte brillante d'encre fluorescente, vous pouvez lire les mots "USA TWENTY".

Comment voir l'encre invisible

  1. Encre invisible (soit dans un flacon soit dans un stylo à encre invisible).
  2. Une source de lumière ultraviolette, telle qu'une diode électroluminescente UV.
  3. (Facultatif) Lunettes de soleil qui bloquent le bleu (lunettes jaunes).

Le stylo à encre invisible est vendu comme marqueur de sécurité, vous pouvez donc écrire de manière invisible votre nom ou votre permis de conduire sur vos effets personnels.

Les colorants fluorescents peuvent être utilisés comme encre dans un stylo plume ou une plume d'oie, ou vous pouvez simplement tremper un coton-tige dans le colorant et écrire avec.

Ils peuvent également être versés dans des tampons encreurs et utilisés comme tampons à main lors de danses ou d'événements, pour permettre une rentrée sans avoir à payer à nouveau.

Pour voir l'encre, placez une petite pile bouton au lithium entre les deux fils de la LED ultraviolette. S'il ne s'allume pas, retournez la batterie (les LED sont des diodes, et ne s'allument que si le courant circule dans le bon sens). Vous pouvez utiliser deux piles pour obtenir une lumière plus vive. Empilez simplement les batteries les unes sur les autres et placez les fils LED en haut et en bas comme s'il s'agissait d'une seule batterie.


LED ultraviolette avec deux piles CR2032

Dirigez la lumière vers l'écriture invisible. Vous pouvez le faire dans un endroit sombre pour une meilleure lisibilité.

Les lunettes de soleil à blocage bleu sont utiles pour améliorer le contraste. Ils bloquent la majeure partie de la lumière bleue et violette qui s'échappe à travers les filtres en verre violet des lampes ultraviolettes à vapeur de mercure. Elles sont toujours utiles avec les LED ultraviolettes, même si celles-ci émettent beaucoup moins de lumière visible.

Comment faire votre propre colorant fluorescent

Vous pouvez facilement fabriquer votre propre colorant fluorescent, après un voyage à la cuisine pour de l'épice de curcuma en poudre et à la salle de bain pour de l'alcool à friction.

Mettez une cuillère à café de curcuma dans un verre et ajoutez quelques cuillères à soupe d'alcool. Pliez une serviette en papier en quatre pour former un entonnoir et filtrez le liquide dans un autre verre. La photo ci-dessous montre le liquide dans un petit flacon en verre, éclairé par nos LED UV.

Vous pouvez utiliser un coton-tige pour écrire des choses avec votre nouvelle encre. Il apparaîtra en jaune sur le papier et en jaune-vert brillant lorsqu'il sera éclairé par une lumière ultraviolette.


Petite fiole de colorant de curcuma

Comment fait-il ?

Un colorant fluorescent typique (plusieurs sont illustrés ci-dessous) a de nombreux liaisons conjuguées, où les doubles liaisons et les liaisons simples alternent dans la molécule.


Molécule de curcumine

Ce qui se passe réellement dans la molécule est plus compliqué que ne le suggèrent les simples diagrammes, car les électrons qui forment ces liaisons ne sont pas coincés à un endroit, mais ont tendance à errer ou à s'étaler le long de la molécule entière. Les électrons ont de nombreux états d'énergie possibles. L'état d'énergie le plus bas (le état fondamental) est celui où les électrons sont les plus proches du noyau de l'atome et sont appariés, chaque électron de la paire tournant dans la direction opposée. On dit qu'un électron est Tournoiement en haut, et l'autre est tourner vers le bas.


Molécule de bromure d'éthidium

À température ambiante, les électrons ont suffisamment d'énergie thermique pour rebondir et se heurter au hasard entre les niveaux d'énergie. Mais la plupart des électrons seront à des niveaux d'énergie inférieurs à un moment donné.


Molécule de fluorescéine

Les électrons de la molécule ont des niveaux d'énergie de différents types. Les niveaux d'énergie de base sont les états électroniques (l'état fondamental, les états fondamentaux excités et l'état triplet sorti). Mais au-dessus de ceux-ci se trouvent des états d'énergie vibrationnelle et rotationnelle.


Molécule d'iodure de propidium

Ces états de vibration supplémentaires permettent à l'électron d'absorber des photons de différentes énergies qui élèvent l'énergie de l'électron à différents niveaux. Étant donné que l'énergie d'un photon est liée à sa longueur d'onde (la couleur de la lumière), de nombreuses couleurs de lumière légèrement différentes peuvent être absorbées par l'électron pour le pousser dans des états d'énergie plus élevés.


Molécule de sulforhodamine B

Une fois qu'un électron a absorbé un photon et est passé à un état d'énergie plus élevé, il peut facilement perdre une partie de l'énergie en libérant l'énergie vibratoire sous forme de chaleur. L'électron s'installe alors dans le niveau d'énergie vibratoire le plus bas à cet état électronique excité.

Les trois états électroniques sont schématisés ci-dessous. Dans l'état fondamental, les électrons sont appariés, un avec un spin up et un avec un spin down. Dans l'état excité, l'un des électrons a une énergie plus élevée, mais a toujours le spin opposé. Dans le troisième état (triplet), l'un des électrons a inversé son spin, de sorte que les deux électrons ont le même spin.


États électroniques

Tous ces niveaux et états d'énergie se réunissent dans ce qu'on appelle le Diagramme de Jablonski, qui est utilisé pour montrer ce qui se passe pendant la fluorescence.


Diagramme de Jablonski pour la fluorescence

Le diagramme montre un électron à l'état fondamental absorbant un photon et passant au deuxième état singulet excité (S2). Cette transition est représentée en violet. Parce que le photon avait plus d'énergie qu'il n'en fallait pour atteindre le deuxième état électronique excité, l'électron se trouve à l'un des niveaux d'énergie vibratoire de cet état électronique. Au fil du temps, l'électron perd de l'énergie sous forme de chaleur et s'installe dans le niveau vibratoire inférieur du deuxième état singulet excité. Il peut perdre plus d'énergie sous forme de chaleur et se déplacer vers le bas de l'état singulet excité 1, soit en une seule étape, soit en plusieurs petites étapes, s'arrêtant à différents niveaux d'énergie vibratoire. Ces baisses d'énergie sont représentées en rouge sur le schéma.

Il est possible que l'électron perde encore de l'énergie, soit en émettant un photon de lumière, soit par ce qu'on appelle non radiatif signifie, où l'énergie finit sous forme de chaleur. Lorsqu'un photon est émis, on dit que la molécule est fluorescente. Ceci est indiqué en jaune sur le schéma.


Diagramme de Jablonski pour la phosphorescence

Parfois, l'électron perdra de l'énergie en renversant son spin et passera à l'état de triplet excité. Il peut alors revenir en arrière et devenir fluorescent comme avant, auquel cas on parle de fluorescence retardée. Ou il peut basculer à nouveau et sauter à l'un des niveaux d'énergie vibratoire juste au-dessus de l'état fondamental du singulet. Nous appelons cela la phosphorescence. Le retournement des spins des électrons est statistiquement défavorable, ce qui retarde la libération de l'énergie sous forme de photon. Les matériaux phosphorescents brillent pendant un certain temps après que la lumière sortante est supprimée (les peintures phosphorescentes sont phosphorescentes).

L'ajout d'énergie thermique augmente la probabilité que les électrons se détachent de leur état actuel et tombent dans des états inférieurs. Chauffer une lueur dans le jouet sombre le rendra plus brillant, mais la lueur s'estompera beaucoup plus rapidement.

Kryptonite

Un matériau phosphorescent de très longue durée a récemment été découvert. Il brille d'un vert vif pendant plus de 12 heures (toute la nuit) après avoir été chargé au soleil de l'après-midi pendant une heure ou deux. Il dure si longtemps et brille si fort qu'il a été nommé Kryptonite, d'après le minéral vert brillant des bandes dessinées et des films de Superman.


Kryptonite à la lumière

Vous pouvez charger ce truc en le plaçant à côté d'une lampe pendant un moment, puis éteindre la lampe et avoir une veilleuse gratuite, ou lire des bandes dessinées de Superman avec sous les couvertures.


Kryptonite dans le noir

Imaginez saupoudrer du sable fabriqué à partir de Kryptonite sur les trottoirs avant que le béton ne durcisse. Désormais, vous n'aurez plus besoin de lampadaires. À combien d'autres utilisations pouvez-vous penser ? Publiez vos idées sur notre babillard.


Epi-illumination

En épi-illumination, un séparateur de faisceau dichroïque est utilisé pour dévier la lumière incidente vers l'échantillon. Les caractéristiques spectrales des miroirs dichroïques ont été conçues de manière à ce que seules les longueurs d'onde d'excitation souhaitées soient déviées vers le bas à travers l'objectif sur l'échantillon, tandis que les longueurs d'onde indésirables sont transmises par le miroir dichroïque et collectées dans un piège à lumière [15] derrière le miroir dichroïque. L'élimination de cette lumière d'excitation indésirable entraîne une diminution significative de la lumière parasite et améliore ainsi le contraste de l'image. Le miroir dichromatique dévie la lumière d'excitation souhaitée (courte longueur d'onde) à travers l'objectif sur l'échantillon, mais est transparent pour les longueurs d'onde de fluorescence plus longues. Le filtre de suppression (filtre barrière) absorbe (ou réfléchit) la lumière d'excitation réfléchie par l'échantillon et les surfaces de lentilles de l'objectif, mais est très transparent à la fluorescence, qui peut ainsi atteindre les oculaires. L'efficacité de l'épi-illumination est liée à la quatrième puissance de l'ouverture numérique (NA) d'un objectif, servant dans l'épi-illumination d'abord comme condensateur puis pour l'observation comme lentille collectrice de lumière. Au moment de la commercialisation des premiers épi-illuminateurs multi-longueurs d'onde, seuls des objectifs de forte puissance (x70, x100) étaient disponibles avec une NA élevée (0,95, 1,30). Suite aux suggestions de Ploem [21, 22], Leitz a été le premier fabricant à produire des objectifs de puissance modérée comme l'objectif à immersion d'huile x40 avec une NA de 1,30 (Figure 9).Ce nouveau type d'objectif, spécialement conçu pour la microscopie à fluorescence en épi-illumination, a permis d'obtenir des images très lumineuses permettant des temps d'exposition courts en microphotographie de fluorescence de routine.

A droite : Fig. 9 : prototype d'objectif à immersion dans l'huile de Leitz (Leica) début (1967) ("Versuchs") x40 avec un NA 1,30 développé pour des expériences d'essai en technologie d'épi-illumination par fluorescence.


Méthodes

Ingénierie des protéines

La conception de K-GECO est basée sur des conceptions GECI bien établies rapportées précédemment [18, 33, 45, 46, 47]. La construction initiale des indicateurs Ca 2+ basés sur mKate2 et FusionRed a été réalisée en chevauchant l'assemblage des quatre parties d'ADN codant pour les fragments de protéines suivants : les parties N-terminale (1-145) et C-terminale (146-223) de mKate2 ou FusionRed, le peptide RS20 et le CaM de R-GECO1. Les fragments ont été amplifiés par PCR à partir de mKate2, FusionRed (un cadeau aimable de Michael Davidson) et de l'ADN R-GECO1. La région de chevauchement et les sites de restriction ont été codés dans les amorces. L'ADN codant pour ckkap a été synthétisé par Integrated DNA Technologies (IDT). Les produits de PCR purifiés ont été regroupés et assemblés dans une réaction de PCR chevauchante. Le produit PCR assemblé résultant a été purifié, digéré avec Xhomoi et De derrièreIII (Thermo Fisher Scientific), puis ligaturé dans un vecteur pBAD/His B digéré de manière similaire (Thermo Fisher Scientific). Le produit de ligature a été transformé en électrocompétent E. coli souches de cellules DH10B. Les plasmides ont été purifiés avec le kit miniprep GeneJET (Thermo Fisher Scientific) puis séquencés à l'aide du kit de séquençage BigDye Terminator Cycle (Thermo Fisher Scientific).

Des amplifications EP-PCR ont été réalisées pour construire des bibliothèques de mutagenèse aléatoire. Les produits EP-PCR ont été digérés avec Xhomoi et De derrièreIII, puis ligaturé dans un vecteur pBAD/His B digéré de manière similaire (Thermo Fisher Scientific). Pour construire des bibliothèques de mutagenèse dirigée et de mutagenèse par saturation, le kit de mutagenèse dirigée QuikChange Lightning Single ou Multi (Agilent Technologies) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Les bibliothèques de variantes résultantes ont été transformées en E. coli souches DH10B et incubées pendant la nuit à 37 ° C sur des boîtes de Pétri de 10 cm avec de la gélose au bouillon de lysogénie (LB) additionnée de 400 g/mL d'ampicilline (Sigma) et de 0,02 % (poids/vol) de L-arabinose (Alfa Aesar).

Un système d'imagerie personnalisé a été utilisé pour le dépistage des K-GECO sur plaque avec E. coli colonies exprimant les variants [48]. Lors du criblage, des images de fluorescence de E. coli des colonies ont été prélevées pour chaque boîte de Pétri avec un filtre d'excitation de 542/27 nm et un filtre d'émission de 609/57 nm. Les colonies avec l'intensité de fluorescence la plus élevée dans chaque image ont ensuite été prélevées et cultivées dans 4 ml de milieu LB liquide avec 100 g/ml d'ampicilline et 0,02 % de L-arabinose à 37 °C pendant la nuit. Les protéines ont ensuite été extraites à l'aide de réactifs B-PER (Thermo Fisher Scientific) à partir de la culture liquide. L'extraction des protéines a été utilisée pour un criblage secondaire du test de réponse induite par Ca 2+ en utilisant un tampon sans Ca 2+ (30 mM d'acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS), 100 mM de KCl et 10 mM d'EGTA à pH 7,2) et Ca 2+ -tampon (30 mM MOPS, 100 mM KCl et 10 mM Ca-EGTA à pH 7,2) dans un lecteur de microplaques à fluorescence Safire2 (Tecan).

Caractérisation in vitro

Pour purifier les variants K-GECO pour la caractérisation in vitro, le plasmide pBAD/His B codant pour le variant d'intérêt a été utilisé pour transformer les électrocompétents E. coli Cellules DH10B puis étalées sur plaque de gélose LB avec de l'ampicilline (400 g/mL). Des colonies isolées ont été prélevées et inoculées dans 5 ml de milieu LB additionné de 100 g/ml d'ampicilline. Les sous-cultures bactériennes ont été incubées une nuit à 37°C. Ensuite, 5 mL de repiquage bactérien ont été ajoutés dans 500 mL de milieu LB avec 100 µg/mL d'ampicilline. Les cultures ont été incubées à 37°C jusqu'à une DO de 0,6. Après induction avec du L-arabinose à une concentration finale de 0,02 % (p/vol), les cultures ont ensuite été incubées à 20°C pendant une nuit. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 4000 g pendant 10 min, remis en suspension dans du tampon Tris-HCl 30 mM (pH 7,4), lysé à l'aide d'une presse française, puis clarifié par centrifugation à 13 000 g pendant 30 minutes. Les protéines ont été purifiées à partir de l'extrait acellulaire par chromatographie d'affinité Ni-NTA (MCLAB). Le tampon de protéines purifiées a été échangé dans 10 mM de MOPS, 100 mM de KCl, pH 7,2. Les spectres d'absorption ont été enregistrés sur un spectrophotomètre UV-visible DU-800 (Beckman) et les spectres de fluorescence ont été enregistrés sur un lecteur de plaque à fluorescence Safire2 (Tecan).

Pour déterminer le rendement quantique, la protéine fluorescente mCherry a été utilisée comme standard. Le protocole détaillé a été décrit précédemment [18]. Brièvement, les spectres d'émission de fluorescence de chaque dilution de la solution protéique des variants mCherry et K-GECO ont été enregistrés. Les intensités de fluorescence totales ont été obtenues par intégration. L'intensité de fluorescence intégrée en fonction de l'absorbance a été tracée pour mCherry et K-GECO. Le rendement quantique a été déterminé à partir des pentes de mCherry et K-GECOs. Le coefficient d'extinction a été déterminé en mesurant d'abord le spectre d'absorption des variants de K-GECO dans un tampon sans Ca 2+ et dans un tampon Ca 2+. L'absorption a été mesurée après dénaturation alcaline. La concentration en protéine a été déterminée en supposant que le chromophore dénaturé a un coefficient d'extinction de 44 000 M -1 cm -1 à 446 nm. Le coefficient d'extinction des variants de K-GECO a été calculé en divisant le pic d'absorbance maximum par la concentration de protéine.

Pour le Ca 2+ K détermination, la solution de protéine purifiée a été diluée dans une série de tampons, qui ont été préparés en mélangeant un tampon Ca 2+ et un tampon sans Ca 2+ avec une concentration en Ca 2+ libre dans une plage de 0 à 3900 nM. L'intensité de fluorescence des variants de K-GECO dans chaque solution a été mesurée et ensuite tracée en fonction de la concentration de Ca 2+. Les données ont été ajustées à l'équation de Hill pour obtenir K et le coefficient de Hill apparent.

Les spectres d'excitation à deux photons et les sections efficaces ont été mesurés comme indiqué précédemment [49], avec les ajustements suivants. Pour les spectres excités à deux photons (2PE), la fluorescence a été collectée à travers un filtre 694/SP pour K-GECO1 (Semrock). Pour corriger les variations de longueur d'onde à longueur d'onde dans les paramètres laser, une fonction de correction utilisant la rhodamine B dans le MeOH et son spectre 2PE connu a été appliquée [50]. Des sections efficaces à deux photons ont été mesurées à 1100 nm pour K-GECO1, avec la rhodamine B dans MeOH comme étalon de référence. La fluorescence pour les sections efficaces a été collectée à travers un filtre passe-bande étroit, 589/15 (Semrock), et des efficacités quantiques différentielles ont été obtenues à 582 nm avec un spectrofluorimètre PC1 ISS (cette longueur d'onde correspond au centre de la bande passante du filtre ci-dessus lorsqu'il est utilisé dans le Microscope MOM Sutter Instruments en raison de sa position inclinée). Étant donné que le filtre (694/SP) utilisé pour les mesures des spectres 2PE couvre la fluorescence des formes neutre et anionique du chromophore, le spectre d'un état Ca 2+ particulier d'une protéine représente une combinaison des spectres 2PE uniques du formes neutres et anioniques, pondérées par leurs concentrations relatives (ρ, la concentration d'une forme divisée par la concentration totale de chromophore) et les rendements quantiques. Les oui-axe du spectre 2PE total est défini par F2(λ) =2,N(λ) φN ??N +2,UNE(λ) φUNE ??UNE, où2(λ) est la section efficace à deux photons dépendant de la longueur d'onde et φ est le rendement quantique de fluorescence de la forme correspondante (N pour neutre ou A pour anionique dans l'indice). Aux longueurs d'onde utilisées pour mesurer les sections efficaces (1060 et 1100 nm), σ2,N est supposé être nul, et φUNE etUNE ont été mesurés indépendamment pour donner une valeur pour F2 (Goeppert-Mayer, directeur général). Les concentrations relatives des formes neutres et anioniques ont été trouvées en mesurant les coefficients d'extinction absolus de chaque forme respective dans les états Ca 2+ -free et Ca 2+ -bound. Ceux-ci diffèrent des coefficients d'extinction effectifs rapportés dans le fichier supplémentaire 2 : tableau S1, qui sont pondérés par les concentrations relatives des deux formes du chromophore.

Pour la mesure par spectroscopie de corrélation de fluorescence de la luminosité moléculaire à deux photons, des solutions de protéines diluées (50-200 nM) dans un tampon Ca 2+ (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM CaEGTA, pH 7,2) ont été excitées à 1060 nm au laser puissances de 1 à 25 mW pendant 200 s. À chaque puissance laser, la fluorescence a été enregistrée par une photodiode à avalanche et transmise à un autocorrélateur Flex03LQ (Correlator.com). La courbe d'autocorrélation mesurée a été ajustée à un modèle de diffusion simple avec un programme Matlab personnalisé [36] pour déterminer le nombre moyen de molécules excitées 〈Ndans le volume d'excitation. La luminosité moléculaire à deux photons (ε) à chaque puissance laser a été calculée comme le taux moyen de fluorescence 〈F〉 par molécule émettrice 〈N>, défini comme ?? = 〈F〉/〈Nen kilocomptes par seconde par molécule. En fonction de la puissance laser, la luminosité moléculaire augmente initialement comme le carré de la puissance laser, puis se stabilise et diminue en raison du photoblanchiment ou de la saturation du chromophore protéique dans le volume d'excitation. La luminosité maximale ou de pointe atteinte, 〈emax, représente une approximation de la photostabilité d'un fluorophore.

Pour mesurer la photocommutation de K-GECO1, R-GECO1 et RCaMP1h in vitro, la protéine purifiée dans un tampon Ca 2+ (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM CaEGTA, pH 7,2) ou un tampon EGTA (30 mM MOPS, 100 mM de KCl, 10 mM d'EGTA, pH 7,2) ont été transformés en gouttelettes aqueuses avec de l'octanol dans un rapport de 1:9 et montés sur une lamelle présilanisée. Une seule gouttelette a été focalisée au microscope AxioImager (Zeiss) avec un objectif 20 × 0,8 NA et photocommutée par différentes excitations laser de 561, 405 et 488 nm. L'émission de fluorescence a été détectée à l'aide d'une photodiode à avalanche couplée à la fibre SPCM-AQRH14 (Pacer).

Cristallographie des protéines

L'ADN de K-GECO1 a été cloné dans pRSET-A avec une courte étiquette de purification d'hexahistidine N-terminale (MHHHHHHGSVKLIP…, balise soulignée). K-GECO1 a été exprimé en T7 Express E. coli (New England Biolabs) pendant 36 h en milieu d'auto-induction [51] supplémenté avec 100 mg/L d'ampicilline. E. coli les culots ont été lysés dans du B-PER (Thermo Fisher Scientific) additionné de 1 mg/mL de lysozyme suivi d'une sonication. Les débris cellulaires insolubles ont été éliminés du lysat par centrifugation pendant 20 min à 25 000 g, et la protéine K-GECO1 soluble a été purifiée par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé avec une résine Profinity chargée de nickel (Bio-Rad), lavée avec de l'imidazole 10 mM et éluée avec de l'imidazole 100 mM dans une solution saline tamponnée au Tris. K-GECO1 a été davantage purifié par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant une colonne Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences) avec 10 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0, comme phase mobile. K-GECO purifié a été concentré à 10 mg/mL pour cristallisation en utilisant des concentrateurs centrifuges (Sartorius Vivaspin, seuil de poids moléculaire de 10 000 (MWCO)). La protéine K-GECO1 purifiée à 10 mg/mL dans 10 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0, a été mélangée avec un volume égal d'une solution de précipitation contenant 100 mM de BIS-TRIS, 20 % p/v d'éther monométhylique de polyéthylène glycol 5000, pH 6,5, à température ambiante dans un plateau de cristallisation par diffusion de vapeur en gouttes assises (Hampton Research). Les cristaux ont été cryoprotégés dans la solution de précipitation additionnée de 25 % d'éthylène glycol. Les données de diffraction des rayons X ont été recueillies à 100 K sur la ligne de lumière 8.2.1 de la source lumineuse avancée. Les données de diffraction ont été traitées à l'aide du progiciel HKL [52]. La structure a été résolue par remplacement moléculaire à l'aide de Phaser [53], en recherchant d'abord deux copies du fragment de domaine de protéine fluorescente en utilisant une seule molécule de mKate (PDB ID 3BXB) comme modèle de recherche, suivie de deux copies chacune des N- séparés. et les lobes C-terminaux du domaine de calmoduline lié à Ca 2+ en utilisant des fragments de PDB ID 3SG3. La construction itérative du modèle dans Coot [54] et le raffinement dans Refmac [55] ont produit le modèle K-GECO1, avec deux copies de K-GECO1 dans l'unité asymétrique. Le modèle K-GECO1 a été déposé à l'APB avec le code d'accession 5UKG.

Culture cellulaire et imagerie

Pour caractériser les variants K-GECO dans les cellules HeLa, les cellules ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS, Thermo Fisher Scientific), pénicilline-streptomycine (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific) à 37 °C avec 5% de CO2. Pour construire le plasmide d'expression de mammifère, pcDNA3.1(+) et la variante K-GECO ont tous deux été digérés avec Xhomoi et De derrièreIII, et le squelette et l'insert plasmidiques digérés ont été purifiés par électrophorèse sur gel, suivie d'une ligature et d'une confirmation de séquençage. Des transfections transitoires de plasmides pcDNA3.1(+)-K-GECO ont été réalisées à l'aide de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Des cellules HeLa (confluence de 60 à 70 %) sur des boîtes à fond de verre de 35 mm (In vitro Scientific) ont été transfectées avec 1 g d'ADN plasmidique, en utilisant la Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été imagées 24 h après la transfection. Immédiatement avant l'imagerie, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), puis 1 ml de HBSS tamponné HEPES 20 mM (HHBSS) a été ajouté. L'imagerie cellulaire a été réalisée avec un Eclipse Ti inversé (Nikon). Le progiciel AquaCosmos (Hamamatsu) a été utilisé pour le contrôle automatisé du microscope et de la caméra. Les cellules ont été imagées avec un objectif 20×. Pour imager la dynamique du Ca 2+ induite par l'histamine, les cellules ont été imagées avec une exposition de 200 ms acquise toutes les 5 s pendant une durée de 30 min. Environ 60 s après le début de l'expérience, de l'histamine (10 L) a été ajoutée à une concentration finale de 5 mM. L'oscillation a été imagée pendant 20 min, de l'EGTA/ionomycine (40 L) dans du HHBSS a été ajouté à une concentration finale de 2 mM d'EGTA et 5 M d'ionomycine. Après 5 min, du Ca 2+/ionomycine (40 L) dans du HHBSS sans Ca 2+ et Mg 2+ a été ajouté à une concentration finale de 5 mM Ca 2+ et 5 M d'ionomycine.

Pour caractériser les variants K-GECO dans les neurones dissociés en culture, la procédure a été effectuée comme précédemment rapporté [29]. Des cellules hippocampiques E18 Sprague-Dawley dissociées ont été achetées auprès de BrainBits LLC. Les cellules ont été cultivées sur une boîte à fond de verre de 35 mm (In Vitro Scientific) contenant du milieu NbActiv4 (BrainBits LLC) additionné de 2% de FBS, de sel de potassium de pénicilline-G (50 unités/ml) et de sulfate de streptomycine (50 mg/ ml). La moitié des milieux de culture a été remplacée tous les 4 ou 5 jours. Les cellules ont été transfectées au jour 8 à l'aide de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) en suivant les instructions du fabricant avec les modifications suivantes. Brièvement, 1 à 2 µg d'ADN plasmidique et 4 µl de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) ont été ajoutés à 100 µl de milieu NbActive4 pour fabriquer le milieu de transfection et incubés à température ambiante pendant 10 à 15 min. La moitié du milieu de culture (1 ml) de chaque boîte de neurones a été retirée et combinée avec un volume égal de milieu NbActiv4 frais (complété avec 2% de FBS, du sel de potassium de pénicilline G et du sulfate de streptomycine) pour faire un mélange 1: 1 et incubé à 37°C et 5% CO2. Ensuite, 1 ml de frais conditionné (à 37°C et 5% CO2) Le milieu NbActiv4 a été ajouté à chaque boîte de neurones. Après l'ajout de milieu de transfection, les boîtes de neurones ont été incubées pendant 2-3 h à 37 ° C dans un CO2 incubateur. Le milieu a ensuite été remplacé à l'aide du milieu de mélange conditionné 1:1 préparé précédemment. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 48 à 72 h à 37 °C dans un CO2 incubateur avant imagerie. L'imagerie par fluorescence a été réalisée en HHBSS sur un microscope inversé Nikon Eclipse Ti-E équipé d'une lampe aux halogénures métalliques de 200 W (PRIOR Lumen), d'objectifs à huile 60× (ouverture numérique, NA = 1,4 Nikon), d'un capteur électronique QuantEM 512SC 16 bits. caméra CCD multiplicatrice (photométrie), et un jeu de filtres TRITC/Cy3 (excitation 545/30 nm, émission 620/60 nm, et un miroir dichroïque 570LP, Chroma). Pour l'imagerie time-lapse, les neurones ont été imagés à une fréquence d'imagerie de 100 Hz avec un binning 4 × 4. Pour la comparaison de photoactivation, les cellules exprimant K-GECO1 et R-GECO1 ont été stimulées avec des impulsions de lumière laser bleue (405 nm, 5 mW/mm 2 ).

Pour comparer le K-GECO1 et les GECI rouges dans des cellules neuronales cultivées stimulées, la procédure a été effectuée comme indiqué précédemment [24]. En bref, les GECI rouges ont été exprimés après électroporation dans les neurones hippocampiques primaires de rat (P0) en utilisant le système Nucleofector (Lonza). Pour la stimulation, des potentiels d'action ont été évoqués par stimulation de champ. L'ensemble de filtres TxRed (excitation de 540 à 580 nm, émission de 593 à 668 nm et miroir dichroïque à passe long de 585 nm) a été utilisé pour l'éclairage. Les réponses ont été quantifiées pour chaque cellule comme le changement de fluorescence divisé par la fluorescence de base avant stimulation. Le rapport signal/bruit a été quantifié comme le pic du signal de fluorescence sur la ligne de base, divisé par l'écart type du signal de fluorescence avant la stimulation.

Les iPSC-CM ont été achetés auprès d'Axol Bioscience. Les cellules ont été étalées dans deux puits d'une plaque à six puits et cultivées pendant 4 jours dans un milieu de maintenance des cardiomyocytes (Axol Bioscience) jusqu'à une confluence de 60 à 80 %. Les cellules ont ensuite été transférées sur des lamelles recouvertes de fibronectine (1%) et imagées dans le tampon de Tyrode. Les cellules ont été transfectées en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Un microscope inversé (Zeiss) équipé d'un objectif NA 1.4, 63x (Zeiss) et d'une source de lumière LED à longueurs d'onde multiples pE-4000 (CoolLED) a été utilisé. Une excitation bleue (470 nm) et verte (550 nm) a été utilisée pour illuminer respectivement ChR2-EYFP et rouge GECI. Le jeu de filtres de protéines fluorescentes vertes (excitation 480/10 nm, miroir dichroïque passe long 495 nm, émission 525/50 nm) et le jeu de filtres RFP (excitation 545/30, miroir dichroïque passe long 565 nm, émission 620/60 nm) ont été utilisés pour visualiser respectivement ChR2-EYFP et K-GECO ou R-GECO. La stimulation optique a été réalisée avec la lumière LED de 470 nm à une densité de puissance de 0,19 W/cm 2 et une durée d'impulsion de 150 ms. Les signaux de fluorescence ont été enregistrés à l'aide d'une caméra sCMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) contrôlée par ImageJ [56].

Imagerie organotypique de tranches de cerveau de rat hypothalamique

Pour préparer des tranches de cerveau organotypiques, des expériences ont été réalisées sur des tranches de cerveau coronal de rat nouveau-né contenant le VMN de l'hypothalamus. En bref, des rats Sprague-Dawley postnatals âgés de 0 à 1 jour ont été anesthésiés avec 2 à 3 % d'isoflurane jusqu'à ce que le réflexe de la patte disparaisse. Après la décérébration, le cerveau a été isolé dans du HBSS glacé sans cation divalent (Thermo Fisher Scientific) avec 1 mM de CaCl2 et 1,3 mM de MgSO4. Le cerveau a été collé côté caudal sur une plaque métallique et des coupes en série de 400 µm d'épaisseur ont été réalisées à l'aide d'un vibratome (Leica Microsystems). La section a été arrêtée lorsque le troisième ventricule est devenu visible et deux tranches contenant du VMN de 250 µm d'épaisseur ont été coupées.Des tranches individuelles ont été placées sur un insert de culture cellulaire stérile à membrane poreuse de 0,4 µm (Millipore). L'insert et la tranche ont ensuite été transférés dans une boîte de culture de 35 mm de diamètre (Corning) contenant 1,5 ml de milieu NbActiv4 (BrainBits) additionné de 5 % de FBS, de sel de potassium de pénicilline-G (50 unités/ml) et de sulfate de streptomycine ( 50 µg/ml). Les tranches ont été cultivées à 37°C dans un incubateur (Thermo Fisher Scientific) sous gazage avec 5% de CO2.

Pour la transfection de tranches organotypiques, après 8 à 10 jours de culture de tranches organotypiques, les zones VMN ont été transfectées avec une technique d'électroporation comme décrit précédemment [47]. Plus précisément, l'insert avec la tranche a été placé sur une électrode de boîte de Pétri en plaque de platine (Bex Co Ltd) et un tampon d'électroporation (HBSS avec 1,5 mM de MgCl2 et 10 mM de D-glucose) a été rempli entre l'électrode et la membrane. Les plasmides de pcDNA3.1-K-GECO1 ont été dissous dans le tampon d'électroporation à une concentration de 1 µg/ml et 10 µl de cette solution ont été ajoutés pour recouvrir juste la tranche. Ensuite, une électrode carrée en platine (Bex Co Ltd) a été placée directement au-dessus de la tranche. Cinq impulsions de 25 V (durée 5 ms et intervalle 1 s) ont été appliquées deux fois (la deuxième fois avec polarité inversée) à l'aide d'un stimulateur d'impulsions (Sequim) et d'un amplificateur (Agilent). Le tampon d'électroporation a été remplacé par du milieu NbActiv4 supplémenté et les tranches ont été remises dans l'incubateur.

Pour imager la dynamique du Ca 2+ cytosolique à l'aide de K-GECO1, un microscope confocal vertical FV1000 équipé du logiciel FluoView et un objectif à immersion dans l'eau 20 × XLUMPlanF1 (NA 1.0) a été utilisé (Olympus). L'insert Millipore contenant une tranche de cerveau transfecté a été placé dans une chambre sur mesure et fixé mécaniquement avec une harpe en platine. Les tranches ont ensuite été perfusées à 31 °C avec du liquide céphalo-rachidien artificiel contenant (en mM) 120 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl2, 1,3 MgSO4, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2Bon de commande4, et 10 D-glucose (le pH a été ajusté à 7,4 par gazage avec 95 % d'O2 plus 5% de CO2), à un débit de 5 ml/min à l'aide d'une pompe péristaltique (Watson-Marlow). Pour Ca confocal monocoloreje l'imagerie, les neurones VMN transfectés par K-GECO ont été exposés à une excitation avec une lumière laser de 543 nm et les émissions ont été collectées de 560 à 660 nm à l'aide d'un filtre à barrière variable. Les images ont été acquises avec un zoom numérique × 1-3 à une résolution d'image de 512 × 512 et avec une vitesse de balayage de 2 s/pixel résultant en une acquisition d'image à 1,12 images/s. Pour surveiller les augmentations de Ca 2+ cytosoliques évoquées par le médicament environ 60 s après le début de l'acquisition d'images, 100 M d'ATP (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés au liquide céphalo-rachidien artificiel pendant 90 s. Pour comparer le signal K-GECO1 avec celui d'un colorant fluorescent chimique Ca 2+, les tranches transfectées ont été colorées avec la variante à membrane perméable (AM) du vert Fluo-4 par application focale. En bref, 0,5 mM de Fluo-4-AM a été versé dans une pipette de patch cassée avec un diamètre extérieur de

10 m et ensuite injecté sous pression (25-50 mmHg) pendant 10 min [57, 58] à 30-50 m de profondeur dans la tranche à proximité des neurones VMN transfectés par K-GECO1. Cela a conduit à une coloration uniforme des cellules dans un rayon de 150 à 200 um du site d'injection. Pour l'imagerie bicolore des réponses Ca 2+ basées sur K-GECO1 et Fluo-4, des neurones doublement marqués ont été excités avec un laser à 488 nm et les émissions ont été simultanément collectées dans deux canaux de 500 à 520 nm pour Fluo-4 et 570 à 670 nm pour le K-GECO1 en utilisant des filtres à barrière variable.

Imagerie des neurones sensoriels spinaux du poisson zèbre

Le poisson zèbre Mitfa w2/w2 roy a9/a9 (Casper) a été maintenu dans des conditions standard à 28 °C et un cycle lumière:obscurité de 14:10 heures. Des embryons (stade cellulaire 1-2) de Tg (elavl3:GAL4-VP16) [59] ont été injectés avec 25 ng/μl de plasmides d'ADN codant pour les variants K-GECO sous le contrôle du promoteur 10xUAS, et 25 ng/μL de transposase Tol2 ARNm dilué dans du milieu E3. Des embryons post-fécondation de trois jours montrant une expression dans les neurones sensoriels spinaux (cellules RB) ont été paralysés par une application de bain de 5 minutes de 1 mg/ml d'a-bungarotoxine (Sigma, 203980). Les larves ont été montées sur le côté dans une chambre de stimulation de champ (Warner, RC-27NE2) avec 1,5% d'agarose à bas point de fusion et imagées à l'aide d'un microscope à deux photons sur mesure équipé d'un scanner résonant. La source lumineuse était un laser femtoseconde Insight DS Dual (Spectra-Physics) fonctionnant à 1140 nm. L'objectif était une lentille à immersion dans l'eau 25 × 0,95 NA (Leica). Les images fonctionnelles (512 × 256 pixels) ont été acquises à l'aide de ScanImage 5 (vidriotechnologies.com) à 7,5 Hz. La puissance laser approximative de l'échantillon a été mesurée à l'aide d'un wattmètre à lame (Thorlabs) et 3 et 20 mW ont été utilisés pour l'imagerie fonctionnelle. Des trains de 1, 2, 5, 10 et 20 stimuli de champ (largeur d'impulsion 1 ms à 50 Hz) ont été appliqués avec un stimulateur (NPI ISO-STIM). La tension de stimulation a été calibrée pour provoquer une réponse identifiable à une seule impulsion dans les cellules RB sans stimuler les cellules musculaires. Les régions d'intérêt (ROI) ont été sélectionnées manuellement et les données ont été analysées à l'aide de MATLAB (MathWorks).

Imagerie souris V1

Pour l'imagerie in vivo de souris V1, la procédure a été effectuée comme précédemment rapporté [24]. En bref, l'injection d'AAV a été utilisée pour l'expression de K-GECO1 dans les neurones V1 de souris. Après injection du virus, une fenêtre crânienne a été implantée. L'animal a ensuite été placé sous un microscope à 37°C et anesthésié pendant l'imagerie. Un microscope à deux photons sur mesure a été utilisé pour l'imagerie avec un laser à impulsions de 1100 nm comme source lumineuse et une lentille à immersion dans l'eau 16 × 0,8 NA comme objectif. La puissance laser était de 100 à 150 mW à l'ouverture avant de l'objectif. L'essai de stimulation du réseau mobile consistait en une période blanche suivie d'un réseau sinusoïdal dérivant avec huit directions dérivantes avec une séparation de 45°. Les réseaux étaient présentés avec un écran LCD placé devant le centre de l'œil droit de la souris. Pour l'analyse des tissus fixés, les souris ont été anesthésiées et perfusées par voie transcardiaque. Les cerveaux ont ensuite été prélevés et post-fixés. Des coupes de cerveaux ont été recouvertes d'une lamelle et imagées par microscopie confocale (LSM 710, Zeiss).

Analyses statistiques

Toutes les données sont exprimées en moyennes ± écart type. Tailles des échantillons (m) sont répertoriés pour chaque expérience. Pour l'imagerie fonctionnelle V1, le test ANOVA (p = 0,01) a été utilisé pour identifier les cellules sensibles pour chacun des stimuli de réseau.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Recrutement des patients et protocole

L'approbation de l'Institutional Review Board (IRB) a été obtenue au Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) sous le numéro de protocole 2016P000352. Des patientes de plus de 18 ans subissant une mastectomie avec conservation de la peau et une reconstruction par lambeau perforant de l'artère épigastrique inférieure profonde (DIEP) ont été recrutées. Un certain nombre de comorbidités courantes affectent négativement la reperfusion vasculaire et peuvent entraîner une défaillance totale ou partielle du lambeau, comme le tabagisme, le diabète, l'obésité, une maladie artérielle périphérique, des antécédents de thromboembolie veineuse, une anémie ou une hypotension, une maladie coronarienne/un infarctus du myocarde/un accident vasculaire cérébral, et hypertension. Un transfert de tissu sans lambeau DIEP est risqué pour les patients présentant de telles comorbidités vasculaires, et par conséquent, seuls les patients sans aucun de ces facteurs de risque ont été recrutés pour cette étude. Un consentement écrit pour la participation a été obtenu de tous les sujets, et les patients ont eu la possibilité de faire don de leurs tissus abdominaux jetés (fig. S5) à des fins d'étalonnage, bien qu'un seul patient de cette étude l'ait fait. Cinq femmes ont été recrutées sur une période allant de mars à septembre 2017. Un calcul a priori de la puissance de la taille de l'échantillon (α = 0,05, β = 0,95) utilisant les données animales in vivo d'une étude publiée dans Plastic and Reconstructive Surgery (PRS) (43) en comparant le bandage à une électrode Clark et au moniteur ViOptix côte à côte, on a déterminé un besoin minimum de quatre bandages, où 15 mesures individuelles sont effectuées par patient pendant 48 heures. Les valeurs d'écart-type pour ce calcul de l'étude porcine préliminaire ont indiqué qu'il existe un écart-type intrinsèque de 10 % ou moins sur 15 sites identiques. Un cinquième patient a été ajouté pour le recrutement pour tenir compte de la possibilité d'équipement ou de complications chirurgicales qui pourraient empêcher l'achèvement du protocole complet. Un total de sept bandages a été utilisé dans l'analyse finale, car deux des cinq cas des patients étaient bilatéraux, dépassant la taille de l'échantillon dans le calcul de puissance initial pour un total de m = 101 jeux d'images (tableau S1). Noter que m est le nombre d'images de phosphorescence, et non le nombre de sujets, soit un total de m = 101 images était la taille de l'échantillon pour cette étude car le but était de comparer les lectures des deux oxymètres, et non de détecter une défaillance du volet.

Un schéma de la chirurgie de reconstruction par lambeau DIEP et de l'évaluation postopératoire pour cette étude est présenté sur la Fig. 2. Un volume de tissu (peau et graisse) est disséqué du bas-ventre, dans la même zone qu'une abdominoplastie ou « abdominoplastie » le ferait. généralement être effectuée. Il se compose de la peau et de la graisse sous-cutanée, mais pas de la musculature sous-jacente du droit de l'abdomen. Habituellement, deux ou trois artères perforantes, branches de l'artère épigastrique inférieure profonde, qui perfusent le lambeau, sont identifiées, disséquées et incluses dans la dissection, de même que les veines perforantes. Simultanément, le sein est excisé jusqu'aux muscles pectoraux et l'artère/veine mammaire interne est disséquée. Le lambeau est ensuite déplacé de l'abdomen vers le sein, et les perforantes sont anastomosées aux vaisseaux mammaires internes. Les sites donneur et receveur sont réparés avec des sutures, et la perfusion du lambeau a été évaluée en périopératoire avec un dispositif NIRS ViOptix placé directement sur la palette cutanée du lambeau, où une baisse approximative de l'oxygénation de 30 % ou plus déclenche une alarme. Chaque patient a subi des soins postopératoires de routine au BIDMC pour une surveillance postopératoire, sans aucune modification du flux de travail clinique autre que la peinture, une zone de peau d'environ 1 cm sur 1 cm sur le ou les lambeaux du patient avec le pansement liquide détecteur d'oxygène à l'arrivée à la zone de récupération postopératoire, avant de panser le lambeau avec Tegaderm comme d'habitude. Après avoir laissé le pansement liquide sécher en un film mince pendant 1 à 2 min, un pansement transparent (Tegaderm, 3M) a été appliqué comme film barrière pour empêcher les interférences de l'air ambiant. Tegaderm est couramment utilisé en récupération postopératoire pour aider à faire adhérer les lambeaux et les greffons au corps pendant la prise. Comme de nombreux pansements transparents, Tegaderm est résistant à l'eau et semi-perméable à l'oxygène, ce qui signifie qu'il agit comme une barrière pour empêcher l'air ambiant d'interférer avec la mesure de la pO tissulaire2. Comparé à d'autres films médicaux transparents, Zimmermann et al. (54) ont découvert que Tegaderm (un film à base de polyéthylène avec support adhésif) a une perméabilité à l'oxygène relativement faible. La cinétique du flux d'oxygène lors de l'équilibrage des tissus et des pansements sous barrière Tegaderm a été précédemment décrite par notre groupe (51).

Des lambeaux DIEP prélevés sur l'abdomen ont été utilisés pour reconstruire le sein, et une surveillance postopératoire a été réalisée pendant 48 heures avec deux oxymètres placés sur chaque lambeau comme indiqué : le ViOptix (NIRS, %stO2) et le pansement à peindre (phosphorescence, pO2). Crédit photo : Juan Pedro Cascales, MGH.

Synthèse des métalloporphyrines de détection d'oxygène Clickaphor et préparation de bandage liquide

Les réactifs et les solvants ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et Thermo Fisher Scientific, à l'exception du sel CHA d'ester mono-tert-butylique d'acide l-azidoglutamique [N3-Glu(OtBu)-OH.CHA], qui a été obtenu auprès de ChemPep Inc. Tous les composés ont été utilisés sans autre purification. La synthèse du noyau palladium-porphyrine a été réalisée comme précédemment décrit par Roussakis et al. (42). Des écarts par rapport au protocole publié pour l'étape d'alkylation de type Williamson, tels qu'une dilution substantielle du mélange réactionnel et une forte augmentation de l'excès de réactifs, ont conduit à une forte augmentation du rendement pour la synthèse du dérivé à terminaison alcyne. La déprotection de la métalloporphyrine protégée par pivaloyle avec l'utilisation d'hydrure de diisobutylaluminium a été réalisée comme précédemment publié. Brièvement, le produit de la déprotection du groupe pivaloyle a été dissous dans des N,N-diméthylformamide (DMF) à une concentration de 0,001 M sous atmosphère d'argon, et la solution a été refroidie à 0°C avec un bain eau/glace. Un large excès d'hydrure de sodium (dispersion à 60 % dans de l'huile minérale), suffisant pour couvrir la pointe d'une petite spatule métallique, a été prélevé dans la solution et le mélange réactionnel a été agité pendant environ 15 minutes. Un large excès de bromure de propargyle (80 % dans le toluène), s'élevant à 5 % du volume de solvant DMF, a été ajouté lentement (goutte à goutte à l'aide d'une seringue), et la réaction a été laissée se réchauffer à température ambiante et a été laissée à réagir. pendant la nuit.

La progression de la réaction a été vérifiée périodiquement par spectrométrie de masse (MS) à désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF). Si la réaction n'était pas terminée, de l'hydrure de sodium et du bromure de propargyle supplémentaires ont été ajoutés, et le mélange a été laissé à réagir pendant un jour supplémentaire. L'élimination du solvant et la purification chromatographique ont été effectuées comme décrit précédemment. Ceci, ainsi que les purifications chromatographiques dans les étapes de synthèse précédentes, ont assuré l'élimination de tous les réactifs et impuretés, donnant un dérivé palladium-porphyrine à terminaison alcyne pur, comme le confirme la résonance magnétique nucléaire du proton ( 1 H-RMN) et la résonance magnétique nucléaire. MALDI-TOF MS. La synthèse du dendrimère éthylglutamate métalloporphyrine sensible à l'oxygène a été réalisée comme précédemment publié, via une réaction de type clic catalysée par le cuivre de la palladium-porphyrine à terminaison alcyne avec une sous-unité de dendron azido-éthylglutamate de deuxième génération (42). La purification de la porphyrine-dendrimère a été modifiée par rapport au protocole publié. Après élimination des solvants (DMF et eau) par évaporation rotative, le résidu a été dissous dans un petit volume d'éthanol et le dendrimère porphyrine a été précipité par addition d'eau ultrapure suivie d'une centrifugation. Le surnageant a été éliminé et les cycles de dissolution d'éthanol et de précipitation/centrifugation ont été répétés deux fois de plus, suivis d'un séchage sous vide poussé pour donner le produit sous forme de solide rouge. L'analyse MALDI-TOF MS et LC-MS du produit final a montré qu'il ne restait aucun monomère de dendron n'ayant pas réagi de la réaction de clic alcyne-azide. La masse de la métalloporphyrine (structure représentée sur la figure 3B) a été déterminée par MALDI-TOF MS comme étant d'environ 5412,11 Da.

En haut : Composants de la formulation de pansement liquide : (UNE) Matrice éthanol-nitrocellulose de marque New-Skin, (B) de la métalloporphyrine à détection d'oxygène synthétisée en interne, et (C) colorant de référence fluorescéine. En bas : Protocole d'application du pansement liquide. Les bandages sont peints sur la zone intérieure des rabats, laissés à sécher pendant 1 min et scellés avec du Tegaderm pour éviter les interférences de l'air ambiant. Après 48 heures de mesures postopératoires, le pansement est retiré en même temps que le Tegaderm lors du redressement. Crédit photo : Emmanuel Roussakis, MGH. Schéma adapté avec la permission de la référence (50).

Le matériau du pansement peint a été formulé à partir de trois composants : le pansement liquide New-Skin disponible dans le commerce (une solution de nitrocellulose à base d'éthanol), un dendrimère de palladium-porphyrine Clickaphor à détection d'oxygène et le colorant de référence insensible à l'oxygène, la fluorescéine (Fig. 3). Le capteur d'oxygène et le colorant de référence sont d'abord codissous dans de l'éthanol (épreuve 200) à des concentrations de 180 et 10 M, respectivement. Cette solution mère est diluée avec le pansement liquide New-Skin du commerce dans un rapport de 1:1 pour obtenir des concentrations finales de porphyrine et de fluorescéine de ∼90 et ∼5 M, respectivement. Les concentrations ont été choisies de manière à ce que l'émission des deux colorants soit visible sous l'éclairage de la pièce lorsqu'elles sont excitées par la même source. Le rapport de pourcentage en masse par volume du capteur de porphyrine dans la formulation finale n'est pas supérieur à 0,4 % (p/v).

Un problème avec tout pansement ou dispositif qui entre en contact avec la peau humaine, en particulier pendant une période prolongée, est qu'il peut laisser des résidus sur la peau après le retrait. Nous souhaitions déterminer si, lors du retrait de la formulation de pansement séchée avec le film Tegaderm, une métalloporphyrine sensible à l'oxygène restait sur le tissu. Pour tester la métalloporphyrine résiduelle déposée, une portion de 1 cm sur 1 cm de tissu abdominal humain excisé a été peinte avec la solution de pansement liquide contenant un capteur de porphyrine du commerce, laissée à sécher pendant 1 min, scellée avec du Tegaderm et laissée pendant 24 heures avant le retrait . Cette procédure imite le retrait du Tegaderm et du bandage de détection d'oxygène des sujets humains. Après la digestion des tissus, le plasma à couplage inductif (ICP)-MS a été réalisé à la Harvard School of Public Health. Cette expérience a ensuite été répétée en utilisant le dendrimère Pd-porphyrine synthétisé pour cette étude et maintenu dans des conditions beaucoup plus sévères à 100% d'humidité à 37°C pendant 3 jours. Après cette période d'incubation, le Tegaderm/bandage a été retiré et la zone a été essuyée avec un tampon imbibé d'alcool. L'analyse des métaux externes des échantillons digérés à la recherche de traces de palladium a été réalisée chez Brooks Applied Labs (certifié ISO/IEC 17025) à l'aide d'un ICP-MS, un ordre de grandeur plus sensible que le système de la Harvard School of Public Health.

Étalonnage de la formulation de bandage à peindre

La formulation de bandage liquide a d'abord été validée spectroscopiquement en mesurant l'émission de porphyrine et de fluorescéine tout au long de la désoxygénation avec de l'azote, comme le montre la figure 4A. La réponse du rouge au vert de la formulation liquide lorsqu'elle est placée dans une cuvette et excitée avec une lampe de poche ultraviolette (UV) est également illustrée par les images de téléphone portable non filtrées de la figure 4B. Notez que l'émission verte du colorant de référence fluorescéine, avec un large pic près de 532 nm, ne change pas en réponse à l'oxygène. Cette insensibilité à l'oxygène permet à la fluorescéine d'agir comme une référence interne par rapport à laquelle la phosphorescence sensible à l'oxygène de la porphyrine peut être mesurée. Sans le dendrimère glutamate, un ou les deux colorants sont sujets à l'agrégation au sein de la matrice de nirtocellulose New-Skin lors du séchage en tant que peinture très fine sur film. Ainsi, c'est la combinaison des propriétés photophysiques inhérentes du noyau d'alcyne de porphyrine rouge Clickaphor, ainsi que son potentiel à être facilement converti en dérivés qui conduit à ses performances optimales de détection d'oxygène dans les matrices et les formulations polymères. Une comparaison de Clickaphor Red à son précurseur de noyau de métalloporphyrine à terminaison alcyne aux porphyrines commerciales largement utilisées telles que Pd(II)méso-tétrakis(pentafluorophényl)porphyrine (PdTPFPP) (fig. S4C) a été réalisée pour démontrer la nécessité de la porphyrine éthylglutamate -dendrimère pour empêcher l'agrégation et l'auto-extinction des colorants dans la formulation de nitrocellulose New-Skin à peindre. Alors que les porphyrines commerciales et les noyaux alcynes peuvent être utilisés pour les films minces préformés, la formulation Clickaphor Red est spécifiquement formulée pour la peinture directement sur la peau humaine.

(UNE) Spectres de la formulation liquide du pansement dans l'éthanol démontrant que seule l'émission de porphyrine est dépendante de l'oxygène (pic à 660 nm) et (B) images prises avec une caméra de téléphone portable de la formulation d'éthanol dans différentes conditions d'oxygénation lorsqu'elle est excitée par une lampe de poche à diode électroluminescente de 405 nm, démontrant que le changement de couleur du rouge au vert est visible à l'œil nu sous l'éclairage de la pièce. (C) Intensité moyenne de phosphorescence normalisée à partir des images de la caméra montrées dans (E), démontrant une sensibilité à l'oxygène de 0 à 160 mmHg (cercle gris), et que la relation Stern-Volmer modifiée (je0/je) correspond aux données d'étalonnage (carré rouge). () Étalonnage Stern-Volmer avec une moyenne mobile appliquée dans les deux X et oui pour tenir compte de l'hystérésis du débit de gaz pendant les cycles répétés et (F) démonstration d'étalonnages ex vivo effectués sur du tissu mammaire humain avec différents niveaux de mélanine, qui n'ont eu aucun effet apparent sur les performances du capteur. Crédit photo : Haley Marks, MGH.

Ensuite, la réponse à l'oxygène en présence d'un fond autofluorescent a été explorée en peignant la formulation liquide sur du tissu mammaire et abdominal ex vivo. Les tissus cutanés humains rejetés ont été collectés selon le protocole IRB 2015P001267 des tissus rejetés du Massachusetts General Hospital (MGH). Le pansement séché a ensuite été retiré de la peau à l'aide de Tegaderm et placé face vers le haut sur la peau pour l'exposer directement à l'environnement de la chambre. La chambre d'échantillonnage consistait en une éponge imbibée de solution saline tamponnée au phosphate à l'intérieur d'une boîte de Pétri, qui est scellée avec un couvercle en poly(diméthylsiloxane) (PDMS). Les alimentations en azote et en air ont été acheminées à travers un doseur de gaz, dont la sortie humidifiée est insérée dans le couvercle de la chambre avec une aiguille. Le pO2 dans la chambre a été mesurée en utilisant une électrode de type Clark comme étalon de référence, comme le montre la photo de la fig. S5. La boîte a été chauffée à environ 32 °C et une humidité de 100 % a été maintenue tout au long de l'imagerie pour se rapprocher des conditions de température et d'hydratation de la peau. Pour tous les étalonnages, la chambre a d'abord été purgée à l'azote et laissée s'équilibrer pendant ∼30 min avant d'introduire lentement des niveaux connus d'oxygène toutes les 5 min ou jusqu'à ce que l'électrode de Clark donne une lecture stable, avec des images acquises à chaque étape et traitées conformément à la section d'imagerie suivante.

Plusieurs étalonnages ont été effectués tout au long de l'étude de 6 mois pour tenir compte du vieillissement potentiel de la formulation, pour déterminer le rôle de la mélanine dans les étalonnages et pour comparer les effets de la congélation des tissus. Comme quatre des patientes de cette étude n'ont pas fait don de leurs tissus mis au rebut, des tissus mammaires ex vivo prélevés sur différents donneurs ont été utilisés pour effectuer des étalonnages tout au long de la durée de l'étude. Ces tissus ont été collectés et utilisés pour les étalonnages tout au long de l'étude et ont également été congelés afin qu'ils puissent être décongelés pour la correspondance de la pigmentation de la peau. Pour déterminer l'effet de la pigmentation de la peau des étalonnages ex vivo, des échantillons congelés avec diverses pigmentations ont été décongelés et appariés à la ligne de base d'autofluorescence de fond intrinsèque R R + G de chaque sujet. L'intensité de phosphorescence moyenne normalisée R R + G de chaque image d'étalonnage de bandage (montrée avec une carte en fausses couleurs sur la figure 4E, en bas) a été convertie en pO2 valeurs utilisant la relation Stern-Volmer modifiée suivante I 0 I = R 0 R 0 + G 0 R R + G = 1 + G 0 R 0 + G 0 K sv [ p O 2 ] (1)

Un échantillon de tissu abdominal frais mis au rebut utilisé pour l'étalonnage a été prélevé sur un sujet inscrit, illustré dans l'exemple de tableau de consultation de la figure 4. Étant donné que les niveaux d'azote et d'air ont été ajustés manuellement avec un doseur de gaz, un certain degré mineur d'hystérésis s'est produit tout au long de la désoxygénation et de la réoxygénation. . Pour compenser cela, une moyenne mobile a été appliquée aux deux X et oui, et un ajustement linéaire de York pour cet étalonnage corrigé est illustré à la figure 4D. En fin de compte, il a été constaté que les contributions de fond de différents niveaux de mélanine avaient peu d'effet sur les étalonnages (Fig. 4F) mais que l'utilisation de tissus frais par rapport à des tissus congelés provoquait un changement dans la structure du tissu, ce qui affectait sa capacité à retenir l'humidité et sa respirabilité, comme ainsi que l'autofluorescence de base, comme le montre la fig. S6. De plus, il est connu qu'un pH cutané > 6 pourrait potentiellement provoquer une erreur de mesure (fig. S4A) car la fluorescéine a un pKune (où Kune est la constante de dissociation acide) = 6,4. Le pH de la peau varie généralement de 4 à 6 chez les humains normaux et en bonne santé, et un pH supérieur à 6 indiquerait une infection bactérienne (55).

Photographie et analyse d'images

Les appareils photo reflex numériques Nikon D70s disponibles dans le commerce ont été modifiés pour collecter le spectre d'émission complet du chromophore en supprimant le filtre de rejet infrarouge (IR) et en fixant un curseur de filtre personnalisé imprimé en 3D contenant deux filtres passe-bande dans le vert (525/30 nm, Chroma Technologies) et les régions spectrales rouges (660/40 nm, Chroma Technologies). Pour l'excitation simultanée des colorants à proximité de la bande de Soret de la porphyrine, des filtres passe-bande bleu/UV (385/70 nm, Chroma Technologies) ont été montés devant deux flashes Vivitar montés bilatéralement et réglés à 1/16 de leur puissance maximale. Une excitation flash de niveau 1/16 correspond à une irradiance totale de 2 mW au cours de la période de surveillance de 48 heures. Selon Mitra et Foster (56), c'est bien en deçà de la puissance requise pour induire suffisamment d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour affecter négativement les lectures de consommation d'oxygène des tissus. Les spectres des colorants superposés aux filtres de la caméra sont illustrés à la fig. S1. Les flashes étaient montés sur le corps de l'appareil photo sur un bras triangulaire, ce qui permettait au clinicien de tenir l'appareil photo avec un bras tout en gardant un bras libre pour appuyer sur le bouton de déclenchement, ajuster la mise au point de l'appareil photo ou ajuster les moniteurs ou les pansements des patients. La fig. S1.

Pour les mesures post-chirurgicales, les photographies ont été prises par séries de six à 0 et 20 min après l'application du pansement détecteur d'oxygène puis toutes les heures à 1 à 6 heures, suivies d'une série de photographies supplémentaires avec des acquisitions toutes les 6 heures entre 12 et 48 heures. . Chaque ensemble de six photographies contient une image rouge, verte et sans filtre, avec et sans le flash activé. Les images « flash off » tiennent compte de tout signal de fond provenant de l'éclairage de la pièce. Les images « sans filtre » ont été utilisées comme mesure de contrôle de la qualité pour assurer une orientation correcte de l'appareil photo et l'intensité du flash. La prise de photographies au bout de 20 minutes après l'application a permis au pansement d'atteindre un équilibre de tension d'oxygène avec le tissu (51). Une durée de surveillance de 48 heures a été choisie pour correspondre à la période pendant laquelle la défaillance du volet est la plus susceptible de se produire (6). Pendant la photographie, une feuille noire avec un trou de 25 mm a été utilisée pour exposer uniquement le pansement liquide tout en bloquant tout signal de fluorescence interférant des fournitures médicales environnantes telles que les draps, les blouses, les tubes et la sonde ViOptix elle-même. Bien que la feuille n'était pas nécessaire d'un point de vue technique, elle offrait un moyen simple d'assurer la désidentification des images tout en permettant un traitement d'image entièrement automatisé en standardisant la région d'intérêt (ROI) analysée. Les images ont été converties d'images .nef (RAW) en images RVB .tiff 16 bits à l'aide du logiciel View-Nx de Nikon pour l'analyse. Les images converties ont ensuite été traitées dans MATLAB à l'aide de l'algorithme abrégé suivant : catégoriser comme image filtrée rouge ou verte et comme flash activé ou désactivé, aligner les images d'arrière-plan et de signal correspondantes, soustraire l'arrière-plan de l'image de signal pour chaque couleur afin de corriger l'éclairage parasite, alignez les images rouges et vertes corrigées, effectuez une algèbre matricielle d'images alignées pour obtenir une carte de l'intensité de la phosphorescence normalisée par rapport à la luminescence totale ( RR + G ) et exportez les données brutes et traitées. Des masques logiques inversés ont ensuite été utilisés pour normaliser les données par rapport au tissu autofluorescent environnant. La fonction MATLAB développée "tif2phos.m" peut être trouvée dans les documents supplémentaires et est représentée graphiquement dans la fig. S2.

Statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées en langage R (57) dans l'environnement RStudio. Un fichier .cvs et .Rmd contenant l'ensemble de données brutes complet et l'analyse statistique, respectivement, peuvent être trouvés dans les documents supplémentaires. Le modèle de régression linéaire à effets mixtes (LMER) pour prédire un résultat continu (changements de phosphorescence ou de pO2) basé sur des prédicteurs continus (changements de stO2 et changements dans le temps) et la prise en compte des effets aléatoires a été construite avant l'analyse des données comme suit Δ p O 2 , ij = β 0 + β 1 Δ % st O 2 , j + β 2 t 0 , j + β 3 t * Δ % st O 2 , j + b 0 , j + ij (2)

Les effets fixes sont définis comme suit : Δ % stO2, le changement dans l'apport d'oxygène dans le sang t, le temps (en heures) depuis que le Tegaderm a été appliqué sur le pansement t * Δ % stO2, le terme d'interaction entre le temps et l'apport d'oxygène dans le sang, qui tient compte des changements de saturation en oxygène subis lors de l'absorption du lambeau et , l'erreur résiduelle. L'hypothèse nulle est que1, le coefficient décrivant la relation entre l'apport d'oxygène dans le sang et la consommation d'oxygène dans les tissus est égal à zéro, et l'hypothèse alternative est que β1 est non nul. Comme certains cas étaient bilatéraux, pour tenir compte de la corrélation entre deux bandages portés par le même sujet, nous incluons l'interception aléatoire spécifique au sujet. b0, j avec l'erreur résiduelle , qui sont supposées avoir une distribution normale avec une moyenne égale à 0 et un SD inconnu, où j indexe les sujets et je indexe le pansement au sein d'un sujet. Cette analyse a également été répétée en utilisant le % brut de phosphorescence (où % phos = R R + G ) à la place du pansement pO2 pour confirmer que les données brutes sont inversement corrélées avec stO2 quelle que soit la qualité de l'étalonnage.


DISCUSSION

Ici, nous montrons des preuves définitives de la détection de lumière dispersée dans la peau de poulpe et documentons l'expression d'un capteur de lumière candidat dans la peau de la même espèce, Poulpe bimaculoides. Deux études antérieures ont émis l'hypothèse que la peau des céphalopodes peut être intrinsèquement sensible à la lumière, notant que les chromatophores dans la peau de calmar et de poulpe semblent se dilater lorsque la peau est éclairée, mais aucune étude n'a fourni plus que des observations préliminaires (Florey, 1966 Packard et Brancato, 1993 ). Nous avons découvert que les chromatophores de la peau des O. bimaculoides se dilatent de manière significative et répétée lorsqu'ils sont exposés à une lumière blanche brillante, un comportement que nous appelons l'expansion des chromatophores activés par la lumière, ou LACE. Nous attribuons LACE à la lumière, car nous avons minimisé la chaleur atteignant les échantillons en utilisant des fibres optiques pour illuminer la peau, elle-même immergée sous l'eau. Les réponses de LACE montrent clairement que O. bimaculoides la peau peut détecter la lumière par elle-même, indépendamment des yeux.

Alors que Octopus LACE est un comportement robuste, nous avons constaté que certains des paramètres de LACE diffèrent de ceux notés par Packard et Brancato (1993). Par exemple, ils rapportent que les chromatophores dans les Poulpe vulgaire la peau se dilate 1 s après un éclair de lumière blanche brillante, ce qui diffère de la latence moyenne de 6 s (adultes) ou 15 s (éclosion) pour LACE que nous avons trouvée dans O. bimaculoides. Cette incongruité de latence peut être attribuable à des différences entre les espèces et/ou la préparation elle-même, car il semble que Packard et Brancato n'aient pas isolé d'échantillons de peau, mais des portions de peau dénervées encore attachées à l'animal entier. Nous avons observé un degré élevé de variation à la fois de la latence de LACE et du temps d'expansion complète des chromatophores dans nos préparations et attribuons au moins une partie de cette variation aux différences de temps entre la dissection du tissu et l'exécution des expériences LACE. Nous avons également observé des différences de LACE entre les nouveau-nés et les adultes, où la peau des adultes a répondu de manière plus cohérente et robuste que la peau des animaux plus jeunes. Nous supposons que cela pourrait être causé par la présence de plus de capteurs de lumière dans la peau des adultes par rapport aux nouveau-nés. Cependant, malgré ces différences par rapport aux rapports préliminaires, nos données sont la démonstration la plus claire à ce jour que Poulpe bimaculoides la peau est intrinsèquement sensible à la lumière, et cette lumière détectée par la peau provoque l'expansion des chromatophores.

Nous avons émis l'hypothèse que la r-opsine, une protéine clé de détection de la lumière dans les yeux des poulpes et d'autres animaux, peut également détecter la lumière dans la peau des poulpes et sous-tendre le LACE. Pour étayer cette hypothèse, nous avons recherché des preuves de l'expression de l'opsine dans la peau et déterminé le spectre d'action de LACE. Conformément à notre hypothèse, nous avons trouvé que la r-opsine est exprimée dans la peau de O. bimaculoides. Ce résultat est similaire à celui de Mäthger et al. (2010), qui ont détecté l'ARNm de la r-opsine à partir d'un essai PCR sur la peau d'un autre céphalopode, la seiche Sépia officinalis, bien qu'on ne sache pas encore si les seiches ont de la DENTELLE. De plus, l'expression de l'opsine en elle-même est une preuve faible de la capacité de la peau à détecter la lumière. D'autres gènes essentiels de la cascade de la r-opsine, notamment la protéine G (q) et la phospholipase C, sont également exprimés dans la peau de O. bimaculoides, suggérant que les gènes nécessaires à la phototransduction fonctionnelle à base d'opsine sont exprimés dans la peau de poulpe (Speiser et al., 2014). Enfin, le spectre d'action LACE est également cohérent avec notre hypothèse. Analyse de sensibilité spectrale de l'opsine des yeux d'une autre pieuvre O. vulgaris montre unmax de 474 nm (Brown et Brown, 1958). Si la même opsine trouvée dans les yeux de poulpe sous-tend le LACE de poulpe, alors l'activité de LACE devrait atteindre un pic proche de la sensibilité spectrale connue de l'opsine de poulpe. En effet, nous avons constaté que la latence vers LACE est la plus courte en lumière bleue, et l'ajustement de la courbe de Govordovskii aux données du spectre d'action donne unmax de 480 nm. Prises ensemble, ces données soutiennent fortement notre hypothèse selon laquelle la phototransduction de l'opsine est à la base de LACE. Les travaux futurs devraient continuer à tester cette hypothèse en manipulant la fonction des protéines de phototransduction d'opsine et en observant comment elles affectent LACE.

Parce que la r-opsine est connue pour fonctionner dans la détection de la lumière, les cellules de la peau de poulpe qui expriment l'opsine sont d'excellents candidats pour les capteurs de lumière dispersée qui pourraient sous-tendre LACE. Nous avons identifié des neurones sensoriels périphériques ciliés dans la peau des nouveau-nés O. bimaculoides utilisant des anticorps α- et -tubuline. Ces cellules étaient similaires en morphologie et en position (Sundermann-Meister, 1978 Sundermann, 1983 Mackie, 2008 Buresi et al., 2014) aux cellules décrites comme mécanorécepteurs chez les calmars et les seiches (Budelmann et Bleckmann, 1988 Bleckmann et al., 1991) . On ne sait pas encore si ces neurones sensoriels périphériques agissent comme des mécanorécepteurs dans la peau de O. bimaculoides. Curieusement, nous avons localisé l'expression de la r-opsine dans ces mêmes neurones sensoriels périphériques dans la peau des nouveau-nés, soulevant la possibilité qu'en plus d'une fonction mécanoréceptive, ces cellules sensorielles puissent également être des récepteurs de lumière dispersés chez les poulpes et autres céphalopodes. Malheureusement, les connexions précises entre les capteurs de lumière dispersés candidats dans la peau de poulpe, les chromatophores et le SNC restent floues, tout comme leurs relations avec LACE et méritent une enquête plus approfondie pour tester l'hypothèse selon laquelle les neurones exprimant la r-opsine détectent la lumière.

Notre découverte d'opsine exprimée dans des mécanorécepteurs connus soulève la question de savoir si l'opsine a un rôle dans la mécanoréception, en plus de son rôle bien établi dans la détection de la lumière. Bien que notre travail soit la première description de ce modèle d'expression de l'opsine chez les mollusques, des mécanorécepteurs exprimant l'opsine ont été récemment décrits chez l'annélide. Platynereis, poisson zèbre et Drosophile (Backfisch et al., 2013 Senthilan et al., 2012). Des travaux sur la mécanoréception en Drosophile antennes, nous savons maintenant que l'opsine est nécessaire aux mécanorécepteurs anténaux pour détecter les vibrations, mettant en évidence un rôle auparavant inconnu de l'opsine dans les sens en plus de la détection de la lumière (Senthilan et al., 2012). Nous ne savons pas encore si les cellules exprimant l'opsine que nous avons trouvées chez les nouveau-nés O. bimaculoides fonction de la peau en tant que mécanorécepteurs, capteurs de lumière ou les deux, ou dans quelle mesure l'opsine est nécessaire pour détecter l'un ou l'autre de ces stimuli. Néanmoins, nos résultats imposent de futures recherches sur le rôle des opsines dans des sens autres que la photoréception. Nous pensons que la propagation phylogénétique de l'expression de l'opsine dans les mécanorécepteurs chez les vertébrés, les annélides, les arthropodes et maintenant les mollusques, suggère que de tels rôles mécano-sensoriels pour l'opsine pourraient être anciens chez les animaux.

Enfin, découvrir la sensibilité à la lumière dispersée dans la peau de poulpe soulève la question de savoir comment elle a évolué pour sous-tendre LACE chez les poulpes. Notre étude est la meilleure preuve à ce jour de la peau sensible à la lumière chez les céphalopodes et nous émettons l'hypothèse que LACE peut jouer un rôle dans la modulation de la structuration corporelle pour le camouflage, aux côtés du contrôle canonique exercé par le SNC. Cependant, alors que les céphalopodes sont uniques parmi les mollusques pour leurs capacités à modeler le corps, nous savons que la plupart des autres mollusques, en particulier les bivalves, les gastéropodes et les chitons, sont capables de détecter la lumière avec leur peau. Il existe une littérature abondante décrivant des comportements tels que la phototaxie ou les réponses aux ombres et la physiologie liés à la détection de la lumière dans la peau d'autres mollusques (Ramirez et al., 2011). Nous ne savons pas encore si ou comment les céphalopodes utilisent leur peau sensible à la lumière pour ces autres comportements plus typiques des mollusques. Cependant, la distribution généralisée de la détection de la lumière dispersée et des comportements associés dans tout le phylum suggère que la sensibilité à la lumière dispersée pourrait être un trait ancestral des mollusques qui a été coopté dans la lignée des céphalopodes pour médier de nouveaux comportements de structure corporelle en réponse à la lumière. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la détection de la lumière dispersée dans les classes de mollusques aiderait à clarifier l'histoire évolutive de la détection de la lumière dispersée et les comportements associés. Notre étude fournit un cadre pour les futurs travaux comparatifs qui peuvent intégrer des données comportementales déjà connues avec des données moléculaires pour les composants de détection de la lumière dans divers mollusques. Ce travail pourrait aborder la question de savoir si divers comportements de mollusques qui reposent sur la détection de la lumière dispersée partagent un mécanisme moléculaire commun pour la détection de la lumière, et donc si la détection de la lumière dispersée était présente chez les mollusques ancestraux.


Conclusion

La PDT est une forme efficace de traitement pour un nombre croissant d'affections humaines, allant du cancer à plusieurs affections cutanées. Les avantages découlant de l'utilisation de la lumière sont connus depuis l'Antiquité, mais ce n'est que dans les dernières décennies du XXe siècle que nous avons assisté à l'expansion rapide des connaissances et des techniques. Les améliorations récentes de la thérapie sont liées en particulier aux systèmes de développement et d'administration des photosensibilisateurs.De nos jours, l'utilisation d'appareils à base de LED représente l'outil émergent et le plus sûr pour le traitement de nombreuses affections telles que les affections inflammatoires de la peau, le vieillissement et les troubles liés à la croissance des cheveux. Bien que l'utilisation de la LED dans le traitement des troubles capillaires soit désormais devenue une pratique courante, des études mieux contrôlées sont encore nécessaires pour corroborer son efficacité.